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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610079136.5 (22)申请日 2016.02.04 CCTCC NO: C201534 2015.04.23 C07C 233/22(2006.01) C07C 231/02(2006.01) C07K 14/765(2006.01) C07K 14/77(2006.01) C07K 14/795(2006.01) C07K 16/44(2006.01) C07K 16/06(2006.01) (71)申请人 中国农业科学院油料作物研究所 地址 430062 湖北省武汉市武昌区徐东二路 2 号 (72)发明人 李培武 杨青。
2、青 张奇 马飞 张良晓 张文 唐晓倩 丁晓霞 (74)专利代理机构 湖北武汉永嘉专利代理有限 公司 42102 代理人 乔宇 (54) 发明名称 辣椒素类物质通用人工半抗原、 人工完全抗 原及其应用 (57) 摘要 本发明涉及辣椒素类物质通用人工半抗 原、 人工完全抗原及其应用。辣椒素类物质通 用人工半抗原化合物， 具有式所示的分子 结构 ： 辣 椒 素 类 物 质 通 用 人 工 完 全 抗 原 化 合 物，其 分 子 结 构 式 如 式 所 示 ： Pr 载体 蛋白。本发明的人工完全抗原可免疫获得亲和力 高， 灵敏度高， 特异性强的辣椒素抗体。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl.。
3、 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书8页 序列表2页 附图1页 CN 105541655 A 2016.05.04 CN 105541655 A 1.辣椒素类物质通用人工半抗原化合物， 其特征在于： 具有式 所示的分子结构： 其化学名称为4-(4-羟基-3-甲氧基)苄胺基-4-羰 基羧酸。 2.辣椒素类物质通用人工完全抗原化合物， 其特征在于： 其分子结构式如式所示： Pr载体蛋白。 3.根据权利要求2所述的辣椒素类物质通用人工完全抗原化合物， 其特征在于： 所述载 体蛋白为牛血清白蛋白BSA、 卵清白蛋白OVA或钥孔血蓝蛋白KLH。 4.权利要。
4、求1所述的辣椒素类物质通用人工半抗原化合物的合成方法， 其特征在于： 以 香兰素胺盐酸盐与丁二酸酐为原料， 在缚酸剂三乙胺的存在下， 经一步酰胺化反应合成人 工半抗原化合物， 合成路线如下： 。 5.根据权利要求4所述的辣椒素类物质通用人工半抗原化合物的合成方法， 其特征在 于： 包括以下步骤： 将摩尔比为1： (0.91.2)的香兰素胺盐酸盐和三乙胺溶于四氢呋喃中， 室温搅拌20-40min， 加入等摩尔量的丁二酸酐后继续室温搅拌反应7小时以上， 后处理得到 辣椒素类物质通用人工半抗原化合物 。 6.权利要求2所述的辣椒素类物质通用人工完全抗原化合物的制备方法， 其特征在于： 它是将辣椒素类。
5、物质通用人工半抗原通过N,N -二环己基碳二亚胺DCC与N-羟基琥珀酰亚 胺NHS活化， 再与载体蛋白进行偶联得到。 7.根据权利要求6所述的辣椒素类物质通用人工完全抗原化合物的制备方法， 其特征 在于： 包括以下具体步骤： (1)辣椒素类物质通用人工半抗原活化： 将辣椒素类物质通用人工半抗原在N,N-二甲 基甲酰胺中与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)室温反应30min-2h， 然后加入二环己基碳二亚胺的 N,N-二甲基甲酰胺溶液， 室温反应4-6小时， 4静置过夜， 取上清液即活化的辣椒素类物质 人工半抗原溶液， 所述N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和二环己基碳二亚胺的摩尔比为1:1-1.2； 或将。
6、辣椒素类物质人工半抗原溶解在N,N-二甲基甲酰胺中顺序加入三正丁胺和氯甲 酸异丁酯， 室温反应0.5-3h小时， 所得反应液即活化的辣椒素类物质人工半抗原溶液， 所述 三正丁胺和氯甲酸异丁酯的摩尔比为1:1-1.2； (2)将上述(1)所得活化的辣椒素类物质通用人工半抗原上清液滴加到载体蛋白浓度 权利要求书 1/2 页 2 CN 105541655 A 2 大于等于2mg/mL的载体蛋白的磷酸盐缓冲液中， 室温条件反应4-8h， 其中： 所述活化的辣椒 素类物质通用人工半抗原与载体蛋白的摩尔比大于10:1， 然后透析得到辣椒素类物质通用 人工完全抗原。 8.根据权利要求6所述的辣椒素类物质通用。
7、人工完全抗原化合物的制备方法， 其特征 在于： 所述的载体蛋白的磷酸盐缓冲液是将载体蛋白用0.2MpH8.0的磷酸盐缓冲液溶解 得到的。 9.权利要求1所述的辣椒素类物质通用人工完全抗原化合物在制备辣椒素类物质特异 性抗体中的应用。 10.根据权利要求9所述的应用， 其特征在于： 应用方法为： 将上述辣椒素类物质通用人 工完全抗原免疫日本大耳兔， 免疫4-6次后， 兔颈动脉采血至其死亡， 采到的血液离心后， 将 抗血清利用辛酸-硫酸铵法进行纯化， 得到辣椒素类物质通用抗体， 即可与辣椒素类物质发 生特异性免疫反应的球蛋白。 权利要求书 2/2 页 3 CN 105541655 A 3 辣椒素类。
8、物质通用人工半抗原、 人工完全抗原及其应用 技术领域 0001 本发明涉及辣椒素类物质通用人工半抗原、 人工完全抗原及其应用， 属于免疫化 学技术领域。 背景技术 0002 辣椒素类化合物是存在于辣椒果实中的使其具有辛辣刺激的主要化学物质， 主要 包括辣椒素、 二氢辣椒素、 高二氢辣椒素、 降二氢辣椒素、 高辣椒素等二十多种已知的结构 类似的化合物。 其中辣椒素和二氢辣椒素约占辣椒素类物质总量的90， 并提供了约90 的辣热感刺激。 随着人民圣湖水平的提高， 辣椒素类物质的营养品质和药用价值逐渐被发 现。 辣椒素类物质除了被广泛应用于食品工业中， 还被用于医药保健、 生化材料、 生物武器 等领。
9、域。 在食品加工领域， 目前还没有一种简便、 有效且准确的方法， 来区分食品的辣味程 度分级。 合成辣椒素具有与天然辣椒素类物质类似的结构部和功能， 且在价格和辣度上比 天然辣椒素类物质更占优势， 常被用作辣椒素类物质的替代品。 因此， 食品中辣椒素类物质 的分析测定对辣椒产品的研发与标准化及其品质评价意义重大。 0003 目前， 高效液相色谱法、 色谱-质谱联用等现代仪器检测方法是辣椒素类物质最常 用的检测方法， 其灵敏度高、 准确性好， 但是仪器设备昂贵， 对实验环境要求高， 且要求专业 操作人员， 难以实现快速检测。 近年来迅速发展起来的免疫分析方法由于克服了上述方法 的缺点， 并具有特。
10、异性强、 灵敏度高、 分析容量大、 方便快捷、 成本低廉、 适于现场批量检测 等优点， 被广泛应用于医学、 农学等各个领域。 0004 免疫分析是基于抗原、 抗体的特异性识别反应的一种分析方法， 其核心试剂是高 质量的特异性抗体。 但是辣椒素类物质的分子量都低于500， 属于小分子物质， 本身不具有 免疫原性， 需要与大分子的载体蛋白进行偶联才能使其具备免疫原性。 因此， 要获得高质量 的特异性抗体， 首先要将辣椒素类物质与载体蛋白结合， 获得具有免疫原性的辣椒素类物 质通用人工完全抗原。 目前， 国内外鲜有针对辣椒素类物质通用人工完全抗原的报道。 因 此， 研制辣椒素类物质通用人工半抗原、 。
11、人工完全抗原不仅填补了辣椒素类物质免疫检测 的空白， 为辣椒素类物质的快速检测开辟新思路， 对实现辣椒素、 二氢辣椒素、 合成辣椒素 总量免疫定量检测具有重要意义。 发明内容 0005 本发明的发明目的是提供一种新型的辣椒素类物质通用人工半抗原、 人工完全抗 原及其应用。 0006 为解决上述技术问题， 本发明采用的技术方案为： 0007 本发明提供的辣椒素类物质通用人工半抗原化合物， 具有式 所示的分子结构： 说明书 1/8 页 4 CN 105541655 A 4 0008其化学名称为4-(4-羟基-3-甲氧基)苄胺基- 4-羰基羧酸(4-(4-hydroxy-3-methoxybenzy。
12、l)amino-4-oxobutanoicacid)。 0009 提供辣椒素类物质通用人工完全抗原化合物， 其分子结构式如式所示： Pr载体蛋白。 0010 按上述方案， 所述载体蛋白为牛血清白蛋白BSA、 卵清白蛋白OVA或钥孔血蓝蛋白 KLH。 0011 上述辣椒素类物质通用人工半抗原化合物的合成方法， 以香兰素胺盐酸盐与丁二 酸酐为原料， 在缚酸剂三乙胺的存在下， 经一步酰胺化反应合成人工半抗原化合物， 其结构 式即 所示， 合成路线如下： 0012。 0013 按上述方案， 所述辣椒素类物质人工半抗原化合物的合成方法， 包括以下步骤： 将 摩尔比为1： (0.91.2)的香兰素胺盐酸盐。
13、和三乙胺溶于四氢呋喃中， 室温搅拌20-40min， 加入等摩尔量的丁二酸酐后继续室温搅拌反应7小时以上， 后处理得到辣椒素类物质通用 人工半抗原化合物 。 按上述方案， 所述后处理为： 加入乙酸乙酯， 室温搅拌， 过滤后得白色 沉淀即为样品。 0014 上述辣椒素类物质通用人工完全抗原化合物的制备方法， 它是将辣椒素类物质通 用人工半抗原通过N,N -二环己基碳二亚胺DCC与N-羟基琥珀酰亚胺NHS活化， 再与载体蛋 白进行偶联得到。 0015 上述辣椒素类物质通用人工完全抗原化合物的制备方法， 包括以下具体步骤： 0016 (1)辣椒素类物质通用人工半抗原活化： 将辣椒素类物质通用人工半抗。
14、原在N,N- 二甲基甲酰胺中与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)室温反应30min-2h， 然后加入二环己基碳二亚 胺的N,N-二甲基甲酰胺溶液， 室温反应4-6小时， 4静置过夜， 取上清液即活化的辣椒素类 物质人工半抗原溶液， 所述N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和二环己基碳二亚胺的摩尔比为1:1- 1.2； 0017 或将辣椒素类物质人工半抗原溶解在N,N-二甲基甲酰胺中顺序加入三正丁胺和 氯甲酸异丁酯， 室温反应0.5-3h小时， 所得反应液即活化的辣椒素类物质人工半抗原溶液， 所述三正丁胺和氯甲酸异丁酯的摩尔比为1:1-1.2； 0018 (2)将上述(1)所得活化的辣椒素类物质通用人工半抗原。
15、上清液滴加到载体蛋白 说明书 2/8 页 5 CN 105541655 A 5 浓度大于等于2mg/mL的载体蛋白的磷酸盐缓冲液中， 室温条件反应4-8h， 其中： 所述活化的 辣椒素类物质通用人工半抗原与载体蛋白的摩尔比大于10:1， 然后透析得到辣椒素类物质 通用人工完全抗原。 0019 按上述方案， 所述的载体蛋白的磷酸盐缓冲液是将载体蛋白用0.2MpH8.0的磷酸 盐缓冲液溶解得到的。 0020 按上述方案， 所述的透析为用0.01MPBS缓冲液透析72h， 期间， 4-8h更换一次透析 液。 0021 上述辣椒素类物质通用人工完全抗原化合物在制备辣椒素类物质特异性抗体中 的应用。 应。
16、用方法为： 将上述辣椒素类物质通用人工完全抗原免疫日本大耳兔， 免疫4-6次 后， 兔颈动脉采血至其死亡， 采到的血液离心后， 将抗血清利用辛酸-硫酸铵法进行纯化， 得 到辣椒素类物质通用抗体， 即可与辣椒素类物质发生特异性免疫反应的球蛋白。 0022 本发明的有益效果在于： 0023 本发明通过将辣椒素中香草基胺的酚羟基进行修饰， 提供的人工半抗原既最大程 度保留了辣椒素类物质的特征结构(辣椒素主要分子结构中的香草基胺和部分脂肪链基 团)， 可作为抗原决定簇， 又具有可以与载体蛋白发生偶联的活性基团。 进而可免疫获得亲 和力高， 灵敏度高， 特异性强的辣椒素抗体。 实验结果表明， 用本发明提。
17、供的抗原免疫动物 得到的抗血清效价可达128000， 得到的抗体对辣椒素类物质的半抑制浓度IC50值为0.7 g/ mL， 对辣椒素、 二氢辣椒素、 合成辣椒素的50抑制浓度IC50依次为1.1 g/mL、 0.5 g/mL、 1.8 g/mL， 表明该抗血清可以特异性与辣椒素类物质反应， 并可以作为辣椒素类物质通用抗 体。 本发明的抗原或抗体可用于建立酶联免疫吸附分析方法、 胶体金试纸快速检测法和时 间分辨荧光试纸条检测法， 为食品辣味的标准化管理提供关键技术支撑。 附图说明： 0024 图1为本发明合成的辣椒素类物质通用人工完全抗原紫外光谱图。 0025 图2本发明合成的辣椒素类物质通用人。
18、工完全抗原-包被抗原紫外光谱图。 具体实施方式 0026 下述实例中所使用的试验方法， 如无特殊说明， 均为常规方法。 0027 下述实例中所使用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。 0028 实施例1辣椒素类物质通用人工半抗原的制备 0029 称取香兰素胺盐酸盐0.28g溶于6ml四氢呋喃， 搅拌滴加0.15g三乙胺， 室温搅拌 30min。 准确称取丁二酸酐0.15g(0.0015mol)加入上述反应液中， 室温搅拌过夜。 向反应液 中加入3mL乙酸乙酯室温搅拌2min， 过滤后所得沉淀即为半抗原为4-(4-羟基-3-甲氧基) 苄胺基-4-羰基羧酸(4-(4-hydro。
19、xy-3-methoxybenzyl)amino-4-oxobutanoicacid)， 分子式为C12H15NO5。 0030 经核磁鉴定结果为： 1HNMR(400MHz,DMSO) 12.17(s,1H),8.87(s,1H),8.31(d,J 6.0Hz,1H),4.21(d,J5.8Hz,2H),3.80(s,3H),2.52(t,J6.9Hz,2H),2.42(t,J 6 .7 H z ,2 H ) 。 与 其 结 果 的 理 论 值 一 致 ， 表 明 该 半 抗 原 化 合 物 成 功 合 成 。 说明书 3/8 页 6 CN 105541655 A 6 0031 实施例2辣椒。
20、素类物质通用人工完全抗原-免疫抗原的制备 0032 称取上述辣椒素类物质通用人工半抗原20 .3mg(约0 .08mmol)和11 .6mg(约 0.1mmol)NHS于反应瓶中， 加入400ulDMF溶解于反应瓶中， 室温搅拌30min， 称取20.6mg(约 0.1mmol)DCC溶于100ulDMF中， 将DCC/DMF溶液逐滴滴加至上述反应瓶， 室温搅拌4h， 4静 置过夜。 8000rpm/5min， 取上清活泼酯液。 0033 将上清活泼酯液， 逐滴滴加到6ml7mg/ml的BSA溶液中反应， 反应缓冲液为0.2M pH8.0的磷酸盐缓冲液。 反应在磁力搅拌下室温进行4h。 将反应。
21、液置透析袋内， 用0.01M pH7.4的PBS中4搅拌透析， 每4h更换一次透析液， 共透析72h。 即得到辣椒素人工抗原-免 疫抗原。 紫外-可见光谱连续扫描图谱见图1， 鉴定结果表明人工抗原偶联成功。 0034 实施例3辣椒素类物质通用人工完全抗原-包被抗原的制备 0035 称上述辣椒素类物质通用人工半抗原4.55mg溶于200 L无水DMF中,然后按顺序加 入4.27 L三正丁胺、 2.34 L氯甲酸异丁酯,室温下搅拌避光反应1h， 得活化的辣椒素类物质 半抗原溶液。 0036 将活化的辣椒素类物质半抗原溶液逐滴滴加到10ml4.5mg/ml的OVA溶液中反应， 反应缓冲液为0.2Mp。
22、H8.0的磷酸盐缓冲液。 反应在磁力搅拌下室温进行4h。 将反应液置透 析袋内， 用0.01MpH7.4的PBS中4搅拌透析， 每4h更换一次透析液， 共透析72h。 即得到辣 椒素人工抗原-包被抗原。 紫外-可见光谱连续扫描图谱见图2， 鉴定结果表明人工抗原偶联 成功。 0037 实施例4： 辣椒素类物质通用特异性抗体的制备 0038 将上述实施例2制备好的辣椒素类物质人工完全抗原(免疫抗原)用来免疫3以 上的日本大耳兔。 平均每次抗原用量约0.54mg(以载体蛋白的量计)。 首次免疫采用由等体 积的弗氏完全佐剂乳化的免疫原， 于兔皮下多点注射； 首免后间隔3周、 以后每隔2周用由等 体积的。
23、弗氏不完全佐剂乳化的免疫原， 于兔背部皮下多点注射。 从第四次开始， 每次免疫后 一周， 兔耳缘静脉采血非竞争间接ELISA方法测定血清效价。 五免后， 兔颈动脉采血至其死 亡。 采到的血液于37放置约1h， 4过夜， 离心， 取上清， 少量混等体积甘油-20暂时储存 备用。 其余抗血清利用辛酸-硫酸铵法进行纯化， 最后得冻干抗体， 于-20储存备用。 0039 实施例5： 辣椒素类物质通用特异性抗体的测定 0040 1)采用间接非竞争ELISA方法检测辣椒素类物质通用特异性抗体效价 0041 包被： 辣椒素类物质通用人工完全抗原-包被抗原用0.1mol/LpH9.6碳酸盐缓冲 液稀释到1 g。
24、/mL， 100 l/孔， 4反应过夜。 倾去包被液， PBST满孔洗涤3次， 扣干。 0042 封闭： 1OVAPBST溶液， 200 L/孔， 37温育1h， PBST满孔洗涤3次， 扣干。 0043 抗体抗原特异性反应： 将辣椒素类物质通用特异性抗体用0.01MPH7.4的磷酸缓 冲液配制成1mg/mL的溶液， 然后将抗体溶液从1:10000开始倍比稀释， 并加入到各稀释度的 包被孔中， 加入量为100 L/孔， 设置阴性和空白对照孔， 阴性对照血清稀释2000倍， 空白只 说明书 4/8 页 7 CN 105541655 A 7 加PBST， 37温育1h， PBST满孔洗涤3次， 扣。
25、干； 0044 加二抗： 用PBST溶液将羊抗鼠酶标二抗5000倍稀释， 混匀， 加入量为100 L/孔， 37 温育1h， PBST满孔洗涤6次， 扣干。 0045 显色： 显色液(含1mg/mL四甲基联苯胺0.5mL、 柠檬酸缓冲液9.5mL、 1的过氧化氢 脲32 L)现配现用， 100 L/孔， 避光37温育15min。 0046 终止： 2mol/L的H2SO4， 50 L/孔， 立即用酶标仪测定450nm处吸光值即OD450值。 0047 结果判读： 以OD450值大于或等于1时所对应的抗体溶液的最高稀释倍数为抗体的 ELISA效价， 为128000。 0048 2)采用间接竞争E。
26、LISA方法检测辣椒素类物质通用特异性抗体对辣椒素的半抑制 浓度 0049 (1)用上述的间接ELISA方法确定抗体的工作浓度， 以OD450为1左右时所对应的抗 体浓度为最适工作浓度。 0050 (2)包被、 洗涤和封闭： 方法操作同间接非竞争ELISA法。 0051 (3)配制辣椒素标准溶液： 将辣椒素用甲醇溶液配制成10mg/ml的母液。 加样前， 采 用10的甲醇/PBS(0.01mol/LpH7.4)溶液从200 g/mL开始3倍稀释， 共稀释9个浓度。 每孔 加入50 L倍比稀释的辣椒素类物质标准溶液， 然后每孔再加入50 L稀释倍数为160000的抗 血清， 37反应1h。 00。
27、52 (4)加二抗、 显色、 终止和读数： 方法操作同间接非竞争ELISA法。 0053 (5)数据处理： 以辣椒素各浓度的对数为横坐标， 辣椒素各浓度对应的OD值为纵坐 标， 绘制标准曲线， 计算50抑制浓度为1.1 g/mL。 0054 3)采用间接竞争ELISA方法检测辣椒素类物质通用特异性抗体对二氢辣椒素的半 抑制浓度 0055 (1)用上述的间接ELISA方法确定抗体的工作浓度， 以OD450为1左右时所对应的抗 体浓度为最适工作浓度。 0056 (2)包被、 洗涤和封闭： 方法操作同间接非竞争ELISA法。 0057 (3)配制辣椒素标准溶液： 将二氢辣椒素用甲醇溶液配制成10mg。
28、/ml的母液。 加样 前， 采用10的甲醇/PBS(0.01mol/LpH7.4)溶液从200 g/mL开始3倍稀释， 共稀释9个浓 度。 每孔加入50 L倍比稀释的二氢辣椒素类物质标准溶液， 然后每孔再加入50 L稀释倍数 为160000的抗血清， 37反应1h。 0058 (4)加二抗、 显色、 终止和读数： 方法操作同间接非竞争ELISA法。 0059 (5)数据处理： 以二氢辣椒素各浓度的对数为横坐标， 二氢辣椒素各浓度对应的OD 值为纵坐标， 绘制标准曲线， 计算50抑制浓度为0.5 g/mL。 0060 4)采用间接竞争ELISA方法检测辣椒素类物质通用特异性抗体对合成辣椒素的半 。
29、抑制浓度 0061 (1)用上述的间接ELISA方法确定抗体的工作浓度， 以OD450为1左右时所对应的抗 体浓度为最适工作浓度。 0062 (2)包被、 洗涤和封闭： 方法操作同间接非竞争ELISA法。 0063 (3)配制辣椒素标准溶液： 将合成辣椒素用甲醇溶液配制成10mg/ml的母液。 加样 前， 采用10的甲醇/PBS(0.01mol/LpH7.4)溶液从200 g/mL开始3倍稀释， 共稀释9个浓 说明书 5/8 页 8 CN 105541655 A 8 度。 每孔加入50 L倍比稀释的合成辣椒素类物质标准溶液， 然后每孔再加入50 L稀释倍数 为160000的抗血清， 37反应1。
30、h。 0064 (4)加二抗、 显色、 终止和读数： 方法操作同间接非竞争ELISA法。 0065 (5)数据处理： 以合成辣椒素各浓度的对数为横坐标， 合成辣椒素各浓度对应的OD 值为纵坐标， 绘制标准曲线， 计算50抑制浓度为1.8 g/mL。 0066 5)采用间接竞争ELISA方法检测辣椒素类物质通用特异性抗体半抑制浓度 0067 (1)用上述的间接ELISA方法确定抗体的工作浓度， 以OD450为1左右时所对应的抗 体浓度为最适工作浓度。 0068 (2)包被、 洗涤和封闭： 方法操作同间接非竞争ELISA法。 0069 (3)配制辣椒素标准溶液： 将辣椒素类物质用甲醇溶液配制成10。
31、mg/ml的母液(其 中辣椒素、 二氢辣椒素和合成辣椒素的比例为1:1:1)。 加样前， 采用10的甲醇/PBS (0.01mol/LpH7.4)溶液从200 g/mL开始3倍稀释， 共稀释9个浓度。 每孔加入50 L倍比稀释 的辣椒素类物质标准溶液， 然后每孔再加入50 L稀释倍数为160000的抗血清， 37反应1h。 0070 (4)加二抗、 显色、 终止和读数： 方法操作同间接非竞争ELISA法。 0071 (5)数据处理： 以辣椒素类物质各浓度的对数为横坐标， 辣椒素类物质各浓度对应 的OD值为纵坐标， 绘制标准曲线， 计算50抑制浓度为0.7 g/mL。 0072 综上， 上述辣椒。
32、素类物质通用人工半抗原、 人工抗原是可以制备出亲和力高， 灵敏 度高的辣椒素特异性抗体。 0073 实施例6 0074 a杂交瘤细胞株YQQD8的制备 0075 1.动物免疫 0076 购买7周龄BALB/c小鼠5只， 免疫上述辣椒素类物质人工抗原-免疫抗原。 第一次免 疫将免疫抗原与等体积快免佐剂QuickAntibody-Mouse5W(购自北京博奥龙生物技术有限 公司)迅速混匀后， 于小鼠后腿小腿肌肉注射免疫小鼠。 第21天、 42天分别按同样方式加强 免疫。 3次免疫所用免疫抗原的剂量相同， 均为每鼠12.5 g。 每次免疫后8天， 尾静脉采血， 分 离血清， 采用间接ELISA法监测。
33、小鼠血清效价。 第3次免疫后8天， 尾静脉采血， 分离血清， 采 用间接ELISA法监测小鼠血清效价， 并用间接竞争ELISA法测定小鼠血清灵敏度， 选择效价、 灵敏度均相对较高的血清对应的小鼠进行最后一次加强免疫， 加强免疫时， 采用小鼠腹腔 注射峰方式， 免疫抗原的用量为之前的2倍， 不需要用佐剂混合。 0077 2.细胞融合 0078 于最后一次加强免疫3天后， 采用50(重量百分数)的聚乙二醇即PEG(分子量为 1500)作融合剂， 按常规方法进行细胞融合， 具体步骤： 无菌条件下杀死免疫小鼠， 分离脾细 胞， 与鼠源骨髓瘤细胞SP2/0以约5-10 1的个数比混合， 用RPMI-16。
34、40基础培养液洗混合细 胞， 用50PEG融合， 融合1分钟， 然后加满RPMI-1640基础培养液， 离心， 移去上清， 用 72mLRPMI-1640完全培养液将小鼠脾细胞和鼠源骨髓瘤细胞SP2/0形成的融合细胞重悬， 将 重悬细胞滴加到96孔细胞培养板内， 2滴/孔， 置37二氧化碳培养箱培养， 所述的RPMI- 1640完全培养液含有20(体积百分数)胎牛血清， 10(体积百分数)Clone培养基 和1(重量百分数)次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷即HAT； 半固体RPMI-1640完全培养 基是指， 在RPMI-1640完全培养液中加入1(质量百分数)的甲基纤维素。 上述SP2/0购。
35、于上 说明书 6/8 页 9 CN 105541655 A 9 海泛柯生物科技有限公司； Clone培养基购于北京博奥龙免疫技术有限公司； RPMI- 1640基础培养液购于Hyclone公司； 1次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷即HAT购于 Sigma-Aldrich公司。 0079 3.细胞株的筛选及克隆 0080 待96孔板上的细胞集落长到占孔底1/2大小， 培养液变黄， 即可进行抗体检测。 采 用ELISA方法对有杂交瘤细胞生长的培养孔进行筛选， 筛选分两步进行， 第一步采用间接 ELISA法筛选出抗辣椒素而不抗载体蛋白BSA的阳性孔； 第二步采用间接竞争ELISA法对第 一步筛选出的。
36、阳性孔进行检测， 用辣椒素作为竞争原， 与固定在ELISA板上的抗原竞争性的 结合上清中的抗体， 其中与辣椒素结合的抗体将会在之后的步骤被洗掉， 与包被抗原结合 的抗体则被固定在ELISA板上， 加入HRP标记的羊抗鼠抗体及显色液后则会显色。 竞争原辣 椒素浓度越高， 显色越浅， 450nm处的吸光度值越低。 选择未加竞争原时吸光值较高和灵敏 度均较高的孔(此处吸光值较高指， 竞争原为0的孔所测得吸光值， 灵敏度较高指抑制率为 50时的竞争原浓度IC50值较小)。 采用半固体培养基进行亚克隆细胞的培养， 克隆后待细 胞集落长至肉眼可见大小时， 分别将每个细胞集落挑至液体培养基中， 采用同样的两。
37、步筛 选法进行检测， 如此重复克隆1次后， 最终筛选获得杂交瘤细胞株YQQD8。 该细胞株YQQD8已 于2015年4月23日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)， 保藏地址是， 中国， 武汉， 武汉 大学， 保藏编号为CCTCCNO.C201534， 分类命名为杂交瘤细胞株YQQD8。 0081 b抗辣椒素、 二氢辣椒素、 合成辣椒素通用单克隆抗体杂交瘤细胞株系YQQD8抗体 可变区序列测定 0082 (1)提取总RNA： 采用天根公司的总RNA提取试剂盒并按照说明书提取可产生杂交 瘤细胞株系YQQD8的总RNA； 0083 ( 2 )合成cDNA： 以步骤1获得的总RNA为模板， o。
38、ligo( dT )15为引物， 按照 SuperScriptTM-2反转录酶说明书进行反转录， 合成cDNA第一链； 引物oligo(dT)15由 Invitrogen购得； 0084 (3)PCR法克隆可变区基因： 根据GENEBANK中小鼠抗体基因序列的保守位点设计引 物， 以cDNA为模版扩增抗体轻、 重链可变区基因。 PCR程序为： 9430s、 5545s、 721min， 扩增30个循环， 最后72延伸10min。 PCR产物经过1(重量百分数)的琼脂糖凝胶电泳分离 后， 用试剂盒纯化回收DNA片段， 连接到载体pMD18-T中， 转化大肠杆菌DH5 感受态细胞， 挑 取阳性克隆。
39、， 送至上海桑尼生物科技有限公司进行测序。 其中引物的序列分别为： 重链可变 区引物为5， -GAVGTGAWGSTGGTGGAGTC-3， (20mer)和5， -GAGGAGACGGTGACTGAG GT-3， (20mer)其中S、 R和W为简并碱基， MA/C， RA/G， SC/G， WA/T， 轻链可变区引物为 5， -RTTKTGATGACCCARAC-3， (17mer)和5， -ACGTTTKATTTCCAGCTTGG-3， (20mer)。 0085 得到的基因序列结果： 重链可变区编码基因序列长313bp， 序列如SEQIDNO:1所 示， 根据所获得的基因序列推导出该基。
40、因序列所编码的重链可变区由104个氨基酸组成， 序 列如SEQIDNO:3所示。 轻链可变区编码基因序列长299bp， 序列如SEQIDNO:2所示， 根据 所获得的基因序列推导出该基因序列所编码的轻链可变区由99个氨基酸组成， 序列如SEQ IDNO:4所示。 0086 c抗辣椒素、 二氢辣椒素、 合成辣椒素通用单克隆抗体的制备纯化、 亚型和特性鉴 定 说明书 7/8 页 10 CN 105541655 A 10 0087 将实施例2获得的抗辣椒素、 二氢辣椒素、 合成辣椒素通用单克隆抗体杂交瘤细胞 株系YQQD8注射预先用福氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠， 收集该小鼠的腹水， 采用辛。
41、 酸-硫酸铵法纯化抗体， 具体操作为： 用双层滤纸过滤小鼠腹水， 4， 12000r/min离心 15min， 吸取上清， 将所得腹水上清与3倍体积的醋酸盐缓冲液混合， 用2mol/L的盐酸溶液调 节该混合液的pH值至4.7， 搅拌下缓慢加入正辛酸， 每毫升腹水所需的正辛酸体积为33 L， 室温混合30min， 4静置2h， 然后4， 12000r/min离心30min， 弃沉淀， 将得到的上清液用双 层滤纸过滤后， 加入1/10滤液体积的摩尔浓度为0.1mol/L和pH值为7.4的磷酸盐缓冲液， 用 2mol/L的氢氧化钠溶液调节该混合液的pH值至7.4， 4预冷， 缓慢加入硫酸铵至硫酸铵终。
42、 浓度为0.277g/mL， 4静置2h， 然后4， 12000r/min离心30min， 弃上清， 将所得沉淀用原腹 水体积1/10的0.01mol/L磷酸盐缓冲液重悬， 装入透析袋， 对0.01mol/L磷酸盐缓冲液透析， 将充分透析好的蛋白溶液置-70冰箱冷冻， 之后用冷冻干燥机冻干， 收集冻干粉， 即得纯 化好的抗辣椒素、 二氢辣椒素、 合成辣椒素通用单克隆抗体， 将抗体置-20冰箱中备用； 所 述的醋酸盐缓冲液为0.29g醋酸钠， 0.141mL醋酸加水定容至100mL所得； 所述的0.1mol/L的 磷酸盐缓冲液为0.8g氯化钠， 0.29g十二水磷酸氢二钠， 0.02g氯化钾， 。
43、磷酸二氢钾0.02g， 加 水定容至100mL所得。 0088 用市售亚型鉴定试剂盒鉴定杂交瘤细胞株YQQD8分泌的抗辣椒素、 二氢辣椒素、 合 成辣椒素通用单克隆抗体的亚型为IgG1。 0089 用常规非竞争酶联免疫吸附分析(ELISA)法测得YQQD8的鼠腹水抗体的效价可达 2.56106， 即鼠腹水抗体稀释2.56106倍时的溶液测定结果为阳性。 用常规间接竞争 ELISA法鉴定其对辣椒素、 二氢辣椒素、 合成辣椒素的50抑制浓度IC50依次为8.5ng/mL、 5.0ng/mL、 13.5ng/mL， 对辣椒素、 二氢辣椒素、 合成辣椒素的交叉反应率范围为62.9- 170。 说明书 8/8 页 11 CN 105541655 A 11 0001 序列表 1/2 页 12 CN 105541655 A 12 0002 序列表 2/2 页 13 CN 105541655 A 13 图1 图2 说明书附图 1/1 页 14 CN 105541655 A 14 。