一种绿色木霉碱性蛋白酶及其真核表达方法与应用.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 102168080 B (45)授权公告日 2012.11.07 CN 102168080 B *CN102168080B* (21)申请号 201010589085.3 (22)申请日 2010.12.15 CCTCC NO:M 2010291 2010.11.04 C12N 9/58(2006.01) C12N 15/55(2006.01) C12N 15/79(2006.01) A01N 63/04(2006.01) A01P 3/00(2006.01) (73)专利权人 广东省农业科学院作物研究所 地址 510640 广东省广州市五山路金颖西二 街 18 号 。

2、(72)发明人 刘付香 梁炫强 李玲 陈小平 刘海燕 张二华 温世杰 (74)专利代理机构 广州市华学知识产权代理有 限公司 44245 代理人 裘晖 CN 101225401 A,2008.07.23, 刘付香 , 李玲 , 梁炫强 ,. 黄曲霉拮抗 菌 (GZ101) 的鉴定及碱性蛋白酶基因克隆、 表 达 .广东省植物学会第十九期学术研讨会论文 集 .2010,40-41. 刘付香 , 李玲 , 梁炫强， . 生物防治黄曲霉 毒素污染研究进展 .中国生物防治 .2010, 第 26 卷 ( 第 1 期 ),96-101. 魏林， 梁志怀， 曹福祥， 安哲宇， 李林， 刘登 望 . 哈茨木霉。

3、 T2-16 代谢产物对花生种子活力和 抗黄曲霉菌侵染能力的影响 .中国油料作物学 报 .2009, 第 31 卷 ( 第 3 期 ),370-373. (54) 发明名称 一种绿色木霉碱性蛋白酶及其真核表达方法 与应用 (57) 摘要 本发明公开了一种绿色木霉碱性蛋白酶及其 真核表达方法与应用。该绿色木霉碱性蛋白酶的 编码序列通过 RACE 方法得到， 氨基酸序列长度为 410个氨基酸， 编码序列长度为1233个核苷酸。 该 绿色木霉碱性蛋白酶的编码核苷酸序列构建于真 核表达载体中， 进行真核表达， 能得到具有抑制黄 曲霉生长的色木霉碱性蛋白酶。该绿色木霉碱性 蛋白酶具有抑制黄曲霉生长的功能。

4、。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 白鸽 权利要求书 1 页 说明书 9 页 序列表 7 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 9 页 序列表 7 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 一种绿色木霉碱性蛋白酶， 其特征在于氨基酸序列如 SEQ ID: NO.1 所示。 2. 编码权利要求 1 所述绿色木霉碱性蛋白酶的核苷酸序列， 其特征在于如 SEQ ID: NO.2 所示。 3. 权利要求 1 所述绿色木霉碱性蛋白酶的真核表达方法， 其特征在于包含以下步骤 ： 将权利要求 2 所述绿色木。

5、霉碱性蛋白酶的核苷酸序列克隆至真核表达载体中， 转化宿主细 胞， 进行诱导和表达。 4. 根据权利要求 3 所述的真核表达方法， 其特征在于 ： 所述的真核表达载体为 pPICZ 载体 ； 所述宿主为毕赤酵母表达菌株 GS115。 5. 权利要求 1 所述绿色木霉碱性蛋白酶在制备抑制黄曲霉生长的制剂中的应用。 权 利 要 求 书 CN 102168080 B 2 1/9 页 3 一种绿色木霉碱性蛋白酶及其真核表达方法与应用 技术领域 0001 本发明属于抗黄曲霉生长技术领域， 具体涉及一种绿色木霉碱性蛋白酶及其真核 表达方法与应用。 背景技术 0002 绿色木霉菌(Trichoderma vi。

6、ride)属半知菌亚门， 丛孢梗目， 丛孢梗科， 是当前公 认的具有应用前景的生防菌， 能够防治多种病害。绿色木霉菌以其资源丰富、 持效期长、 作 用方式独特、 对非靶标生物安全及不污染环境等优点而倍受重视。 在国内外研究中， 利用木 霉菌防治作物的猝倒病、 立枯病、 灰霉病、 纹枯病等均取得了良好的效果。 0003 碱性蛋白酶 (Alkaline Protease)， 属于丝氨酸孢外高碱性蛋白酶， 它能水解蛋白 质分子， 具有较强的分解蛋白质的能力， 是重要的细胞壁裂解酶， 在绿色木霉与其它病原菌 的相互作用中起到主要作用。 0004 目前， 对碱性蛋白酶的研究较少， Geremia 等 (。

7、1993) 从哈茨木霉 (Trichoderma harzianum)IMI206040 菌株中分离到 1 种丝氨酸蛋白酶基因 prb1， 并证明它与菌寄生过程 有关。Jess(2002) 等从哈茨木霉中分离出 1 种天冬氨酰蛋白酶基因 papA， 并在酵母中高 效表达。但到目前为止， 对绿色木霉菌中碱性蛋白酶的研究则未见报道。 发明内容 0005 本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足， 提供一种绿色木霉碱性蛋白 酶。 0006 本发明的另一目的在于提供所述绿色木霉碱性蛋白酶的真核表达方法。 0007 本发明的再一目的在于提供上述绿色木霉碱性蛋白酶的应用。 0008 本发明的目的通过下。

8、述技术方案实现 ： 一种绿色木霉碱性蛋白酶， 其氨基酸序列 如下所示 ： 0009 MAIIRRLALYLGALLPAVLAAPAALHKKPFAVPNKFIVTLKFGASIDTDSHLAWVNDLHRRSLTKRST 0010 AGVEKTYNIHTWSAYAGEFDDETIEQIKSSPDVGCVCGARLHHVPVGHCDRQACFDYTIRCSLGSRHC 0011 FPSHIWVHKLHLSSLSWRWNFCLRSSLRYQHLPSAIRRACQPWLACCRGAACTYSWSWYSCFRNNCWI 0012 YIWRCQAGLPNLRVSLLWRALHHLYYPRRLWLGRER。

9、HCLAEPCKQICYMYVAWRTCFIYLDDRHQRSL 0013 QPGCAYHCRRWGWRLSRKPPTSLQHFSCVRTARHHCCSTGHQLAHCFLHQLWCWCVRFCPWCICSVSW 0014 IGSNTATNTISGTSMATPHVVGLALYLQSLEGLSTPTAVTNRIKALATTGRVTGSLRGSPNSIIFNGH 0015 SA ； 0016 所述绿色木霉碱性蛋白酶， 其核苷酸序列如下所示 ： 0017 ATGGCCATCATCCGTCGTCTTGCTCTCTATCTCGGAGCCTTGCTCCCGGCTGTCCTCGCCGCTCCCGC 0018。

10、 AGCTCTTCATAAGAAGCCGGAGGCTGTACCTAACAAGTTTATTGTCACTCTGAAAGAGGGCGCTTCCA 0019 TTGATACAGACTCTCATCTCGCCTGGGTAAATGACCTCCACCGTCGATCTTTGACCAAGCGTAGCACT 0020 GCTGGTGTTGAAAAGACTTATAACATTCATACTTGGAGTGCTTATGCGGGCGAGTTTGATGACGAGAC 说 明 书 CN 102168080 B 3 2/9 页 4 0021 AATTGAGCAGATCAAGTCTAGTCCCGATGTAGGTTGCGTCTGTGGA。

11、GCCAGACTACATCATGTACCTG 0022 TCGGACATTGTGACAGACAAGCGTGCTTTGACTACACAATCCGGTGCTCCTTGGGGTCTCGGCACTGT 0023 TTCCCATCGCACATCTGGGTCCACAAGCTACATTTAAGCTCACTCAGCTGGCGCTGGAACTTTTGCCT 0024 ACGTAGTTCCCTCCGGTATCAACACCTCCCATCAGCAATTCGGCGGGCGTGCCAGCCTTGGCTAGCTT 0025 GCTGCAGGGGGGCAGCATGTACTTACTCTTGGTCATGGTACTCATGTTTC。

12、CGGAACAATTGCTGGATC 0026 TACATTTGGCGTTGCCAGGCAGGCCTACCTAATCTCCGTGTCAGTCTTCTCTGGAGAGCTCTCCACCA 0027 CCTCTATTATCCTCGACGGCTATGGCTGGGCCGTGAACGACATTGTCTCGCGGAACCGTGCAAACAAA 0028 TCTGCTATATGTATGTCGCTTGGAGGACCTGCTTCATCTACCTGGACGACCGCCATCAACGCAGCCTT 0029 CAGCCAGGGTGTGCTTACCATTGTCGCCGCTGGGGCTGGAGACTCTCTAGGAAA。

13、CCCCCAACCAGTCT 0030 CCAGCACTTCTCCTGCGTTCGTACCGCTCGCCATCACTGTTGCAGCACTGGACATCAATTGGCGCACT 0031 GCTTCCTTCACCAACTATGGTGCTGGTGTGTCCGTTTTTGCCCCTGGTGTATTTGTTCTGTCTCATGG 0032 ATTGGATCTAACACTGCCACCAACACAATTAGCGGCACTTCAATGGCTACACCTCACGTTGTCGGTCT 0033 GGCTCTCTATCTTCAATCCCTTGAAGGTCTCTCCACTCCCACCGCTGTCACTAATCGG。

14、ATCAAAGCTC 0034 TGGCTACCACTGGCCGCGTAACCGGCAGCCTTAGAGGTAGCCCTAACTCTATCATCTTCAACGGACAC 0035 AGTGCTTAA ； 0036 所述绿色木霉碱性蛋白酶的真核表达方法， 包含以下步骤 ： 将绿色木霉碱性蛋白 酶的编码序列克隆至真核表达载体中， 转化宿主细胞， 进行诱导和表达。 0037 所述的真核表达载体优选 pPICZA 载体 ； 所述宿主优选为毕赤酵母表达菌株 GS115。 0038 所述绿色木霉碱性蛋白酶应用于制备抑制黄曲霉生长的制剂。 0039 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果 ： 0040 本。

15、发明首次从绿色木霉中分离得到一种碱性蛋白酶， 并且证实了该碱性蛋白酶具 有抑制黄曲霉生长的功能。 附图说明 0041 图 1 是绿色木霉碱性蛋白酶全长 cDNA 的 PCR 扩增产物的电泳检测图， 其中 ： 0042 泳道 M 为 DL2000 Marker ； 0043 泳道 1 为 PCR 扩增产物， 箭头处为目的片段。 0044 图 2 是 SDS-PAGE 电泳图， 其中箭头处为目标蛋白。 具体实施方式 0045 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述， 但本发明的实施方式不限 于此。 0046 实施例 1 0047 (1) 绿色木霉菌株的分离及鉴定 0048 分离土样取自广东。

16、省汕头市花生种植田土壤。 称取土样10g， 放入盛有100ml无 菌水的带有玻璃珠的三角瓶中， 振荡摇匀 10min 使土和水充分混合。在无菌操作条件下， 用 移液枪从三角瓶中吸取 1ml， 加入另一盛有 9ml 无菌水的试管中， 混合均匀， 依此类推分别 制成 10-2、 10-3、 10-4不同稀释度的土壤溶液。 说 明 书 CN 102168080 B 4 3/9 页 5 0049 涂布培养及划线分离 ： 以 10-2及 10-3两个浓度的土壤稀释液作为涂布平板培养 的对象， 将其涂布在 PDA( 马铃薯葡萄糖琼脂 ) 固体培养基 ( 马铃薯 200g， 葡萄糖 20g， 琼脂 15g，。

17、 pH6.8， 蒸馏水定容至 1000ml) 上， 每个样 3 个重复， 28培养 3 天后， 对平板中的微生 物进行观察， 用接种环挑取平板中长势旺盛的拟拮抗菌株进行划线分离， 得到纯培养物。 接 着对纯培养进一步筛选 ： 利用牛津杯双层平板法将纯培养物的发酵液对黄曲霉进行抑菌活 力的测定 ( 所用的黄曲霉为黄曲霉 GIM3.17， 购于中科院微生物所 )， 得到了不仅能抑制黄 曲霉菌丝的生长， 还能抑制黄曲霉孢子的萌发的黄曲霉拮抗菌 GZ101。 0050 菌株鉴定 ： 0051 A、 形态学鉴定 0052 平板上菌落形态特征 ： 将接种针经火焰灭菌并待冷却后， 从斜面上挑取少量黄曲 霉拮。

18、抗菌 GZ101 菌体， 接种于平板的中间位置， 倒置于 25培养 7 14 天， 观察菌落特征。 结果表明， 在察氏固体培养基上， 生长较差， 菌丝稀疏， 培养 7 天后有稀疏的绿色产孢子丛 束区， 菌落反面无色 ； 在麦芽汁固体培养基上生长快， 培养 7 天后菌丝铺满整个平皿， 最初 为白色致密的基质菌丝， 而后出现棉絮状气生菌丝， 并形成密实产孢丛束区， 常排成同心轮 纹， 黄绿色的产孢区， 有辐射状沟纹， 菌落反面无色 ； 在 PDA 固体培养基上生长速度快， 培养 7 天后菌丝铺满整个平皿， 最初为白色致密的基质菌丝， 而后出现棉絮状气生菌丝， 并形成 密实产孢丛束区， 常排成同心轮。

19、纹， 深黄绿色至深蓝绿色的产孢区， 菌落反面无色。 0053 显微镜下形态特征观察 ： 用解剖针从培养皿的菌落上， 挑取少量黄曲霉拮抗菌 GZ101 菌体， 置载玻片的水滴中， 加盖盖玻片。于显微镜下观察其形态特征。发现其菌丝透 明， 壁光滑， 有隔， 直径 1.5 8m， 厚垣孢子间生于菌丝中或顶生于短侧枝上， 多数为球 形， 少数为椭圆形， 透明， 壁光滑 ； 分生孢子梗为菌丝的短侧枝， 其上对生或互生分枝， 分枝 上继续分枝， 形成二级、 三级分枝， 小梗瓶形成锥形， 基部稍窄， 中部较宽， 从中部以上变窄 成长颈， (8 12)(2.5 3)m， 分生孢子多数为球形， 直径 2.5 4。

20、.5m， 少数孢子为 短倒卵形， (4 5)(3.5 4)m。 0054 根据以上培养特征及显微形态特征结果， 查 真菌鉴定手册 及 真菌的形态和分 类 可知， 该菌与绿色木霉菌 (Trichoderma viride) 最相似。 0055 B、 分子生物学方法进行鉴定 0056 黄曲霉拮抗菌 GZ101 的 DNA 的提取 ： 将 GZ101 菌株接种于 PDA 固体培养基中， 28 恒温培养 3 5 天后， 将菌丝转移至灭过菌的研钵中， 用液氮将菌体迅速研磨成粉末后， 用 基因组提取试剂盒提取基因组 DNA。 0057 PCR 扩增 ： 以提取的 DNA 为模板， 用真菌通用引物 ITS1。

21、(5 -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 )、 ITS2(5 -GCTGCGTTCATCGATGC-3 ) 扩增 18S rDNA 基 因。PCR 反应体系为 ： 0058 试剂 体积 0059 2 x PCR Master Mix 5L 0060 引物 ITS1( 浓度为 10M) 1L 0061 引物 ITS1( 浓度为 10M) 1L 0062 基因组 DNA( 浓度为 10ng/uL) 5L 0063 灭菌水 定容至 50L 说 明 书 CN 102168080 B 5 4/9 页 6 0064 反应条件 ： 0065 94 5min ； 0066 94 1min， 56 1。

22、min， 72 2min(30 个循环 ) ； 0067 72 7min ； 0068 4保存。 0069 将扩增条带回收后送往上海英俊公司测序， 测序序列如下所示。将测得的 18S rDNA基因序列在GenBank等国际核酸序列数据库内进行同源序列搜索(blast search)， 找 出该菌株与数据库中同源性最高的模式菌株或保藏于 ATCC 或 DSM 等国际菌种保藏中心的 菌株。结合形态特征， 确定黄曲霉拮抗菌 GZ101 为绿色木霉菌 (Trichoderma viride)。将 该菌株命名为绿色木霉 GZ101， 于 2010 年 11 月 4 日保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏。

23、 号为 CCTCC M 2010291。 0070 测序序列 ： 0071 GCCCACCTCTCTGGGCCAGTCCGGACGCCTCACTGAGCCATTCAATCGGTAGTAGCGACGGGCGGTGTG TACAAAGGGCA 0072 GGGACGTAATCAACGCAAGCTGATGACTTGCGCTTACTAGGGATTCCTCGTTGAAGAGCAATAATTGCA ATGCTCTATCC 0073 CCAGCACGACGGAGTTTAACAAGATTACCCAGGCCTTCCGGCCAAGGGAGTACTCGCTGGCTCCGTCAG TGTAGCGCGCG 0074 T。

24、GCGGCCCAGAACATCTAAGGGCATCACAGACCTGTTATTGCCTCAAACTTCCATCGGCTTGAGCCGAT AGTCCCTCTAA 0075 GAAGCCGGCGTACTGCCAAAGCAATACGGGCTATTTAGCAGGTTAAGGTCTCGTTCGTTATCGCAATTA AGCAGACAAAT 0076 CACTCCACCAACTAAGAGCGGCCATGCACCACCACCCACAAAATCAAGAAAGAGCTCTCAATCTGTCAA TCCTCATTGTG 0077 TCTGGACCTGGTGAGTTTCCCCGTGTTGAGTCAAATTAAG。

25、CCGCAGGCTCCACCCCTGGTGGTGCCCTT CCGTCAATTTC 0078 TTTAAGTTTCAGCCTTGCGACCATACTCCCCCTGGAGCCCAAGCACTTTGATTTCTCGTAAGGTGCCGA ACGCGTCAAAA 0079 ATGTAACATCGTCCGATCCCTAGTCGGCATAGTTTATGGTTAAGACTACGACGGTATCTGATCGTCTTC GATCCCCTAAC 0080 TTTCGTTCCTGATTAATGAAAACATCCTTGGCAAATGCTTTCGCAGTAGTTAGTCTTCAATAAATCCAA GAATTTCAC。

26、CT 0081 CTGACAATTGAATACTGATGCCCCCGACTGTCCCTATTAATCATTACGGCGGTCCTAGAAACCAACAAA ATAGAACCACA 0082 CGTCCTATTCTATTATTCCATGCTAATGTATTCGAGCATAGGCCTGCCTTGAGCACTCTAATTTTTTCA AAGTAAAAGTC 0083 CTGTTTCCCCGCCACACCCAGTGAAGGGCATGGGGTTCCGCAGAGGGAAAGGCCCGGCCGGACCAGTGC ACGCGGTGAGG 0084 CGGACCGGCCAGCCAGGCCCAAGGTTCAACT。

27、ACGAGCTTTTTAACCACAACAACTTTAATATACGCTAT 说 明 书 CN 102168080 B 6 5/9 页 7 TGGAGCTGGAA 0085 TTACCGCGGCTGCTGGCACCAGACTTGCCCTCCAATTGTTCCTCGTTAAGGGATTTAAATTGTACTCAT TCCGCTTACAA 0086 GACCCAAAAGAGCCCTGTATCAGTATTTATTGTCACTACCTCCCCGTGTCGGGATTGGGTAATTTGCGC GCCTGCTGCCT 0087 TCCTTGGATGTAGTAGCCGTTTCTCAGGCTCCTTCTCCG。

28、GGGTCGAGCCCTAACCCTCCGTTACCCGTT GCCACCATGTT 0088 TGGCCAATACCCAAACATCGAAAGTTGATAGGGAAGAAATTTGAATGAGCCATCGCCGGCACAAGGCCT GTCGATTCGAC 0089 TAGTTATCATGATTCACCAGAGAGCCCCGAGGGGCATTGGTTTTTAATCTAATAAATACATCCCTTCCG AAGTCGGGATT 0090 TTCAGCATGTATTAGCTCTAGAATTACCACGGTTATCCAAGTAGTAAAGTATTATCAAATAAACGATAA CTTATATA。

29、ATG 0091 AGCCATT 0092 实施例 2 0093 获取绿色木霉碱性蛋白酶 0094 (1) 合成 PCR 引物 0095 AM ： 5 -CAATCTGGTGCTCCTTGGGGT-3 0096 BM ： 5 -CGTATGTAGATCCACCAATTGTTCC-3 0097 Q1 ： 5 -GTCATCGTCAATCTGGGTCACAAGC-3 0098 Q2 ： 5 -GTATGTAGATCCACCAATTGTTCCG-3 0099 M1 ： 5 -ATGGCCATCATCCGTCGTCTT-3 0100 M2 ： 5 -TTAAGCACTGTGTCCGTTGAAG-3 0。

30、101 以上引物均由 Sigma 公司合成。 0102 (2) 获得绿色木霉碱性蛋白酶的 cDNA 0103 I、 根据说明书操作， 用 TRIZOL 试剂 ( 购自 Invitrogen) 抽提绿色木霉 GZ101 的总 RNA， 用 RT-PCR 试剂盒 ( 购自 TaKaRa 公司， 按说明书进行操作 ) 进行 cDNA 第一链的扩增， 引物为 OLIGO 18T， 得到 cDNA 第一链。再以 cDNA 第一链为模板， 进行 PCR 扩增， 扩增的 PCR 体系为 ： 0104 试剂 体积 0105 2 x PCR Master Mix 5L 0106 引物 AM( 浓度为 10M) 。

31、1L 0107 引物 BM( 浓度为 10M) 1L 0108 cDNA( 浓度为 10ng/uL) 5L 0109 灭菌水 定容至 50L 0110 反应条件 ： 0111 94 5min ； 0112 94 1min， 60 30s， 72 2min(35 个循环 ) ； 0113 72 10min ； 说 明 书 CN 102168080 B 7 6/9 页 8 0114 4保存。 0115 根据各个试剂盒说明书进行操作， 用凝胶回收试剂盒(购自TIANGEN公司)对PCR 产物 ( 长为 219bp) 回收， 再将回收后的 PCR 产物， 与 pMD18-T 载体 ( 购自大连宝生生物。

32、公 司 ) 连接， 转化大肠杆菌 DH5( 购自 Novagen 公司 ) 感受态细胞， 筛选获得阳性克隆， 并进 行测序验证， 测序结果如下 ： 0116 CACCGGATTTGTCATCGTCAATCTGGGTCACAAGCTACATTTATGATAGCTCAGCTGGCGCTGGAACTT TTGCCTACGTA 0117 GTTGACTCCGGTATCAACACCTCCCATCAGCAATTCGGCGGGCGTGCCAGCCTTGGCTATAATGCTGCA GGGGGGCAGCA 0118 TGTTGATACTCTTGGTCATGGTACTCATGTTTCCGGAACAATTGGTG。

33、GATCTACATACG 0119 II、 RACE 0120 3 -RACE ： 以 RT-PCR 得到的 cDNA 第一链为模板， 根据上述得到的长为 219bp 的 序列设计特异引物 Q1 进行 PCR 扩增 ( 具体操作步骤详见 SMARTerRACEcDNA Ampliication Kit)。 0121 5 -RACE ： 根据长为 219bp 的序列设计特异引物 Q2 进行 PCR 扩增 ( 具体操作步骤 详见 SMARTer RACE cDNA Ampliication Kit)。 0122 将分别得到的 3 -RACE 和 5 -RACE 片段与 pMD18-T 载体进行连接。

34、， 转化大肠杆菌 DH5( 购自 Novagen 公司 ) 感受态细胞， 筛选获得阳性克隆， 送至上海英俊公司测序。拼 接测序得到的各片段， 分别在起始密码子 ATG 上游和终止密码子 TAA 下游设计特异性引物 M1 和 M2， 利用 RT-PCR 得到的 cDNA 第一链为模板扩增得到绿色木霉碱性蛋白酶 ( 命名为 TvALP1) 全长 cDNA 序列， 扩增的 PCR 体系为 ： 0123 试剂 体积 0124 2 x PCR Master Mix 5L 0125 引物 M1( 浓度为 10M) 1L 0126 引物 M2( 浓度为 10M) 1L 0127 cDNA( 浓度为 10ng。

35、/uL) 5L 0128 灭菌水 定容至 50L 0129 反应条件 ： 0130 94 5min ； 0131 94 1min， 60 30s， 72 2min(35 个循环 ) ； 0132 72 10min ； 0133 4保存。 0134 PCR 产物电泳， 如图 1 所示。将 TvALP1 全长 cDNA 序列与 pMD18-T 载体进行连 接， 转化大肠杆菌 DH5( 购自 Novagen 公司 ) 感受态细胞， 筛选获得阳性克隆， 抽取质粒 pMDT-TvALP1 送至上海英俊公司测序， 测序序列如下所示 ： 0135 GCCCACCTCTCTGGGCCAGTCCGGACGCCT。

36、CACTGAGCCATTCAATCGGTAGTAGCGACGGGCGGTGTG TACAAAGGGCA 0136 GGGACGTAATCAACGCAAGCTGATGACTTGCGCTTACTAGGGATTCCTCGTTGAAGAGCAATAATTGCA ATGCTCTATCC 说 明 书 CN 102168080 B 8 7/9 页 9 0137 CCAGCACGACGGAGTTTAACAAGATTACCCAGGCCTTCCGGCCAAGGGAGTACTCGCTGGCTCCGTCAG TGTAGCGCGCG 0138 TGCGGCCCAGAACATCTAAGGGCATCACAGACCTGTTA。

37、TTGCCTCAAACTTCCATCGGCTTGAGCCGAT AGTCCCTCTAA 0139 GAAGCCGGCGTACTGCCAAAGCAATACGGGCTATTTAGCAGGTTAAGGTCTCGTTCGTTATCGCAATTA AGCAGACAAAT 0140 CACTCCACCAACTAAGAGCGGCCATGCACCACCACCCACAAAATCAAGAAAGAGCTCTCAATCTGTCAA TCCTCATTGTG 0141 TCTGGACCTGGTGAGTTTCCCCGTGTTGAGTCAAATTAAGCCGCAGGCTCCACCCCTGGTGGTGCCCTT CCGTCAA。

38、TTTC 0142 TTTAAGTTTCAGCCTTGCGACCATACTCCCCCTGGAGCCCAAGCACTTTGATTTCTCGTAAGGTGCCGA ACGCGTCAAAA 0143 ATGTAACATCGTCCGATCCCTAGTCGGCATAGTTTATGGTTAAGACTACGACGGTATCTGATCGTCTTC GATCCCCTAAC 0144 TTTCGTTCCTGATTAATGAAAACATCCTTGGCAAATGCTTTCGCAGTAGTTAGTCTTCAATAAATCCAA GAATTTCACCT 0145 CTGACAATTGAATACTGATGCCCCCGACT。

39、GTCCCTATTAATCATTACGGCGGTCCTAGAAACCAACAAA ATAGAACCACA 0146 CGTCCTATTCTATTATTCCATGCTAATGTATTCGAGCATAGGCCTGCCTTGAGCACTCTAATTTTTTCA AAGTAAAAGTC 0147 CTGTTTCCCCGCCACACCCAGTGAAGGGCATGGGGTTCCGCAGAGGGAAAGGCCCGGCCGGACCAGTGC ACGCGGTGAGG 0148 CGGACCGGCCAGCCAGGCCCAAGGTTCAACTACGAGCTTTTTAACCACAACAACTTTAATATACGCTA。

40、T TGGAGCTGGAA 0149 TTACCGCGGCTGCTGGCACCAGACTTGCCCTCCAATTGTTCCTCGTTAAGGGATTTAAATTGTACTCAT TCCGCTTACAA 0150 GACCCAAAAGAGCCCTGTATCAGTATTTATTGTCACTACCTCCCCGTGTCGGGATTGGGTAATTTGCGC GCCTGCTGCCT 0151 TCCTTGGATGTAGTAGCCGTTTCTCAGGCTCCTTCTCCGGGGTCGAGCCCTAACCCTCCGTTACCCGTT GCCACCATGTT 0152 TGGCCAATACCCAAACATCG。

41、AAAGTTGATAGGGAAGAAATTTGAATGAGCCATCGCCGGCACAAGGCCT GTCGATTCGAC 0153 TAGTTATCATGATTCACCAGAGAGCCCCGAGGGGCATTGGTTTTTAATCTAATAAATACATCCCTTCCG AAGTCGGGATT 0154 TTCAGCATGTATTAGCTCTAGAATTACCACGGTTATCCAAGTAGTAAAGTATTATCAAATAAACGATAA CTTATATAATG 0155 AGCCATT 0156 (3) 真核表达重组载体的构建 0157 I、 设计含有 EcoR I 位点的上游引物 (F。

42、) 和含有 Not I 位点 (R) 的下游引物 ： 说 明 书 CN 102168080 B 9 8/9 页 10 0158 F ： 5 -GAAGAATTC ATGGCCATCATCCGTCGTCTT-3 0159 R ： 5 -CTTGCGGCCGC TTAAGCACTGTGTCCGTTGAAG-3 0160 模板为 pMDT-TvALP1， 进行 PCR 扩增， 扩增的 PCR 体系为 ： 0161 试剂 体积 0162 2 x PCR Master Mix 5L 0163 引物 F( 浓度为 10M) 1L 0164 引物 R( 浓度为 10M) 1L 0165 pMDT-TvALP。

43、1 5L 0166 灭菌水 定容至 50L 0167 反应条件 ： 0168 94 5min ； 0169 94 1min， 60 30s， 72 2min(35 个循环 ) ； 0170 72 10min ； 0171 4保存。 0172 用 EcoR I 和 Not I 分别双酶切目的片段和 pPICZA 载体 ( 购自 Invitrogen 公 司 )， 切胶回收。按目的片段和载体以摩尔比 3 1 的比例在 16 T4 DNA 连接酶的作 用下连接过夜， 连接产物转化大肠杆菌 E.coli DH5 感受态细胞， 涂布于含有 25mg/mL Zeocin 的 LB 选择性平板上， 37培养。

44、， 挑取单菌落进行 PCR 检测。将拟阳性克隆单菌落 接种于含 25mg/mL Zeocin 的 LB 培养基 (LB 培养基的组成为 ： 10g NaCl， 5g 酵母提取物， 10g 胰蛋白胨， pH7.0， 定容至 1000mL) 中振荡培养过夜， 碱裂解法提取质粒， 酶切鉴定重组 质粒。选取拟阳性克隆送上海英俊生物技术有限公司测序， 将鉴定正确的重组质粒命名 pPICZA-TvALP1。 0173 (4) 绿色木霉碱性蛋白酶 TvALP1 的表达和纯化 0174 将重组质粒 pPICZA-TvALP1 酶切线性化后转入毕赤酵母表达菌株 GS115( 购自 Invitrogen 公司 )。

45、 中。通过 PCR 鉴定转化成功之后， 将转化的单克隆重组酵母菌 GS115/ pPICZA-TvALP1 接种于 10mL BMGY 培养基 (1 wt 酵母提取物、 2 wt 蛋白胨、 1.34 wtYNB、 (410-5)生物素、 1 wt 甘油、 100mM 磷酸钾缓冲液， pH6.0)， 30、 240 280rpm 摇床培养 16 18h， 至菌体 OD600 值大于 2 时， 室温离心 5min 收获菌体。菌体沉淀用 20mL BMMY(1wt酵母提取物、 2wt蛋白胨、 1.34wt YNB、 (410-5)wt生物素、 0.5wt甲 醇、 100mM 磷酸钾缓冲液， pH6.。

46、0) 培养基悬浮， 30 240 280rpm 诱导培养 96h， 每 24h 向 培养基中补加甲醇至终浓度为 0.5 v/v， 以保证持续诱导表达， 并分别在 0、 24、 48、 72、 96h 取少量菌液， 并确定表达的最佳时间为 72 小时。诱导结束后， 胞外表达重组酵母菌 GS115/ pPICZA-TvALP1 的培养液 5000rpm 室温离心 10min 收集上清， -20保存备用 ； 胞内表达 重组酵母菌 GS115/pPICZA-TvALP1 的培养液 5000rpm 室温离心 10min 收集沉淀， -20保 存备用。 0175 向胞外表达重组酵母菌培养液所收集的上清中缓。

47、慢加入硫酸铵至 70饱和度， 冰上放置 30min， 4， 6000rmp 离心 10min 后沉淀用 4mL 50mM 磷酸钠缓冲液 (pH 7.4) 重 新溶解， 在 50mM 磷酸钠缓冲液 (pH 7.4)( 含 5mM DTT)4透析过夜。透析后的胞外表达 重组酵母中所提取的蛋白溶液分别加入 1mL50 Ni-NTA， 混匀后 4 200rpm 振荡 2h。将 说 明 书 CN 102168080 B 10 9/9 页 11 蛋白混合液加入 Novagen 公司的 Superflow 柱， 用 NTA-0 Buffer(20mM Tris-HCl pH7.9， 0.5M NaCl， 1。

48、0 Glycerol， 0mM Imidazole) 洗至蛋白峰降至水平 ； 用 NTA-20 Buffer(20mM Tris-HCl pH7.9， 0.5M NaCl， 10 Glycerol， 20mM Imidazole) 洗去非特异结合蛋白 ； 用洗 脱液 NTA-200Buffer(20mM Tris-HCl pH7.9， 0.5M NaCl， 10 Glycerol， 200mMImidazole) 洗脱目标蛋白， 将洗脱得到的目的蛋白用于 SDS-PAGE( 浓缩胶为 3， 分离胶为 12 ) 检测 ( 如图 2 所示 )， 确定得到大小为 40 道尔顿的目标蛋白酶。 0176。

49、 实施例 3 0177 TvALP1 蛋白的体外抑黄曲霉活性检测 0178 将纯化后的 TvALP1 蛋白酶通过考马斯亮蓝测定浓度后， 以黄曲霉 GIM3.17( 购自 中科院微生物所 ) 为指示菌进行体外抑制黄曲霉生长活性的检测。具体步骤为 ： 在 96 孔板 上加入100l的PDA液体培养基(马铃薯200g， 葡萄糖20g， pH6.8， 蒸馏水定容至1000ml) 和 20l 含 1105个黄曲霉 GIM3.17 孢子的悬液， 然后在孔中分别加入用二倍稀释法制成 的不同浓度的蛋白酶液各 100l， 使蛋白酶的最终浓度为 300g/ml 至 1g/ml(10 个浓 度 ) ； 用 100l 的 PBS(0.2mol/L， pH7.0) 处理作为阴性对照 ； 用 100l 的 5g/ml 的两性 霉素 B 处理作为阳性对照， 共 12 个处理， 每处理 3 个重复。