一种全人源化抗VEGFR-2单克隆抗体及其制备方法.pdf

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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410655243.9 (22)申请日 2014.11.17 C07K 16/30(2006.01) A61K 39/395(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (71)申请人 四川科伦药物研究院有限公司 地址 611138 四川省成都市温江区海峡两岸 科技产业开发园新华大道二段 (72)发明人 薛彤彤 李明雄 杨秋艳 刘立平 闫岩 王利春 王晶翼 (54) 发明名称 一种全人源化抗 VEGFR-2 单克隆抗体及其制 备方法 (57) 摘要 本发明公开了一种全人源化抗 VEGFR-2 的 单克隆抗体， 并同时公。

2、开了采用噬菌体抗体库 技术筛选并利用基因工程方法制备所述新型抗 VEGFR-2 的单克隆抗体或其片段的方法。所述抗 体可以是单价抗体或二价抗体。所述抗体可以同 时阻断 VEGF-A， VEGF-C， VEGF-D 和 VEGF-E 的作 用， 因而具有更有效的抗血管生成效果， 所述抗体 可应用于治疗由肿瘤新生血管生成引起的疾病 ； 所述的疾病包括但不局限于下列肿瘤 ： 胃癌及食 管胃交界腺癌、 非小细胞肺癌、 转移性非小细胞肺 癌、 肝细胞癌、 转移性肝细胞癌、 HER2 阴性的转移 性乳腺癌、 转移性结直肠癌、 转移性黑色素瘤、 转 移性肾细胞癌、 胶质母细胞瘤、 卵巢癌、 前列腺癌、 实体。

3、肿瘤。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书11页 序列表8页 附图3页 CN 105646710 A 2016.06.08 CN 105646710 A 1/1 页 2 1.一种全人源化抗 VEGFR-2 单克隆抗体或其片段， 其特征在于， 所述单克隆抗体或其 片段的蛋白序列如下所示 ： 1)重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO ： 7所示， 轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO ： 1 所示 ； 或 2) 重链可变区的氨基酸序列如 SEQ ID NO ： 7 所示， 轻链可变区的氨基酸序列如 SEQ ID N。

4、O ： 2 所示 ； 或 3) 重链可变区的氨基酸序列如 SEQ ID NO ： 7 所示， 轻链可变区的氨基酸序列如 SEQ ID NO ： 3 所示 ； 或 4) 重链可变区的氨基酸序列如 SEQ ID NO ： 7 所示， 轻链可变区的氨基酸序列如 SEQ ID NO ： 4 所示 ； 或 5) 重链可变区的氨基酸序列如 SEQ ID NO ： 7 所示， 轻链可变区的氨基酸序列如 SEQ ID NO ： 5 所示 ； 或 6) 重链可变区的氨基酸序列如 SEQ ID NO ： 7 所示， 轻链可变区的氨基酸序列如 SEQ ID NO ： 6 所示。 2.根据权利要求 1 所述的单克隆抗。

5、体或其片段， 其特征在于， 所述的单克隆抗体包括 可变区和恒定区， 所述恒定区包括轻链恒定区和重链恒定区， 所述重链恒定区为人 IgG1、 IgG2、 IgG3 或 IgG4 的任意一种， 优选为人 IgG1。 3.根据权利要求 2 所述单克隆抗体或其片段 , 其特征在于， 轻链恒定区的氨基酸序列 如 SEQ ID NO ： 8 ； 重链恒定区的氨基酸序列如 SEQ ID NO ： 9 所示。 4.根据权利要求 1-3 所述单克隆抗体或其片段， 其特征在于， 所述单克隆抗体的片段 包括单链抗体 scFv、 Fab、 F(ab )2、 scfv-FC 的形式。 5.一种制备权利要求 4 所述单克。

6、隆抗体或其片段的方法， 所述方法为使用编码所述单 克隆抗体或其片段的 DNA 表达载体转染宿主细胞， 获得含有所述单克隆抗体或其片段的细 胞培养上清液， 并经纯化制备目的蛋白。 6.一种药物组合物， 其特征在于， 所述药物组合物含有权利要求 1-4 中任一项所述的 单克隆抗体或其片段以及一种或几种药学上可接受的缓冲剂或表面活性剂。 7.根据权利要求 6 所述的药物组合物， 其特征在于， 所述药物组合物通过注射剂的方 式施用 ； 所述注射剂通过腹膜内注射、 皮下注射、 肌肉注射或静脉注射的方式施用。 8.一种药物组合物， 其特征在于， 所述药物组合物含有权利要求 1-4 中任一项所述的 单克隆抗。

7、体或其片段以及一种或几种药学上可接受的可增大皮下组织间隙实现皮下注射 给药的物质。 9.根据权利要求 8 所述药物组合物 , 其特征在于， 所述可增大皮下组织间隙实现皮下 注射给药的物质优选为透明质酸酶。 10.权利要求 1-3 中任一项的单克隆抗体或其片段在制备治疗由肿瘤新生血管生成引 起的疾病的药物中的应用， 其特征在于， 所述的疾病包括但不局限于下列肿瘤 ： 胃癌及食管 胃交界腺癌、 非小细胞肺癌、 转移性非小细胞肺癌、 肝细胞癌、 转移性肝细胞癌、 HER2 阴性 的转移性乳腺癌、 转移性结直肠癌、 转移性黑色素瘤、 转移性肾细胞癌、 胶质母细胞瘤、 卵巢 癌、 前列腺癌、 实体肿瘤。。

8、 权 利 要 求 书 CN 105646710 A 2 1/11 页 3 一种全人源化抗 VEGFR-2 单克隆抗体及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及一种新型的全人源化抗 VEGFR-2 的单克隆抗体及其制备方法与用途， 属于生物工程技术领域。 背景技术 0002 肿瘤的形成需要周围正常基质、 血液成分及淋巴管的支持， 新血管的形成是肿 瘤生长、 侵袭和转移所必须的， 研究表明， VEGF 及其受体家族在这一过程中扮演非常重 要的角色。已被鉴定的 VEGF 受体为 VEGFR-1(Flt-1， fms 样酪氨酸激酶 )， VEGFR-2( 又 称 为 KDR/Flk-1， 激 酶 插。

9、 入 嵌 合 受 体、 胎 肝 激 酶 -1)， VEGFR-3(Flt-4)， 神 经 纤 维 蛋 白 -1(neuropilin-1)， 神经纤维蛋白 -2。人 VEGF 受体 2(VEGFR-2)， 又称为 KDR(kinase insert domain-containing receptor， KDR) 是 VEGF 的主要信号传导受体， 其参与新生血 管内皮细胞的迁移、 增殖、 生存， 在肿瘤周围血管新生过程中具有重要的作用。因此， 抑制 VEGF/VEGFR-2 途径是抑制肿瘤转移及生长的重要途径。 0003 研究发现， 肿瘤血管周围 VEGFR-2 的表达量与普通血管比较大 3。

10、-5 倍。普遍公认， VEGFR2 具有促进细胞有丝分裂、 血管形成及增加 VEGF 因子血管通透性的作用。除内皮细 胞内的表达外， 在一些肿瘤细胞表面也观察到 VEGFR-2 的过度表达 ( 如卵巢癌、 黑色素瘤、 非霍奇金淋巴瘤、 结肠癌及骨髓增生异常综合症的白血病前体细胞 )， 在健康的细胞中不表 达。因此， 相比较以 VEGF 为靶点， 直接靶向肿瘤相关内皮细胞过量表达 VEGFR-2 抗体更有 效低害。抗 VEGFR-2 抗体可以阻断多种 VEGF 配体对于受体的作用， 而抗 VEGF 抗体可能仅 对某种 VEGF 配体特异性作用， 而对其他多种配体无效。同时因血管内皮细胞与血液直接。

11、接 触， 使药物更加容易到达作用位点。 0004 噬菌体抗体库技术是在噬菌体展示基础上发展起来的， 是迄今为止发展最成熟、 应用最广泛的抗体库技术。 使用该技术已经陆续构建成功免疫抗体库、 天然抗体库、 半合成 抗体库和全合成抗体库， 也用于筛选出高特异的功能性抗体和改进抗体的品质。噬菌体抗 体库技术基本路线为用 RT-PCR 方法扩增抗体全套可变区基因， 重组到噬菌体载体中， 并通 过与丝状噬菌体的外壳蛋白形成融合蛋白， 把 Fab 段或 ScFv 表达到噬菌体表面。通过 “吸 附洗脱扩增” 的富集过程， 从中筛选出特异性抗体的可变区基因。经研究发现， 外源蛋 白在 P 和 P 蛋白的 N 。

12、末端融合表达不会影响噬菌体的完整性和活性。按照展示在噬菌 体颗粒表面的抗体片段种类的不同， 噬菌体抗体库主要有 scFv 抗体库和 Fab 抗体库两种。 Fab 抗体仅包括 VHCH1 和 VK CK( 或 VL CL)， scFv 是抗体的 VH 和 VK( 或 VL) 通过 linker 连 接成的小分子抗体。 Fab和scFv分子小， 结构简单， 易于穿过组织， 表达效率高， 有利于肿瘤 等疾病的治疗。但这两种形式也分别具有各自的特点 ： ScFv 具有分子小， 肿瘤穿透力高的 优点， Fab 含有两条链， 具有难组装、 产量低的缺点 ； scFv 的主要问题是易于形成二聚体， 但 是较。

13、易合成， 耐受性好。 0005 噬菌体抗体库模拟了天然抗体库， 使得人们可以不经过复杂的免疫过程， 而是直 接利用抗原就可以从抗体库中筛选出特异性抗体成为可能。它既解决了人源性单抗的来 说 明 书 CN 105646710 A 3 2/11 页 4 源困难、 人体杂交瘤系统的低效及鼠单抗的动物源性等难题， 也使得单克隆抗体的制备变 得简单易行， 稳定有效， 使人单克隆抗体的制备有了突破。 该技术主要特点包括以下几个方 面 ： 0006 1) 该技术不经免疫， 绕过杂交瘤技术， 省时省力， 省去了细胞融合的步骤， 避免了 因杂交瘤不稳定而需要反复亚克隆的繁琐程序。 0007 2) 扩大了筛选容量。

14、， 模拟天然全套抗体库， 抗体文库可以达到或超过 1011库容， 所 以能包含 B 细胞全部克隆。使用的通用引物采自多个人体， 具有人的种属普遍性。抗体的 VH 和 VL 基因的随机重组也增加了抗体的多样性。 0008 3) 可获得高亲和力的人源化抗体在噬菌体抗体库技术中， VH 和 VL 基因的随机重 组模拟了体内抗体亲和力成熟的过程， 所用的抗体基因又来自人体， 因此， 所产生的抗体必 然都是高亲和力的人源化抗体。 0009 研究表明， 血管内皮生长因子(VEGF)与血管内皮生长因子受体(VEGFR)的结合是 触发血管生成的关键步骤。VEGF 共有 A、 B、 C、 D、 E 五种不同的同。

15、形体 (isoform)。VEGFR 共 有 1、 2、 3 三种不同的同形体。阻断它们之间的结合则抑制肿瘤血管生成。Avastin 是一个 VEGF-A的单克隆抗体。 其作用机制是通过与VEGF-A结合， 特异性阻断其与受体VEGFR-1或 VEGFR-2 的结合来达到抑制血管生成的目的。作为 VEGF-A 的单克隆抗体， Avastin 只能阻 断 VEGF-A 的诱导血管生成作用， 而不能阻断 VEGF-C， VEGF-D 和 VEGF-E 的诱导血管生成作 用。 为了更好地抑制血管生成， 急需研发一种能同时阻断VEGF-A， VEGF-C， VEGF-D和VEGF-E 的作用的抗 VE。

16、GFR-2 抗体。 发明内容 0010 本发明的目的在于提供一种全人源化抗 VEGFR-2 的单克隆抗体或其片段， 编码该 单克隆抗体或其片段的多核苷酸的载体、 宿主细胞、 制备和纯化该抗体的方法及临床应用。 由本发明涉及的抗体基因可变区的序列， 可构建全长的抗体分子作为药物用于临床上由于 肿瘤新生血管生成所导致的适应症的使用。这些适应症包括但不局限于下列肿瘤 ： 胃癌及 食管胃交界腺癌、 非小细胞肺癌、 转移性非小细胞肺癌、 肝细胞癌、 转移性肝细胞癌、 HER2 阴 性的转移性乳腺癌、 转移性结直肠癌、 转移性黑色素瘤、 转移性肾细胞癌、 胶质母细胞瘤、 卵 巢癌、 前列腺癌、 实体肿瘤。。

17、 0011 本发明利用噬菌体展示抗体库的技术筛选出高亲和力的针对 VEGFR-2(KDR) 的抗 体。首先建立噬菌体抗体库， 通过固相抗原结合淘洗、 MIRRORBALL 鉴定， 最终筛选出 6 个单 克隆抗体， 这 6 个单克隆均表现出较高的抗体亲和力， 能够体外抑制人脐带静脉内皮细胞 (HUVEC) 细胞增殖， 具有很好的生化和生物学活性。 0012 筛选出的 6 个抗 VEGFR-2 抗体的轻链可变区氨基酸序列分别如 SEQ ID NO ： 1、 2、 3、 4、 5、 6所示 ； 重链可变区氨基酸序列分别如SEQ ID NO ： 7所示 ； 恒定区氨基酸序列分别如 SEQ ID NO 。

18、： 8、 9 所示。本专利氨基酸的中英文名称及其英文缩写如下表。 0013 说 明 书 CN 105646710 A 4 3/11 页 5 0014 SEQ ID NO1 至 7 序列具体如下 ： 0015 SEQ ID NO1 ： EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDSSNRATGI PARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYYCLQHNTFPSTFGQGTKVEIK 0016 SEQ ID NO2 ： 0017 DIQLTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSRLAWYQQKPGKAPKLLIYAA。

19、SSLQTGVPSRFSGSGSGT DFTLTISSLQPEDFATYYCQQANRFPPTFGPGTKVDIK 0018 SEQ ID NO3 ： DIQMTQSPSSVSASIGDRVTITCRASQGIDNWLGWYQQKPGKAPKLLIYDASNLDTGV PSRFSGSGSGTYFTLTISSLQAEDFAVYFCQQAKAFPPTFGGGTKVDIK 0019 SEQ ID NO4 ： 0020 DIQLTQSPSSVSASVGDRVTLTCRASQSIKRWLAWYQQKPGKAPRLLIYAASTLQSGVPSRFSGGGSGT DETLTINSLQPEDFAIYYCQQA。

20、NSFPPTFGPGTKVDIK 0021 SEQ ID NO5 ： 0022 DVVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNINNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGT DFTLTITSLQPEDSATYYCQQYSRYPPTFGGGTKVEI 0023 SEQ ID NO6 ： 0024 DIQLTQSPSSVSASVGDSVTITCRASQDISSWLAWYQQKPGEAPKLLIYAASLLQSGVPSRFSGSGSGT DFALTINSLQPEDFATYFCQQADSFPPTFGQGTRLEIK 0025 SEQ ID NO7 ： 00。

21、26 EVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFT ISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVTDAFDIWGQGTMVTVSS 说 明 书 CN 105646710 A 5 4/11 页 6 0027 本发明技术方案如下 ： 0028 本发明提供了一种新型全人源化抗 VEGFR-2 单克隆抗体或其片段， 0029 所述单克隆抗体或其片段的蛋白序列如下所示 ： 0030 1) 重链可变区的氨基酸序列如 SEQ ID NO ： 7 所示， 轻链可变区的氨基酸序列如 SEQ ID NO 。

22、： 1 所示 ； 0031 2) 重链可变区的氨基酸序列如 SEQ ID NO ： 7 所示， 轻链可变区的氨基酸序列如 SEQ ID NO ： 2 所示 ； 0032 3) 重链可变区的氨基酸序列如 SEQ ID NO ： 7 所示， 轻链可变区的氨基酸序列如 SEQ ID NO ： 3 所示 ； 0033 4) 重链可变区的氨基酸序列如 SEQ ID NO ： 7 所示， 轻链可变区的氨基酸序列如 SEQ ID NO ： 4 所示 ； 0034 5) 重链可变区的氨基酸序列如 SEQ ID NO ： 7 所示， 轻链可变区的氨基酸序列如 SEQ ID NO ： 5 所示 ； 0035 6)。

23、 重链可变区的氨基酸序列如 SEQ ID NO ： 7 所示， 轻链可变区的氨基酸序列如 SEQ ID NO ： 6 所示 ； 0036 本发明所述的单克隆抗体包括可变区和恒定区， 所述恒定区包括轻链恒定区和重 链恒定区， 所述重链恒定区为人 IgG1、 IgG2、 IgG3 或 IgG4 的任意一种， 优选为人 IgG1。 0037 本发明所述单克隆抗体轻链恒定区的氨基酸序列如 SEQ ID NO ： 8 所示， 重链恒定 区氨基酸序列如 SEQ ID NO ： 9 所示。具体如下 ： 0038 SEQ ID NO8 ： 0039 RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLN。

24、NFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKD STYSL SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 0040 SEQ ID NO9 ： 0041 ASTKGPSVLPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVV VDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD。

25、WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 0042 本发明所述单克隆抗体， 重链恒定区序列 SEQ ID NO ： 9， 所述重链恒定区的第 9 位 氨基酸为亮氨酸， 第 97 位氨基酸为精氨酸。 0043 本发明所述的单克隆抗体的片段包括单链抗体 scFv、 Fab、 F(ab )2、 scfv-FC 的形 式。 0044 本发明提供了包含编码所述单克隆抗体或其。

26、片段的 DNA 分子的载体， 所述载体是 Pcantab-5E 或 pFUSEIgG1-FC。 0045 本发明提供了一种转染上述载体的宿主细胞 ； 所述宿主细胞为 CHO 细胞。 0046 本发明进一步公开了上述全人源化抗 VEGFR-2 抗体的制备方法， 所述方法为使用 编码所述单克隆抗体或其片段的 DNA 表达载体转染宿主细胞， 获得含有所述单克隆抗体或 其片段的细胞培养上清液， 并经纯化制备目的蛋白。该方法包括从噬菌体人源抗体库筛选 获得高亲和力全人源化抗 VEGFR-2 单链抗体 ； 全人源化抗 VEGFR-2 完整抗体分子真核表达 说 明 书 CN 105646710 A 6 5/。

27、11 页 7 载体的构建 ； 全人源化抗VEGFR-2完整抗体分子在CHO细胞中的表达 ； 全人源化抗VEGFR-2 完整抗体分子的纯化。 0047 本发明提供了一种药物组合物， 所述药物组合物含有作为活性成分的单克隆抗体 或其片段以及一种或几种药学上可接受的缓冲剂或表面活性剂。 0048 作为优选， 缓冲剂成分包括能调节 pH 的任何生理可用物质， 例如柠檬酸盐、 磷酸 盐、 组氨酸盐、 琥珀酸盐、 马来酸盐及各自的酸或混合物。通常使用的缓冲剂成分是柠檬酸 盐和 / 或其游离酸。 0049 作为优选， 表面活性剂是可以在药物组合物中用作表面活性剂的任何赋形剂， 如 聚乙烯山梨聚糖酯类 (Tw。

28、eens) 等。 0050 本发明提供一种药物组合物， 所述药物组合物包括全人源化抗 VEGFR-2 抗体或其 片段以及一种或几种药学上可接受的可增大皮下组织间隙实现皮下注射给药的物质。 0051 作为优选， 所述可增大皮下组织间隙实现皮下注射给药的物质优选为透明质酸 酶。 0052 所述药物组合物通过注射剂的方式施用 ； 所述的注射剂通过腹膜内注射、 皮下注 射或静脉注射的方式施用。 0053 本发明提供了所述单克隆抗体或其片段用途为用于治疗由肿瘤新生血管生成引 起的疾病， 包括但不局限于下列肿瘤 ： 胃癌及食管胃交界腺癌、 非小细胞肺癌、 转移性非小 细胞肺癌、 肝细胞癌、 转移性肝细胞癌。

29、、 HER2 阴性的转移性乳腺癌、 转移性结直肠癌、 转移性 黑色素瘤、 转移性肾细胞癌、 胶质母细胞瘤、 卵巢癌、 前列腺癌、 实体肿瘤。 0054 本发明是利用 ScFv 噬菌体展示抗体库的技术和高通量筛选的方法， 筛选出高亲 和力的针对VEGFR-2(KDR)的全人源化抗体， 本发明筛选的抗VEGFR-2的抗体可以同时阻断 VEGF-A， VEGF-C， VEGF-D 和 VEGF-E 的作用， 因而具有更有效的抗血管生成效果， 此抗体可应 用于由肿瘤新生血管生成导致的疾病的治疗。 附图说明 0055 图 1 目的抗体经 Protein A 纯化后洗脱曲线 ； 0056 图 2 目的抗体。

30、还原型 SDS-PAGE 分子量及纯度电泳图 ； 0057 图 3 目的抗体与靶点结合活性 ELISA 分析图 ； 0058 图 4 目的抗体抑制人脐带静脉内皮细胞增殖活性图 ； 具体实施方式 0059 以下实施例、 实验例仅仅对本发明进行进一步的说明， 不应理解为对本发明的限 制。因此， 凡基于本发明所述内容所实现的技术均属于本发明的范围。本文引用的参考文 献以其全文通过引用并入本文。 0060 下述实施例中所述实验方法， 如无特殊说明， 均为常规方法 ； 所述试剂和生物材 料， 如无特殊说明， 均可从商业途径获得。 0061 实施例 1 抗体库的构建与筛选分离 0062 1、 抗体库的构建。

31、 0063 本发明中所用单链抗体库是人的天然抗体库， 其主要构建流程是 ： 说 明 书 CN 105646710 A 7 6/11 页 8 0064 (1) 从人外周血或脾、 淋巴结等组织中分离 B 淋巴细胞， Trizol 提取总 mRNA 并逆 转录为 cDNA ； 0065 (2) 根据人免疫球蛋白基因序列库 ( 如 Kabat database， V-base， IMGT 等 )， 设计 一组数对带有简并序列的抗体重链和轻链引物通过 PCR 技术扩增不同的 VH 和 VL 基因片 段， 通过 linker 区拼接成全长 scFv 单链抗体 ； 0066 所用引物碱基序列如下 ： 006。

32、7 VHback( 扩增重链可变区 VH 引物 ) 0068 HuVH1B/7A-BACK 5-CAG RTG CAG CTG GTG CAR TCT GG-3 0069 HuVH1C-BACK 5-SAG GTC CAG CTG GTR CAG TCT GG-3 0070 HuVH2B-BACK 5-CAG RTC ACC TTG AAG GAG TCT GG-3 0071 HuVH3B-BACK 5-SAG GTG CAG CTG GTG GAG TCT GG-3 0072 HuVH3C-BACK 5 -GAG GTG CAG CTG GTG GAG WCY GG-3 0073 HuVH4。

33、B-BACK 5-CAG GTG CAG CTA CAG CAG TGG GG-3 0074 HuVH4C-BACK 5-CAG STG CAG CTG CAG GAG TCS GG-3 0075 HuVH5B-BACK 5 -GAR GTG CAG CTG GTG CAG TCT GG-3 0076 HuVH6A-BACK 5-CAG GTA CAG CTG CAG CAG TCA GG-3 0077 VHforward 0078 HuJH1/2-FOR 5 -TGA GGA GAC GGT GAC CAG GGT GCC-3 0079 HuJH3-FOR 5-TGA AGA GAC GGT。

34、 GAC CAT TGT CCC-3 0080 HuJH4/5-FOR 5 -TGA GGA GAC GGT GAC CAG GGT TCC-3 0081 HuJH6-FOR 5-TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC-3 0082 Vback/Vback( 扩增轻链可变区 V、 V引物 ) 0083 HuV1B-BACK 5-GAC ATC CAG WTG ACC CAG TCT CC-3 0084 HuV2-BACK 5-GAT GTT GTG ATG ACT CAG TCT CC-39 0085 HuV3B-BACK 5-GAA ATT GTG WTG ACR C。

35、AG TCT CC-3 0086 HuV4B-BACK 5-GAT ATT GTG ATG ACC CAC ACT CC-3 0087 HuV5-BACK 5-GAA ACG ACA CTC ACG CAG TCT CC-3 0088 HuV6-BACK5 -GAA ATT GTG CTG ACT CAG TCT CC-3 0089 HuV1A-BACK 5 -CAG TCT GTG CTG ACT CAG CCA CC-3 0090 HuV1B-BACK 5-CAG TCT GTG YTG ACG CAG CCG CC-3 0091 HuV1C-BACK 5-CAG TCT GTC GTG 。

36、ACG CAG CCG CC-3 0092 HuV2-BACK 5-CAR TCT GCC CTG ACT CAG CCT-3 0093 HuV3A-BACK 5-TCC TAT GWG CTG ACT CAG CCA CC-3 0094 HuV3B-BACK 5-TCT TCTGAG CTG ACT CAG GAC CC-3 0095 HuV4-BACK 5-CAC GTT ATA CTG ACT CAA CCG CC-3 0096 HuV5-BACK 5-CAG GCT GTG CTG ACT CAG CCG TC-3 0097 HuV6-BACK 5-AAT TTT ATG CTG AC。

37、T CAG CCC CA-3 0098 HuV7/8-BACK 5-CAG RCT GTG GTG ACY CAG GAG CC-3 0099 HuV9-BACK 5-CWG CCT GTG CTG ACT CAG CCM CC-3 说 明 书 CN 105646710 A 8 7/11 页 9 0100 (3) 将获得的 scFv 经过 Sfi 酶切， 切胶回收后与经过 Sfi 酶切的噬粒 PS100 连接， 连接产物经过纯化后回收定量， 电转化感受态细胞 TG1， 构建抗体库。得到库容量为 5.5109的全套抗体库， 通过扩增纯化得到噬菌体展示抗体库的滴度为 3.510 11CFU/mL 。

38、； 用50甘油/PBS溶液调整噬菌体储液浓度， 使其达到1013转染单位/ml ； 将储液以每管1ml 的量分装， 储存于 -80； 每轮筛选使用一管， 通过聚乙二醇沉淀的方法除去甘油， 将噬菌体 重悬于 1ml 后期筛选所使用的缓冲液中 ； 0101 (4) 抗体库的鉴定及抗体基因序列分析 0102 随机挑取数个 VH+V 和 VH+V 克隆进行测序， 结果表明它们都是由人抗体 V 区 基因组成的 scFv 基因序列， 该抗体库的阳性重组率为 100。DASTAR 分析结果表明， 抗体 库基因序列各不相同， 表明初级抗体库具有较好的多样性。 同时， 序列分析结果表明有75 的 scFv 序列。

39、翻译完全正确。 0103 2、 筛选目的抗体， 其方法如下 ： 0104 (1) 将 VEGFR-2 蛋白固定在免疫管上 ； 加入噬菌体抗体库， 将免疫管封口， 旋转仪 上混合 0105 90 分钟 ； 0106 (2) 加入 PBST 洗涤 10 次， 再用 PBS 洗涤 10 次， 去除未结合的噬菌体抗体 ； 0107 (3) 在免疫管中加入 1ml 三乙胺， 将结合在免疫管上的噬菌体抗体洗脱 ； 将洗脱下 来的噬菌体重新感染对数生长期的 TG1 大肠杆菌， 过夜培养， 扩增噬菌体， PEG/NaCl 沉淀纯 化的噬菌体用于下一轮筛选 ； 共进行 3 4 轮噬菌体库富集筛选 ； 0108 。

40、(4)3 4 轮筛选后， 将洗脱下来的噬菌体感染 TG1 细胞， 涂布平板， 挑取单克隆菌 落 ； 0109 (5) 对挑选的噬菌体克隆进行鉴定， 挑选与 VEGFR-2 亲和力结合力高的克隆。 0110 3、 单克隆噬菌体鉴定 0111 最后一轮的洗脱产物测滴度， 挑 100 个单克隆噬菌体做 mirrorball 检测， 将链霉 亲和素化微珠 ( 购自 Invitrogen 公司 )、 生物素化 VEGFR-2、 单克隆噬菌体上清、 兔抗 FD 噬 菌体抗体 ( 购自 Jackson 公司 )、 羊抗兔 -FITC 二抗 ( 购自 Jackson 公司 ) 加进 96 孔板， 孵 育过夜读。

41、数， 结果显示阳性 60 个， 弱阳性 20 个， 阴性 20 个。测定了 40 个抗体序列， 得到 6 个独特单克隆抗体， 可变区序列分别如 SEQ ID NO ： 1-6 所示。 0112 实施例 2 高表达量工程细胞株的构建与表达 0113 1、 抗体的克隆与转染 0114 (1) 将筛选的可变区序列为 SEQ ID NO ： 1-6 所组成的单链抗体采用常规基因克隆 的方法， 克隆到 FC 融合真核表达载体 Pcantab-5E 或 pFUSEIgG1-FC 表达全长抗体的载体 中。通过酶切和测序的方法鉴定抗体基因的正确插入， 然后进行转染和抗体分泌表达。 0115 (2) 转染前 2。

42、4 小时， 消化后将 1105/mL 细胞密度的 HEK293T/17 细胞接种于 6 孔 板中， 培养过夜。 取两支装200ul无血清培养基的试管， 加入1ugDNA工作液， 混匀， 室温孵5 分钟， 将 2ul PEI( 聚乙烯亚胺聚合物 ) 稀释液快速加入 DNA 稀释液中， 立即涡旋 15 秒， 室 温孵育 30 分钟到 1 小时 ( 无浑浊 ) ； 0116 (3) 弃细胞培养上清液 ( 尽量保留细胞 )， 加入 700uL 培养基， 将 PEI、 DNA 混合液 快速、 逐滴、 轻柔地沿壁加入细胞中， 培养4-6h， 换成2mL的新鲜的培养基， 培养48h， 取少量 说 明 书 C。

43、N 105646710 A 9 8/11 页 10 上清做 ELISA， 检测转染效率， 剩下细胞继续培养 2-4 天。 0117 2、 抗体表达细胞株的构建和表达 0118 所用的宿主细胞可以是谷氨酰胺合成酶GS表达系统或者二氢叶酸还原酶DHFR表 达体系。构建细胞株的方法如下 ： 0119 (1)lipo2000 转染方法将目的质粒转入到 CHO 细胞 ( 中国仓鼠卵巢细胞， Chinese Hamser Ovary)中。 培养基为无蛋白无血清无动物成分， 培养条件是36-38， 5-10CO2的 潮湿无菌环境。转染 24 小时后， 细胞接种到 96 孔板、 不含谷氨酰胺但含有 100 1。

44、000ug/ ml G418 及 25 微摩尔浓度 MSX(L- 蛋氨酸亚砜胺， 若为 DHFR 表达系统则添加 MTX， 并添加 4mM/L 谷氨酰胺 ) 的 CD-CHO(Gibco 公司 ) 培养基中。 0120 (2) 每三天更换一次培养基。通过 12 天的培养和筛选， 活细胞长成显微镜可见的 克隆。 转移50个克隆到24孔板中继续培养9天。 使用FC ELISA的方法测定克隆的PCD(pg/ cell/day) ； 选取 PCD 最好的 13 个克隆继续放大到 50 毫升中培养并测定 PCD。其中最好的 6 个克隆进一步采用有限稀释法挑选亚克隆。大概 21 天后， 测定第二轮筛选亚克。

45、隆的 PCD。 最高 PCD 的 3 个克隆 (A139、 A140、 A141) 作为候选细胞株建立细胞库。 0121 3、 抗体的纯化和 SDS-PAGE 分析 0122 取转染后细胞培养的上清液。采用 GE Hiscale 50/20 亲和层析柱层析， 分离目的 蛋白， 实验流程如下 ： 0123 (1) 将缓冲液充满管道并排除气泡， 在 10ml/min 流速下连接柱子 ； 0124 (2) 用除热源洗涤液洗涤 1 小时 (10ml/min) ； 0125 (3) 用超纯水洗涤 3 个 CV 后， 用 3 个 CV 的平衡液平衡介质， UV 校零 ； 0126 (4)40ml/min 。

46、的流速下上样， 共上样 1.9L ； 0127 (5) 用平衡液洗去未结合成分至回到 UV 基线 ( 约 2 倍 CV) ； 0128 (6) 用洗涤液 1 作为第一步洗涤， 洗脱体积为 5 倍 CV ； 0129 (7) 用 5 倍 CV 的洗涤液 2 平衡介质 ； 0130 (8) 用 2 3 倍 CV 的洗脱缓冲液进行洗脱， 当 OD280上升至 50mAu 开始收集洗脱 蛋白于 1L 已除热源的塑料瓶中， 当基线下降至 300mAu 左右时停止收集洗脱蛋白 ( 共收集 406ml， 浓度为 10.12mg/ml)。缓慢加入 2MTris 母液将其 pH 调节为 3.8， 室温下放置 1。

47、h 后 缓慢调节 pH 至 6.5， 2-8放置 30min， 并用 0.22um 膜过滤去除浑浊样微粒， 置于 -20保 存。 0131 洗脱曲线如图 1 所示。取纯化后的蛋白， 采用还原条件的 SDS-PAGE 方法， 分析纯 化产物分子量， 重链50.05.0kD， 轻链27.02.7kD ； 还原SDS-PAGE方法测定产品纯度， 单 体 95， 结果如图 2 所示。 0132 实施例 3 抗体的生化和生物学功能的鉴定 0133 1、 抗体的亲和力检测 0134 运用 Biacore T100(Biacore AB， Uppsala， Sweden) 检测 3 个克隆 (A139、 A。

48、140、 A141) 的目的抗体样品的亲和力常数。将参比品 VEGF165(R&D 公司产品 ) 通过氨基共价结 合与CM5生物传感芯片(GE Healthcare)上， 测定待测抗体的RU响应值， 根据结果确定合适 的抗体浓度， 通常在 100-200RU 为宜。然后测试抗原 VEGFR2 的浓度， 确定抗原浓度范围和 接触时间。最后使用 kinetics/affinity 方法， 测定测试抗体的动力学参数和亲和力。结 说 明 书 CN 105646710 A 10 9/11 页 11 果见表 1。 0135 0136 表 1 亲和力试验结果 0137 由表中可以看出， 不同抗体表现出不同动。

49、力学特性， A140 具有最快的结合活性， A141解离常数最大。 比较各抗体Kd值 ： A140A139VEGF165A141， 说明全人源化抗体 A140 的亲和力显著高于 A141， 明显高于 VEGF165， 略高于 A139。抗体氨基酸测序结果 (SEQ ID NO ： 9)， 与人 Ig gamma-1chain C region 氨基酸序列 (Uniprot 登录号 #P01857) 对比， 发现 A140 重链恒定区氨基酸第 9 位由 F 突变为 L， 第 97 位由天然 K 突变为 R， 抗体亲和力 高于 A139。 0138 2、 抗体的结合特异性检测 0139 参考 重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白受体结合活性检测方法的改 进 ， 中国生物制品学杂志 2012 年 9 月第 25 卷第 9 期方法 ： 0140 抗 VEGFR2 单抗通过与靶标抗原 VEGFR2 的特异结合而发挥作用， 本方法直接包 被 VEGFR2 来检测不同浓度的供试品与其结合的能力。采用夹心 ELISA 法对系列稀释的 抗 VEGFR2 单抗供试品 (A139， A140) 和参比品进行检测， 使用四参数方程拟合， 建立试验 成立标准。