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多能干细胞的分化.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102159703 A (43)申请公布日 2011.08.17 CN 102159703 A *CN102159703A* (21)申请号 200980134123.1 (22)申请日 2009.06.30 61/076,915 2008.06.30 US 61/076,900 2008.06.30 US 61/076,908 2008.06.30 US C12N 5/06(2006.01) (71)申请人森托科尔奥索生物科技公司地址美国宾夕法尼亚州 (72)发明人 J刘 J戴维斯 C帕门特 PGA邦尼特 (74)专利代理机构中国专利代理(香港)有限公司。

2、72001 代理人李进刘健 (54) 发明名称多能干细胞的分化 (57) 摘要本发明涉及使多能干细胞分化的方法。具体来讲，本发明涉及使多能干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的方法和组合物，所述方法包括在培养基中培养所述多能干细胞，所述培养基包含足够量的 GDF-8 以引起所述多能干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。 (30)优先权数据 (85)PCT申请进入国家阶段日 2011.02.25 (86)PCT申请的申请数据 PCT/US2009/049183 2009.06.30 (87)PCT申请的公布数据 WO2010/002846 EN 。

3、2010.01.07 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书 1 页说明书 134 页附图 65 页 CN 102159709 A1/1 页 2 1. 一种使多能干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的方法，所述方法包括用培养基处理所述多能干细胞，持续足以使所述多能干细胞分化为表达所述定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的一段时间，所述培养基缺少激活素 A 且含有选自如下的化合物： EGF、 FGF4、 PDGF-A、 PDGF-B、 PDGF-C、 PDGF-D、 VEGF、 GDF-8、蝇蕈醇、 PD9805。

4、9、 LY294002、 U0124、 U0126 和丁酸钠。 2. 根据权利要求 1 所述的方法，其中所述缺少激活素 A 还含有至少一种其他选自如下的化合物：苯胺 - 吡啶并三嗪和环苯胺 - 吡啶并三嗪。权利要求书 CN 102159703 A CN 102159709 A1/134 页 3 多能干细胞的分化 0001 本发明要求于 2008 年 6 月 30 日提交的专利申请序列号 61/076,900、于 2008 年 6 月 30 日提交的专利申请序列号 61/076,908 以及于 2008 年 6 月 30 日提交的专利申请序列号 61/076,915 的优先。

5、权。背景技术 0002 本发明涉及使多能干细胞分化的方法。具体来讲，本发明涉及使多能干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的方法和组合物，该方法包括在培养基中培养多能干细胞，所述培养基包含足够量的 GDF-8 以引起多能干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。 0003 背景技术 0004 用于 I 型糖尿病的细胞替代疗法的进展以及可移植胰岛的缺乏已使得注意力集中在开发适于移植物移入的胰岛素生成细胞或细胞的来源上。一种方法是从多能干细胞，例如胚胎干细胞产生功能性细胞。 0005 在脊椎动物的胚胎发育中，多能干细胞可在称为原肠胚形成的过程中产生包括三。

6、个胚层 ( 外胚层、中胚层和内胚层 ) 的细胞群体。诸如甲状腺、胸腺、胰腺、肠和肝脏之类的组织将从内胚层，经由中间阶段发育而来。该过程中的中间阶段是形成定形内胚层。定形内胚层细胞表达多种标志物，例如， HNF-3、 GATA4、 MIXL1、 CXCR4 和 SOX17。 0006 定形内胚层分化成胰腺内胚层导致形成胰腺。胰腺内胚层细胞表达胰 - 十二指肠同源盒基因 Pdx1。在不存在 Pdx1 时，胰腺形成腹胰芽和背胰芽后不再发育。因而， Pdx1 表达标志着胰腺器官发生中的一个关键步骤。除了其他细胞类型，成熟的胰腺还包括外分泌组织和内分泌组织。外分泌和内分泌组织。

7、来自胰腺内胚层的分化。 0007 据报道，从小鼠的胚胎细胞衍生了带有胰岛细胞特征的细胞。例如， Lumelsky等人 (Science 292 ： 1389， 2001) 报道了小鼠胚胎干细胞向类似胰岛的胰岛素分泌结构的分化。 Soria 等人 (Diabetes 49 ： 157， 2000) 报道，衍生自小鼠胚胎干细胞的胰岛素分泌细胞使链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠中的血糖变正常。 0008 例如， Hori 等人 (PNAS 99 ： 16105， 2002) 揭示，用磷酸肌醇 3- 激酶 (LY294002) 的抑制剂处理小鼠胚胎干细胞产生了类似细胞的细胞。 0009 又如，。

8、 Blyszczuk 等人 (PNAS 100 ： 998， 2003) 报道，从组成型表达 Pax4 的小鼠胚胎干细胞产生了胰岛素生成细胞。 0010 Micallef 等人报道说，视黄酸可调节胚胎干细胞定向形成 Pdx1 阳性胰腺内胚层。在对应于胚胎的原肠胚形成末的期间，加入胚胎干细胞分化第 4 天的培养物中时视黄酸是诱导 Pdx1 最有效的 (Diabetes 54 ： 301， 2005)。 0011 Miyazaki 等人报道了过表达 Pdx1 的小鼠胚胎干细胞系。他们的结果显示，外源 Pdx1 表达在所得的分化细胞中明显增强了胰岛素、生长抑素、葡萄糖激酶、神经。

9、元素 3、 P48、 Pax6 和 HNF6 基因的表达 (Diabetes 53 ： 1030， 2004)。 0012 Skoudy等人报道说，激活素A(TGF-超家族的成员)能上调小鼠胚胎干细胞中的说明书 CN 102159703 A CN 102159709 A2/134 页 4 胰腺外分泌基因 (p48 和淀粉酶 ) 和内分泌基因 (Pdx1、胰岛素和胰高血糖素 ) 的表达。 0013 使用 1nM 激活素 A 时观察到最大的效果。他们还观察到，胰岛素和 Pdx1 mRNA 的表达水平不受视黄酸的影响；然而， 3nM FGF7 处理导致 Pdx1 的转录水平升高 (。

10、Biochem. J.379 ： 749， 2004)。 0014 Shiraki 等人研究了能特异性增强胚胎干细胞分化成 Pdx1 阳性细胞的生长因子的作用。他们观察到， TGF2 可再现地产生更高比例的 Pdx1 阳性细胞 (Genes Cells.2005 June ； 10(6) ： 503-16)。 0015 Gordon 等人阐明了在不存在血清的情况下和在存在激活素连同 Wnt 信号转导抑制剂的情况下从小鼠胚胎干细胞诱导 brachyury 阳性 /HNF-3 阳性内胚层细胞 (US 2006/0003446A1)。 0016 Gordon等人(PNAS，第103卷，第1。

11、6806页， 2006)声称：“Wnt和TGF-/nodal/激活素信号转导同时为前原条的产生所必需” 。 0017 然而，胚胎干细胞发育的小鼠模型可能不会完全模拟高等哺乳动物 ( 例如人 ) 中的发育程序。 0018 Thomson 等人从人胚泡分离了胚胎干细胞 (Science 282 ： 114， 1998)。同时， Gearhart 和其同事从胎儿生殖腺组织衍生了人胚胎生殖 (hEG) 细胞系 (Shamblott 等人， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95 ： 13726， 1998)。与可简单通过与白血病抑制因子 (LIF) 一起培养来防止分化的小鼠胚胎干。

12、细胞不一样，人胚胎干细胞必须维持在非常特殊的条件下 ( 美国专利 No.6,200,806、 WO99/20741、 WO 01/51616)。 0019 D Amour 等人描述了在高浓度激活素和低血清的存在下生产人胚胎干细胞衍生定形内胚层的富集培养基 (D Amour K A 等人， 2005)。将这些细胞移植到小鼠的肾囊下，导致分化成具有某些内胚层器官的特性的更成熟细胞。在加入 FGF-10 之后，人胚胎干细胞衍生的定形内胚层细胞可进一步分化成 Pdx1 阳性细胞 (US 2005/0266554A1)。 0020 D Amour 等人 (Nature Biotechnolog。

13、y-24， 1392-1401(2006) 声称：“我们已开发出使人胚胎干 (hES) 细胞转化成能够合成胰腺激素胰岛素、胰高血糖素、生长抑素、胰多肽和生长激素释放肽的内分泌细胞的分化方法。该方法通过引导细胞经过类似于定形内胚层、肠管内胚层、胰腺内胚层和内分泌前体的阶段转变为表达内分泌激素的细胞来模拟体内胰腺器官发生” 。 0021 又如， Fisk 等人报道了用于从人胚胎干细胞产生胰岛细胞的系统 (US2006/0040387A1)。在该情形中，分化途径分成三个阶段。首先，使用正丁酸盐和激活素 A 的组合，使人胚胎干。

14、细胞分化为内胚层。然后将细胞与 TGF- 拮抗剂 ( 例如成头蛋白 (Noggin) 结合 EGF 或细胞素一起进行培养，以产生 Pdx1 阳性细胞。通过烟酰胺诱导终末分化。 0022 在一个例子中， Benvenistry 等人声称：“我们得出如下结论： PDX1 的过量表达增强了胰腺富集基因(pancreatic enriched gene)的表达，胰岛素表达的诱导可能需要另外的仅存在于体内的信号” (Benvenistry 等人， StemCells 2006 ； 24 ： 1923-1930)。 0023 激活素A是表现出广泛生物活性的TGF-家族成员，所述生物活性包。

15、括调控细胞增殖和分化以及促进神经元存活。激活素 A 的分离和纯化通常是复杂的，通常会导致产率低。例如， Pangas， S.A. 和 Woodruff， T.K 声称：“抑制素和激活素是具有包括调节垂体 FSH 说明书 CN 102159703 A CN 102159709 A3/134 页 5 分泌在内的各种生理作用的蛋白质激素” 。类似于转化生长因子 -b 基因家族的其他成员，它们经历从较大前体分子加工以及组装成功能性二聚体。从天然来源分离抑制素和激活素仅能生产有限量的生物活性蛋白质 (J.Endocrinol.172(2002)199-210)。 0024 又如， Ar。

16、ai， K.Y.等人声称：“激活素是属于转化生长因子-b超级族的多功能生长因子。从天然来源分离激活素需要许多步骤并仅产生有限的量。尽管重组制剂已用于近来的研究，但重组激活素的纯化仍需要多个步骤” (Protein Expression and Purification 49(2006)78-82)。 0025 因此，仍存在对激活素 A 替代物的巨大需要，以便于多能干细胞的分化。发明内容 0026 在一个实施例中，本发明提供了使多能干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的方法，该方法包括在培养基中培养多能干细胞，所述培养基包含足够量的 GDF-8 以使多能干细胞分。

17、化为表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。 0027 在一个实施例中，所述包含足够量 GDF-8 的培养基还含有至少一种其他化合物。在一个实施例中，所述至少一种其他化合物是苯胺 - 吡啶并三嗪。在一个替代实施例中，所述至少一种其他化合物是环苯胺 - 吡啶并三嗪。附图说明 0028 图 1 显示 H1 人胚胎干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。分化通过使用 IN Cell Analyzer 1000(GE Healthcare) 测量细胞数目 ( 分图 A) 和 SOX17 强度 ( 分图 B) 来确定。用含有 20ng/ml Wnt3a 加指定浓度的激活素 A( 。

18、黑色柱条 ) 的培养基或缺少 Wnt3a 但具有指定浓度 ( 白色柱条 ) 的激活素 A 的培养基处理人胚胎干细胞总共四天。 0029 图 2 示出了用于使人胚胎干细胞系 H1 的细胞向表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化的激活素 A 和 GDF8 的剂量响应关系。将细胞用所示浓度的激活素 A 或 GDF8 处理总共三天，结合用 20ng/ml Wnt3a 处理测定法的第一天。分化通过使用荧光抗体探针以及在 GE Healthcare IN CellAnalyzer 上的高内涵分析来测量 SOX17 强度而确定。 0030 图 3 示出了根据实例 12 所述方法，在分化的第一个。

19、步骤后细胞中的 CXCR4 表达。将 H1 细胞进行如下处理：用 100ng/ml 激活素 A 或 200ng/mlGDF-8 处理总共三天，结合用 20ng/ml Wnt 3a 处理第一天或用 2.5M 化合物 34 或 2.5M 化合物 56 处理全部三天。 CXCR4 表达用荧光抗体探针和流式细胞术来测量，得到所示的阳性细胞百分比。 0031 图 4 示出了在根据实例 12 所述方法向定形内胚层分化三天后细胞中 SOX17 的表达。将 H1 细胞进行如下处理：用 100ng/ml 激活素 A 或 200ng/ml GDF-8 处理总共三天，结合用 20ng/ml Wn。

20、t 3a 处理第一天或用 2.5M 化合物 34 或 2.5M 化合物 56 处理全部三天。分化通过用荧光抗体探针和在 GE Healthcare IN Cell Analyzer 上的高内涵分析来测量 SOX17 强度 ( 黑色柱条 ) 和所得细胞数 ( 白色柱条 ) 而确定。 0032 图 5 示出了根据实例 12 所述方法，在分化的第三个步骤后细胞中的 PDX1 和 CDX2 蛋白表达。将 H1 细胞进行如下处理：用 100ng/ml 激活素 A 或 200ng/ml GDF-8 处理总共三天，结合用 20ng/ml Wnt 3a 处理第一天或用 2.5M 化合物 34 或。

21、 2.5M 化合物 56 处理全说明书 CN 102159703 A CN 102159709 A4/134 页 6 部三天，接着通过分化的第二个和第三个步骤进行后续分化。对于每个处理组，描述了用荧光抗体探针和高内涵分析法确定的蛋白质表达和细胞数。为了进行比较，将值相对于使用激活素 A/Wnt3a 的处理进行归一化。 0033 图 6 示出了根据实例 12 所述方法，在分化的第四个步骤后细胞中 PDX1 蛋白的表达 ( 白色柱条 ) 和细胞数 ( 黑色柱条 )。将 H1 细胞进行如下处理：用 100ng/ml 激活素 A 或 200ng/ml GDF-8 处理总共三天。

22、，结合用 20ng/ml Wnt 3a 处理第一天或结合用 2.5M 化合物 34 或 2.5M 化合物 56 处理全部三天，接着通过分化的第二个、第三个和第四个步骤进行后续分化。对于每个处理组，描述了用荧光抗体探针和高内涵分析法确定的蛋白质表达和细胞数。为了进行比较，将值相对于使用激活素 A/Wnt3a 的处理进行归一化。 0034 图 7 示出了根据实例 12 所述方法分化的细胞中的胰岛素和胰高血糖素的蛋白质表达和细胞数。将 H1 细胞进行如下处理：用 100ng/ml 激活素 A 或 200ng/ml GDF-8 处理总共三天，结合用 20ng/ml Wnt 3。

23、a 处理第一天或结合用 2.5M 化合物 34 或 2.5M 化合物 56 处理全部三天，接着通过分化的第二个、第三个、第四个和第五个步骤进行后续分化。对于每个处理组，描述了用荧光抗体探针和高内涵分析法确定的蛋白质表达和细胞数。为了进行比较，将值相对于使用激活素 A/Wnt3a 的处理进行归一化。 0035 图 8 示出了根据实例 13 所述方法，在向定形内胚层分化后人胚胎干细胞中的 SOX17 蛋白表达和细胞数。将 H1 细胞进行如下处理：用 100ng/ml 激活素 A 或 100ng/ml GDF- 生长因子处理总共四天，结合用 20ng/ml Wnt 3a 处理第。

24、一天或结合用 2.5M 化合物 34 或 2.5M 化合物 56 处理测定法的开始两天。对于各处理组，描述了用荧光抗体探针和高内涵分析确定的 SOX17 蛋白表达 ( 黑色柱条 ) 和细胞数 ( 白色柱条 )。为了进行比较，将值相对于使用激活素 A/Wnt3a 的处理进行归一化。分图 8A 示出了在不存在任何生长因子 ( 无 ) 或用激活素 A/Wnt3a 处理 (AA/Wnt3a) 或单独使用各试剂时进行分化的一系列控制条件。分图 8B 示出了单独用 GDF-3 或其与 Wnt3a、化合物 34 或化合物 56 的多种组合进行的分化。分图 8C 示出了单独用 GDF-5 或其与。

25、 Wnt3a、化合物 34 或化合物 56 的多种组合进行的分化。分图 8D 示出了单独用 GDF8 或其与 Wnt3a、化合物 34 或化合物 56 的多种组合进行的分化。分图 8E 示出了单独用 GDF-10 或其与 Wnt3a、化合物 34 或化合物 56 的多种组合进行的分化。分图 8F 示出了单独用 GDF-11 或其与 Wnt3a、化合物 34 或化合物 56 的多种组合进行的分化。分图 8G 示出了单独用 GDF-15 或其与 Wnt3a、化合物 34 或化合物 56 的多种组合进行的分化。 0036 图 9 示出了根据实例 14 所述方法，在向定形内胚层分化。

26、后人胚胎干细胞中的 SOX17蛋白表达。将H1细胞进行如下处理：用100ng/ml的激活素A或所示浓度的多种生长因子处理总共三天，结合用 20ng/ml Wnt 3a 或结合用 2.5M 化合物 34 处理测定法的第一天。对于每个处理组，描述了用荧光抗体探针和高内涵分析确定的 SOX17 蛋白表达 ( 黑色柱条 ) 和细胞数 ( 白色柱条 )。为了进行比较，将值相对于使用激活素 A/Wnt3a 的处理进行归一化。分图 9A 示出了用单独的 Wnt3a 或不存在任何生长因子 ( 无 ) 或用激活素 A/Wnt3a 处理 (AA/Wnt3a) 进行分化的一系列控制条件。分图 9。

27、B 示出了用所示浓度的 GDF-8( 供货商 PeproTech) 结合 20ng/ml Wnt3a 进行的分化。分图 9C 示出了用所示浓度的 GDF-8( 供货商 Shenendoah) 结合 20ng/ml Wnt3a 进行的分化。分图 9D 示出了用所示浓度的 TGF1 与 Wnt3a 或化合物 34 的多种组合进行的分化。分图 9E 示出了用所示浓度的 BMP2 与 Wnt3a 说明书 CN 102159703 A CN 102159709 A5/134 页 7 或化合物 34 的多种组合进行的分化。分图 9F 示出了用所示浓度的 BMP3 与 Wnt3a 或化合物 34 。

28、的多种组合进行的分化。分图 9G 示出了用所示浓度的 BMP4 与 Wnt3a 或化合物 34 的多种组合进行的分化。 0037 图 10 示出了根据实例 15 所述方法，在向定形内胚层分化后人胚胎干细胞中的 SOX17 蛋白表达。将 H1 细胞在多种定时暴露方案中暴露于如下物质总共处理三天： 100ng/ ml 激活素 A 或 100ng/ml GDF-8 结合 20ng/mlWnt3a。用荧光抗体探针和高内涵分析确定的 SOX17 蛋白表达显示为各处理组的总强度值，从而测试没有添加生长因子 ( 无处理 )、单独添加Wnt3a、单独添加激活素A或GDF-8或采用激活素A/Wnt。

29、3a处理或GDF-8/Wnt3a处理情况下进行分化的控制条件，其中如所示出的仅在测定法的第一天添加 Wnt3a 或在测定法的全部三天添加 Wnt3a。 0038 图 11 示出了根据实例 15 所述方法，在向定形内胚层分化后人胚胎干细胞中的 SOX17 蛋白表达。将 H1 细胞在多种定时暴露方案中暴露于如下物质而总共处理三天： 100ng/ml激活素A结合所示浓度的测试化合物(化合物181(分图A)、化合物180(分图B)、化合物 19( 分图 C)、化合物 202( 分图 D)、化合物 40( 分图 E)、化合物 34( 分图 F) 或 GSK3 抑制剂 BIO( 分图。

30、G)，其中仅在测定法的第一天添加测试化合物。用荧光抗体探针和高内涵分析确定的 SOX17 的蛋白质表达通过总强度值来描述。 0039 图 12 示出了根据实例 15 所述方法，在向定形内胚层分化后人胚胎干细胞中的 SOX17 蛋白表达。将 H1 细胞在多种定时暴露方案中暴露于如下物质而总共处理三天： 100ng/ml激活素A结合所示浓度的测试化合物(化合物181(分图A)、化合物180(分图B)、化合物 19( 分图 C)、化合物 202( 分图 D)、化合物 40( 分图 E)、化合物 34( 分图 F) 或 GSK3 抑制剂 BIO( 分图 G)，其中在测定法的全部三天。

31、添加测试化合物。用荧光抗体探针和高内涵分析确定的 SOX17 的蛋白质表达通过总强度值来描述。 0040 图 13 示出了根据实例 15 所述方法，在向定形内胚层分化后人胚胎干细胞中的 SOX17 蛋白表达。将 H1 细胞在多种定时暴露方案中暴露于如下物质而总共处理三天： 100ng/ml的GDF-8结合所示浓度的测试化合物(化合物181(分图A)、化合物180(分图B)、化合物 19( 分图 C)、化合物 202( 分图 D)、化合物 40( 分图 E)、化合物 34( 分图 F) 或 GSK3 抑制剂 BIO( 分图 G)，其中仅在测定法的第一天添加测试化合物。用荧光抗体。

32、探针和高内涵分析确定的 SOX17 的蛋白质表达通过总强度值来描述。 0041 图 14 示出了根据实例 15 所述方法，在向定形内胚层分化后人胚胎干细胞中的 SOX17 蛋白表达。将 H1 细胞在多种定时暴露方案中暴露于如下物质而总共处理三天： 100ng/ml的GDF-8结合所示浓度的测试化合物(化合物181(分图A)、化合物180(分图B)、化合物 19( 分图 C)、化合物 202( 分图 D)、化合物 40( 分图 E)、化合物 34( 分图 F) 或 GSK3 抑制剂 BIO( 分图 G)，其中在测定法的全部三天添加测试化合物。用荧光抗体探针和高内涵分析确定的。

33、SOX17 的蛋白质表达通过总强度值来描述。 0042 图 15 示出了根据实例 15 所述方法，在人胚胎干细胞向定形内胚层分化后的细胞数产率。将 H1 细胞在多种定时暴露方案中暴露于如下物质而总共处理三天： 100ng/ml 激活素A或100ng/ml GDF-8结合20ng/ml Wnt3a。显示了各测试组的用荧光抗体探针和高内涵分析确定的细胞数，从而测试没有添加生长因子(无处理)、单独添加Wnt3a、单独添加激活素 A 或 GDF-8 或采用激活素 A/Wnt3a 处理或 GDF-8/Wnt3a 处理情况下进行分化的控制条说明书 CN 102159703 A C。

34、N 102159709 A6/134 页 8 件，其中如所示出的仅在测定法的第一天或在测定法的全部三天添加 Wnt3a。 0043 图 16 示出了根据实例 15 所述方法，在人胚胎干细胞向定形内胚层分化后的细胞数产率。将H1细胞在多种定时暴露方案中暴露于如下物质而总共处理三天： 100ng/ml激活素A结合所示浓度的测试化合物(化合物181(分图A)、化合物180(分图B)、化合物19(分图 C)、化合物 202( 分图 D)、化合物 40( 分图 E)、化合物 34( 分图 F) 或 GSK3 抑制剂 BIO( 分图G)，其中仅在测定法的第一天添加测试化合物。。

35、示出了用荧光核探针和高内涵分析确定的细胞数产率。 0044 图 17 示出了根据实例 15 所述方法，在人胚胎干细胞向定形内胚层分化后的细胞数产率。将H1细胞在多种定时暴露方案中暴露于如下物质而总共处理三天： 100ng/ml激活素A结合所示浓度的测试化合物(化合物181(分图A)、化合物180(分图B)、化合物19(分图 C)、化合物 202( 分图 D)、化合物 40( 分图 E)、化合物 34( 分图 F) 或 GSK3 抑制剂 BIO( 分图G)，其中在测定法的全部三天添加测试化合物。示出了用荧光核探针和高内涵分析确定的细胞数产率。 0045 图 18 。

36、示出了根据实例 15 所述方法，在人胚胎干细胞向定形内胚层分化后的细胞数产率。将 H1 细胞在多种定时暴露方案中暴露于如下物质而总共处理三天： 100ng/ml 的 GDF-8 结合所示浓度的测试化合物 ( 化合物 181( 分图 A)、化合物 180( 分图 B)、化合物 19( 分图 C)、化合物 202( 分图 D)、化合物 40( 分图 E)、化合物 34( 分图 F) 或 GSK3 抑制剂 BIO( 分图 G)，其中仅在测定法的第一天添加测试化合物。示出了用荧光核探针和高内涵分析确定的细胞数产率。 0046 图 19 示出了根据实例 15 所述方法，在人胚胎干细。

37、胞向定形内胚层分化后的细胞数产率。将 H1 细胞在多种定时暴露方案中暴露于如下物质而总共处理三天： 100ng/ml 的 GDF-8 结合所示浓度的测试化合物 ( 化合物 181( 分图 A)、化合物 180( 分图 B)、化合物 19( 分图 C)、化合物 202( 分图 D)、化合物 40( 分图 E)、化合物 34( 分图 F) 或 GSK3 抑制剂 BIO( 分图 G)，其中在测定法的全部三天添加测试化合物。示出了用荧光核探针和高内涵分析确定的细胞数产率。 0047 图 20 示出了根据实例 16 所述方法，在分化的全部多个步骤中细胞中的多种蛋白质标志物表达。将。

38、H1 细胞进行如下处理：用 100ng/ml 激活素 A 或 100ng/ml GDF-8 处理总共三天，结合用20ng/ml Wnt3a处理第一天或结合用仅在第一天添加的2.5M多种化合物 ( 化合物 19、化合物 202、化合物 40 或 GSK3 抑制剂 BIO) 处理。图 20 分图 A 示出了在分化的第一个步骤后的细胞中，定形内胚层标志物 CXCR4 的 FACS 分析。CXCR4 表达用荧光抗体探针和流式细胞术来测量，得到所示的阳性细胞百分比。图 20 分图 B 示出了由分化的第一个步骤产生的归一化 SOX17 蛋白表达 ( 黑色柱条 ) 和回收细胞数 ( 白。

39、色柱条 ) 的高内涵图像分析，从而测试了所示的对应处理。图 20 分图 C 示出了从通过分化步骤 5 处理的培养物回收的相对细胞数的高内涵图像分析。图 20 分图 D 示出了通过分化步骤 5 处理的培养物的胰高血糖素蛋白表达的高内涵图像分析。图 20 分图 E 示出了通过分化步骤 5 处理的培养物的胰岛素蛋白表达的高内涵图像分析。图 20 分图 F 示出了通过分化步骤 5 处理的培养物的细胞中胰高血糖素与胰岛素表达的比率。为了进行比较，分图 B、 C、 D、 E 和 F 中的表达值相对于在步骤 1 期间使用激活素 A 和 Wnt3a 的对照处理进行归一化。 0048 图 21 。

40、示出了根据实例 17 所述方法，在分化的全部多个步骤中细胞中的多种蛋白说明书 CN 102159703 A CN 102159709 A7/134 页 9 质和 RT-PCR 标志物的表达。将 H1 细胞进行如下处理：用 100ng/ml 激活素 A 或 100ng/ml GDF-8 处理总共三天，结合用 20ng/ml Wnt3a 处理第一天或结合用仅在第一天添加的如下浓度的多种化合物 ( 化合物 181、化合物 180、化合物 19、化合物 202、化合物 40、化合物 56 或 GSK3 抑制剂 BIO) 处理。示出了在分化的第一个步骤后细胞中定形内胚层标志物。

41、CXCR4 的 FACS 分析，其中处理包括激活素 A( 分图 A) 或 GDF-8( 分图 B) 与 Wnt3a 或多种化合物的组合。 CXCR4表达用荧光抗体探针和流式细胞术来测量，得到所示的阳性细胞百分比。在图 21 的后续分图中，示出了通过在分化的第一个步骤期间使用激活素 A 或 GDF-8 进行的各种处理后多种分化标志物的归一化 RT-PCR 值：结合激活素 A( 分图 C) 或 GDF-8( 分图 D) 进行处理的分化的第一个步骤结束时的标志物；结合激活素 A( 分图 E) 或 GDF-8( 分图 F) 进行处理的分化的第三个步骤结束时的标志物；结合激活。

42、素 A( 分图 G) 或 GDF-8( 分图 H) 进行处理的分化的第四个步骤结束时的标志物；结合激活素 A( 分图 I) 或 GDF-8( 分图 J) 进行处理的分化的第五个步骤结束时的标志物。在分化的第五个步骤结束时，进行高内涵分析以测量在使用激活素 A( 分图 K) 或 GDF-8( 分图 M) 的分化的第一个步骤期间对应处理的回收细胞数。高内涵分析还用于测量在分化的第五个步骤结束时回收细胞群体中的胰高血糖素和胰岛素强度，对应于在分化的第一个步骤期间用激活素 A( 分图 A) 或 GDF-8( 分图 N) 进行的处理。 0049 图 22 示出了根据实例 18 所述方。

43、法处理的细胞中多种蛋白质和 RT-PCR 标志物的表达。将 H1 细胞进行如下处理：用 100ng/ml 激活素 A 或 100ng/mlGDF-8 处理总共三天，结合用 20ng/ml Wnt3a 处理第一天或仅在第一天结合使用 2.5M 化合物 40 或 2.5M 化合物 202 处理全部三天。图 22 分图 A 示出了在分化的第一个步骤后的细胞中，定形内胚层标志物 CXCR4 的 FACS 分析。CXCR4 表达用荧光抗体探针和流式细胞术来测量，得到所示的阳性细胞百分比。在图 22 分图 B 中，示出了与在分化的第一个步骤期间使用激活素 A/Wnt3a 或 GDF-。

44、8/ 化合物 40 或 GDF-8/ 化合物 202 进行的各种处理相对应的分化的第四个步骤后回收的细胞中多种分化标志物的归一化 RT-PCR 值。 0050 图 23 示出了在接受如实例 18 所述分化方案第四个步骤结束时的细胞的 SCID-beige 小鼠中检测到的 C 肽水平。 0051 图 24 分图 A 示出了在实例 19 所述分化方案的第一个步骤结束时细胞中由 FACS 确定的 CXCR4 表达。分图 B 示出了在实例 19 所述分化方案的第四个步骤结束时细胞中由 RT-PCR 确定的多种基因的表达。示出了两次不同的实验重复 ( 重复 1 和重复 2)，每一者均经历相同的处理。

45、方案。分图 C 示出了接受了细胞的 SCID-beige 小鼠中检测到的 C 肽水平，所述细胞是在体外分化的第一个步骤期间用GDF-8和Wnt3a处理的分化方案的步骤四结束时的细胞。分图 D 示出了接受了细胞的 SCID-beige 小鼠中检测到的 C 肽水平，所述细胞是在体外分化的第一个步骤期间用 GDF-8 和化合物 28 处理的分化方案的步骤四结束时的细胞。 0052 图 25 示出了根据实例 22 所述的本发明方法处理过的微载体珠上生长的细胞的细胞数 ( 分图 A) 和 CXCR4 表达 ( 分图 B)。将细胞在未处理的 Cytodex3 珠上培养 ( 未分化 ) 或在用。

46、 100ng/ml 激活素 A 与 20ng/ml Wnt3a 组合进行处理的 Cytodex3 珠上培养 (AA/Wnt3a) 或在采用了多种如下的组合 GDF-8 进行的处理的 Cytodex3 珠上培养： 50ng/ml GDF-8 与 2.5M 化合物 34( 化合物 34+8) ；或 50ng/ml GDF-8 与 2.5M 化合物 34 和 50ng/ 说明书 CN 102159703 A CN 102159709 A8/134 页 10 ml PDGF(化合物34+8+D) ；或50ng/ml GDF-8与2.5M化合物34和50ng/mlPDGF及50ng/ ml V。

47、EGF( 化合物 34+8+D+V) ；或 50ng/ml GDF-8 与 2.5M 化合物 34 和 50ng/ml PDGF 以及 50ng/ml VEGF 和 20ng/ml 蝇蕈醇 ( 化合物 34+8+D+V+M)。 0053 图 26 示出了如实例 23 所述在用本发明化合物处理后细胞的增殖。分图 B 至分图 I示出了使用化合物结合GDF-8的处理并在开始分化测定法后的第1天、第2天和第3天测量 MTS OD 读数的分析结果。 0054 图 27 示出了在根据本发明方法处理过的微载体珠上生长细胞的多种蛋白质和基因的表达。分图 A 示出了在实例 24 所述分化方案的步骤一结束。

48、时细胞中由 FACS 确定的 CXCR4、 CD99 和 CD9 的阳性表达百分比。分图 B 示出了从显示分化通过分化方案步骤三的处理回收的细胞。分图 C 示出了如在步骤中所示地处理并通过该方案的步骤三分化的细胞中表达的多种基因标志物的 ddCT 值。具体实施方式 0055 将本发明的具体实施方式部分分成以下几个分部分，来描述或举例说明本发明的某些特征、实施例或应用，这是为了使公开内容清楚起见，并非限制本发明。 0056 定义 0057 干细胞是由它们在单细胞水平上既自我更新又分化产生子代细胞的能力来定义的未分化细胞，包括自我更新祖细胞、非更新祖细胞和末端分化细胞。干细胞。

49、的特征还在于：其具有在体外由多种胚层(内胚层、中胚层和外胚层)分化成各种细胞谱系的功能细胞以及移植后产生多种胚层的组织和注入胚泡后基本上有助于大部分 ( 如果不是所有的话 ) 组织形成的能力。 0058 干细胞根据其发育潜能分为： (1) 全能，指能够产生所有的胚胎和胚胎外细胞类型； (2) 多能，指能够产生所有的胚胎细胞类型； (3) 专能，指能够产生细胞谱系的亚群，但在特定组织、器官或生理系统内能产生所有的细胞 ( 例如造血干细胞 (HSC) 可产生的后代细胞包括： HSC( 自我更新型 )、局限于血细胞的寡能祖细胞以及作为血液正常组分的所有细胞类型和成分 ( 如血小板 ) ； (4) 寡能，指能够产生比多能干细胞更有限的细胞谱系亚群；以及 (5) 单能干，指能够产生单一细胞谱系 ( 如生精干细胞 )。 0059 分化是未特化的 (“未定向的” ) 或特化不足的细胞获得特化细胞 ( 如神经细胞或肌肉细胞 ) 的特征的过程。分化的细胞或诱导分化的细胞是已经在细胞谱系中占据更特化的 (“定向的” ) 位置的细胞。术语 “定向的” 当应用到分化的过程时，指在分化途径中已经进行到这么一种程度的细胞：在正常环境下，它会继续分化成特定的细胞类型或细胞类型子集，且在。

摘要
申请专利号：	CN200980134123.1	申请日：	20090630
公开号：	CN102159703A	公开日：	20110817
当前法律状态：		有效性：	有效
法律详情：
IPC分类号：	C12N5/06	主分类号：	C12N5/06
申请人：	森托科尔奥索生物科技公司
发明人：	J·刘,J·戴维斯,C·帕门特,P·G·A·邦尼特
地址：	美国宾夕法尼亚州
优先权：	61/076,915,61/076,900,61/076,908
专利代理机构：	中国专利代理(香港)有限公司	代理人：	李进;刘健
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内容摘要

本发明涉及使多能干细胞分化的方法。具体来讲，本发明涉及使多能干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的方法和组合物，所述方法包括在培养基中培养所述多能干细胞，所述培养基包含足够量的GDF-8以引起所述多能干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。

权利要求书

1.一种使多能干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的方法，所述方法包括用培养基处理所述多能干细胞，持续足以使所述多能干细胞分化为表达所述定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的一段时间，所述培养基缺少激活素A且含有选自如下的化合物：EGF、FGF4、PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D、VEGF、GDF-8、蝇蕈醇、PD98059、LY294002、U0124、U0126和丁酸钠。 2.根据权利要求1所述的方法，其中所述缺少激活素A还含有至少一种其他选自如下的化合物：苯胺-吡啶并三嗪和环苯胺-吡啶并三嗪。

说明书

本发明要求于2008年6月30日提交的专利申请序列号61/076,900、于2008年6月30日提交的专利申请序列号61/076,908以及于2008年6月30日提交的专利申请序列号61/076,915的优先权。

背景技术

本发明涉及使多能干细胞分化的方法。具体来讲，本发明涉及使多能干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的方法和组合物，该方法包括在培养基中培养多能干细胞，所述培养基包含足够量的GDF-8以引起多能干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。

背景技术

用于I型糖尿病的细胞替代疗法的进展以及可移植胰岛的缺乏已使得注意力集中在开发适于移植物移入的胰岛素生成细胞或β细胞的来源上。一种方法是从多能干细胞，例如胚胎干细胞产生功能性β细胞。

在脊椎动物的胚胎发育中，多能干细胞可在称为原肠胚形成的过程中产生包括三个胚层(外胚层、中胚层和内胚层)的细胞群体。诸如甲状腺、胸腺、胰腺、肠和肝脏之类的组织将从内胚层，经由中间阶段发育而来。该过程中的中间阶段是形成定形内胚层。定形内胚层细胞表达多种标志物，例如，HNF-3β、GATA4、MIXL1、CXCR4和SOX17。

定形内胚层分化成胰腺内胚层导致形成胰腺。胰腺内胚层细胞表达胰-十二指肠同源盒基因Pdx1。在不存在Pdx1时，胰腺形成腹胰芽和背胰芽后不再发育。因而，Pdx1表达标志着胰腺器官发生中的一个关键步骤。除了其他细胞类型，成熟的胰腺还包括外分泌组织和内分泌组织。外分泌和内分泌组织来自胰腺内胚层的分化。

据报道，从小鼠的胚胎细胞衍生了带有胰岛细胞特征的细胞。例如，Lumelsky等人(Science 292：1389，2001)报道了小鼠胚胎干细胞向类似胰岛的胰岛素分泌结构的分化。Soria等人(Diabetes 49：157，2000)报道，衍生自小鼠胚胎干细胞的胰岛素分泌细胞使链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠中的血糖变正常。

例如，Hori等人(PNAS 99：16105，2002)揭示，用磷酸肌醇3-激酶(LY294002)的抑制剂处理小鼠胚胎干细胞产生了类似β细胞的细胞。

又如，Blyszczuk等人(PNAS 100：998，2003)报道，从组成型表达Pax4的小鼠胚胎干细胞产生了胰岛素生成细胞。

Micallef等人报道说，视黄酸可调节胚胎干细胞定向形成Pdx1阳性胰腺内胚层。在对应于胚胎的原肠胚形成末的期间，加入胚胎干细胞分化第4天的培养物中时视黄酸是诱导Pdx1最有效的(Diabetes 54：301，2005)。

Miyazaki等人报道了过表达Pdx1的小鼠胚胎干细胞系。他们的结果显示，外源Pdx1表达在所得的分化细胞中明显增强了胰岛素、生长抑素、葡萄糖激酶、神经元素3、P48、Pax6和HNF6基因的表达(Diabetes 53：1030，2004)。

Skoudy等人报道说，激活素A(TGF-β超家族的成员)能上调小鼠胚胎干细胞中的胰腺外分泌基因(p48和淀粉酶)和内分泌基因(Pdx1、胰岛素和胰高血糖素)的表达。

使用1nM激活素A时观察到最大的效果。他们还观察到，胰岛素和Pdx1 mRNA的表达水平不受视黄酸的影响；然而，3nM FGF7处理导致Pdx1的转录水平升高(Biochem.J.379：749，2004)。

Shiraki等人研究了能特异性增强胚胎干细胞分化成Pdx1阳性细胞的生长因子的作用。他们观察到，TGFβ2可再现地产生更高比例的Pdx1阳性细胞(Genes Cells.2005 June；10(6)：503-16)。

Gordon等人阐明了在不存在血清的情况下和在存在激活素连同Wnt信号转导抑制剂的情况下从小鼠胚胎干细胞诱导brachyury[阳性]/HNF-3β[阳性]内胚层细胞(US 2006/0003446A1)。

Gordon等人(PNAS，第103卷，第16806页，2006)声称：“Wnt和TGF-β/nodal/激活素信号转导同时为前原条的产生所必需”。

然而，胚胎干细胞发育的小鼠模型可能不会完全模拟高等哺乳动物(例如人)中的发育程序。

Thomson等人从人胚泡分离了胚胎干细胞(Science 282：114，1998)。同时，Gearhart和其同事从胎儿生殖腺组织衍生了人胚胎生殖(hEG)细胞系(Shamblott等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：13726，1998)。与可简单通过与白血病抑制因子(LIF)一起培养来防止分化的小鼠胚胎干细胞不一样，人胚胎干细胞必须维持在非常特殊的条件下(美国专利No.6,200,806、WO99/20741、WO 01/51616)。

D′Amour等人描述了在高浓度激活素和低血清的存在下生产人胚胎干细胞衍生定形内胚层的富集培养基(D′Amour K A等人，2005)。将这些细胞移植到小鼠的肾囊下，导致分化成具有某些内胚层器官的特性的更成熟细胞。在加入FGF-10之后，人胚胎干细胞衍生的定形内胚层细胞可进一步分化成Pdx1阳性细胞(US 2005/0266554A1)。

D′Amour等人(Nature Biotechnology-24，1392-1401(2006))声称：“我们已开发出使人胚胎干(hES)细胞转化成能够合成胰腺激素胰岛素、胰高血糖素、生长抑素、胰多肽和生长激素释放肽的内分泌细胞的分化方法。该方法通过引导细胞经过类似于定形内胚层、肠管内胚层、胰腺内胚层和内分泌前体的阶段转变为表达内分泌激素的细胞来模拟体内胰腺器官发生”。

又如，Fisk等人报道了用于从人胚胎干细胞产生胰岛细胞的系统(US2006/0040387A1)。在该情形中，分化途径分成三个阶段。首先，使用正丁酸盐和激活素A的组合，使人胚胎干细胞分化为内胚层。然后将细胞与TGF-β拮抗剂(例如成头蛋白(Noggin))结合EGF或β细胞素一起进行培养，以产生Pdx1阳性细胞。通过烟酰胺诱导终末分化。

在一个例子中，Benvenistry等人声称：“我们得出如下结论：PDX1的过量表达增强了胰腺富集基因(pancreatic enriched gene)的表达，胰岛素表达的诱导可能需要另外的仅存在于体内的信号”(Benvenistry等人，StemCells 2006；24：1923-1930)。

激活素A是表现出广泛生物活性的TGF-β家族成员，所述生物活性包括调控细胞增殖和分化以及促进神经元存活。激活素A的分离和纯化通常是复杂的，通常会导致产率低。例如，Pangas，S.A.和Woodruff，T.K声称：“抑制素和激活素是具有包括调节垂体FSH分泌在内的各种生理作用的蛋白质激素”。类似于转化生长因子-b基因家族的其他成员，它们经历从较大前体分子加工以及组装成功能性二聚体。从天然来源分离抑制素和激活素仅能生产有限量的生物活性蛋白质(J.Endocrinol.172(2002)199-210)。

又如，Arai，K.Y.等人声称：“激活素是属于转化生长因子-b超级族的多功能生长因子。从天然来源分离激活素需要许多步骤并仅产生有限的量。尽管重组制剂已用于近来的研究，但重组激活素的纯化仍需要多个步骤”(Protein Expression and Purification 49(2006)78-82)。

因此，仍存在对激活素A替代物的巨大需要，以便于多能干细胞的分化。

发明内容

在一个实施例中，本发明提供了使多能干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的方法，该方法包括在培养基中培养多能干细胞，所述培养基包含足够量的GDF-8以使多能干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。

在一个实施例中，所述包含足够量GDF-8的培养基还含有至少一种其他化合物。在一个实施例中，所述至少一种其他化合物是苯胺-吡啶并三嗪。在一个替代实施例中，所述至少一种其他化合物是环苯胺-吡啶并三嗪。

附图说明

图1显示H1人胚胎干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。分化通过使用IN Cell Analyzer 1000(GE Healthcare)测量细胞数目(分图A)和SOX17强度(分图B)来确定。用含有20ng/ml Wnt3a加指定浓度的激活素A(黑色柱条)的培养基或缺少Wnt3a但具有指定浓度(白色柱条)的激活素A的培养基处理人胚胎干细胞总共四天。

图2示出了用于使人胚胎干细胞系H1的细胞向表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化的激活素A和GDF8的剂量响应关系。将细胞用所示浓度的激活素A或GDF8处理总共三天，结合用20ng/ml Wnt3a处理测定法的第一天。分化通过使用荧光抗体探针以及在GE Healthcare IN CellAnalyzer上的高内涵分析来测量SOX17强度而确定。

图3示出了根据实例12所述方法，在分化的第一个步骤后细胞中的CXCR4表达。将H1细胞进行如下处理：用100ng/ml激活素A或200ng/mlGDF-8处理总共三天，结合用20ng/ml Wnt 3a处理第一天或用2.5μM化合物34或2.5μM化合物56处理全部三天。CXCR4表达用荧光抗体探针和流式细胞术来测量，得到所示的阳性细胞百分比。

图4示出了在根据实例12所述方法向定形内胚层分化三天后细胞中SOX17的表达。将H1细胞进行如下处理：用100ng/ml激活素A或200ng/ml GDF-8处理总共三天，结合用20ng/ml Wnt 3a处理第一天或用2.5μM化合物34或2.5μM化合物56处理全部三天。分化通过用荧光抗体探针和在GE Healthcare IN Cell Analyzer上的高内涵分析来测量SOX17强度(黑色柱条)和所得细胞数(白色柱条)而确定。

图5示出了根据实例12所述方法，在分化的第三个步骤后细胞中的PDX1和CDX2蛋白表达。将H1细胞进行如下处理：用100ng/ml激活素A或200ng/ml GDF-8处理总共三天，结合用20ng/ml Wnt 3a处理第一天或用2.5μM化合物34或2.5μM化合物56处理全部三天，接着通过分化的第二个和第三个步骤进行后续分化。对于每个处理组，描述了用荧光抗体探针和高内涵分析法确定的蛋白质表达和细胞数。为了进行比较，将值相对于使用激活素A/Wnt3a的处理进行归一化。

图6示出了根据实例12所述方法，在分化的第四个步骤后细胞中PDX1蛋白的表达(白色柱条)和细胞数(黑色柱条)。将H1细胞进行如下处理：用100ng/ml激活素A或200ng/ml GDF-8处理总共三天，结合用20ng/ml Wnt 3a处理第一天或结合用2.5μM化合物34或2.5μM化合物56处理全部三天，接着通过分化的第二个、第三个和第四个步骤进行后续分化。对于每个处理组，描述了用荧光抗体探针和高内涵分析法确定的蛋白质表达和细胞数。为了进行比较，将值相对于使用激活素A/Wnt3a的处理进行归一化。

图7示出了根据实例12所述方法分化的细胞中的胰岛素和胰高血糖素的蛋白质表达和细胞数。将H1细胞进行如下处理：用100ng/ml激活素A或200ng/ml GDF-8处理总共三天，结合用20ng/ml Wnt 3a处理第一天或结合用2.5μM化合物34或2.5μM化合物56处理全部三天，接着通过分化的第二个、第三个、第四个和第五个步骤进行后续分化。对于每个处理组，描述了用荧光抗体探针和高内涵分析法确定的蛋白质表达和细胞数。为了进行比较，将值相对于使用激活素A/Wnt3a的处理进行归一化。

图8示出了根据实例13所述方法，在向定形内胚层分化后人胚胎干细胞中的SOX17蛋白表达和细胞数。将H1细胞进行如下处理：用100ng/ml激活素A或100ng/ml GDF-生长因子处理总共四天，结合用20ng/ml Wnt 3a处理第一天或结合用2.5μM化合物34或2.5μM化合物56处理测定法的开始两天。对于各处理组，描述了用荧光抗体探针和高内涵分析确定的SOX17蛋白表达(黑色柱条)和细胞数(白色柱条)。为了进行比较，将值相对于使用激活素A/Wnt3a的处理进行归一化。分图8A示出了在不存在任何生长因子(无)或用激活素A/Wnt3a处理(AA/Wnt3a)或单独使用各试剂时进行分化的一系列控制条件。分图8B示出了单独用GDF-3或其与Wnt3a、化合物34或化合物56的多种组合进行的分化。分图8C示出了单独用GDF-5或其与Wnt3a、化合物34或化合物56的多种组合进行的分化。分图8D示出了单独用GDF8或其与Wnt3a、化合物34或化合物56的多种组合进行的分化。分图8E示出了单独用GDF-10或其与Wnt3a、化合物34或化合物56的多种组合进行的分化。分图8F示出了单独用GDF-11或其与Wnt3a、化合物34或化合物56的多种组合进行的分化。分图8G示出了单独用GDF-15或其与Wnt3a、化合物34或化合物56的多种组合进行的分化。

图9示出了根据实例14所述方法，在向定形内胚层分化后人胚胎干细胞中的SOX17蛋白表达。将H1细胞进行如下处理：用100ng/ml的激活素A或所示浓度的多种生长因子处理总共三天，结合用20ng/ml Wnt 3a或结合用2.5μM化合物34处理测定法的第一天。对于每个处理组，描述了用荧光抗体探针和高内涵分析确定的SOX17蛋白表达(黑色柱条)和细胞数(白色柱条)。为了进行比较，将值相对于使用激活素A/Wnt3a的处理进行归一化。分图9A示出了用单独的Wnt3a或不存在任何生长因子(无)或用激活素A/Wnt3a处理(AA/Wnt3a)进行分化的一系列控制条件。分图9B示出了用所示浓度的GDF-8(供货商PeproTech)结合20ng/ml Wnt3a进行的分化。分图9C示出了用所示浓度的GDF-8(供货商Shenendoah)结合20ng/ml Wnt3a进行的分化。分图9D示出了用所示浓度的TGFβ1与Wnt3a或化合物34的多种组合进行的分化。分图9E示出了用所示浓度的BMP2与Wnt3a或化合物34的多种组合进行的分化。分图9F示出了用所示浓度的BMP3与Wnt3a或化合物34的多种组合进行的分化。分图9G示出了用所示浓度的BMP4与Wnt3a或化合物34的多种组合进行的分化。

图10示出了根据实例15所述方法，在向定形内胚层分化后人胚胎干细胞中的SOX17蛋白表达。将H1细胞在多种定时暴露方案中暴露于如下物质总共处理三天：100ng/ml激活素A或100ng/ml GDF-8结合20ng/mlWnt3a。用荧光抗体探针和高内涵分析确定的SOX17蛋白表达显示为各处理组的总强度值，从而测试没有添加生长因子(无处理)、单独添加Wnt3a、单独添加激活素A或GDF-8或采用激活素A/Wnt3a处理或GDF-8/Wnt3a处理情况下进行分化的控制条件，其中如所示出的仅在测定法的第一天添加Wnt3a或在测定法的全部三天添加Wnt3a。

图11示出了根据实例15所述方法，在向定形内胚层分化后人胚胎干细胞中的SOX17蛋白表达。将H1细胞在多种定时暴露方案中暴露于如下物质而总共处理三天：100ng/ml激活素A结合所示浓度的测试化合物(化合物181(分图A)、化合物180(分图B)、化合物19(分图C)、化合物202(分图D)、化合物40(分图E)、化合物34(分图F)或GSK3抑制剂BIO(分图G))，其中仅在测定法的第一天添加测试化合物。用荧光抗体探针和高内涵分析确定的SOX17的蛋白质表达通过总强度值来描述。

图12示出了根据实例15所述方法，在向定形内胚层分化后人胚胎干细胞中的SOX17蛋白表达。将H1细胞在多种定时暴露方案中暴露于如下物质而总共处理三天：100ng/ml激活素A结合所示浓度的测试化合物(化合物181(分图A)、化合物180(分图B)、化合物19(分图C)、化合物202(分图D)、化合物40(分图E)、化合物34(分图F)或GSK3抑制剂BIO(分图G))，其中在测定法的全部三天添加测试化合物。用荧光抗体探针和高内涵分析确定的SOX17的蛋白质表达通过总强度值来描述。

图13示出了根据实例15所述方法，在向定形内胚层分化后人胚胎干细胞中的SOX17蛋白表达。将H1细胞在多种定时暴露方案中暴露于如下物质而总共处理三天：100ng/ml的GDF-8结合所示浓度的测试化合物(化合物181(分图A)、化合物180(分图B)、化合物19(分图C)、化合物202(分图D)、化合物40(分图E)、化合物34(分图F)或GSK3抑制剂BIO(分图G))，其中仅在测定法的第一天添加测试化合物。用荧光抗体探针和高内涵分析确定的SOX17的蛋白质表达通过总强度值来描述。

图14示出了根据实例15所述方法，在向定形内胚层分化后人胚胎干细胞中的SOX17蛋白表达。将H1细胞在多种定时暴露方案中暴露于如下物质而总共处理三天：100ng/ml的GDF-8结合所示浓度的测试化合物(化合物181(分图A)、化合物180(分图B)、化合物19(分图C)、化合物202(分图D)、化合物40(分图E)、化合物34(分图F)或GSK3抑制剂BIO(分图G))，其中在测定法的全部三天添加测试化合物。用荧光抗体探针和高内涵分析确定的SOX17的蛋白质表达通过总强度值来描述。

图15示出了根据实例15所述方法，在人胚胎干细胞向定形内胚层分化后的细胞数产率。将H1细胞在多种定时暴露方案中暴露于如下物质而总共处理三天：100ng/ml激活素A或100ng/ml GDF-8结合20ng/ml Wnt3a。显示了各测试组的用荧光抗体探针和高内涵分析确定的细胞数，从而测试没有添加生长因子(无处理)、单独添加Wnt3a、单独添加激活素A或GDF-8或采用激活素A/Wnt3a处理或GDF-8/Wnt3a处理情况下进行分化的控制条件，其中如所示出的仅在测定法的第一天或在测定法的全部三天添加Wnt3a。

图16示出了根据实例15所述方法，在人胚胎干细胞向定形内胚层分化后的细胞数产率。将H1细胞在多种定时暴露方案中暴露于如下物质而总共处理三天：100ng/ml激活素A结合所示浓度的测试化合物(化合物181(分图A)、化合物180(分图B)、化合物19(分图C)、化合物202(分图D)、化合物40(分图E)、化合物34(分图F)或GSK3抑制剂BIO(分图G))，其中仅在测定法的第一天添加测试化合物。示出了用荧光核探针和高内涵分析确定的细胞数产率。

图17示出了根据实例15所述方法，在人胚胎干细胞向定形内胚层分化后的细胞数产率。将H1细胞在多种定时暴露方案中暴露于如下物质而总共处理三天：100ng/ml激活素A结合所示浓度的测试化合物(化合物181(分图A)、化合物180(分图B)、化合物19(分图C)、化合物202(分图D)、化合物40(分图E)、化合物34(分图F)或GSK3抑制剂BIO(分图G))，其中在测定法的全部三天添加测试化合物。示出了用荧光核探针和高内涵分析确定的细胞数产率。

图18示出了根据实例15所述方法，在人胚胎干细胞向定形内胚层分化后的细胞数产率。将H1细胞在多种定时暴露方案中暴露于如下物质而总共处理三天：100ng/ml的GDF-8结合所示浓度的测试化合物(化合物181(分图A)、化合物180(分图B)、化合物19(分图C)、化合物202(分图D)、化合物40(分图E)、化合物34(分图F)或GSK3抑制剂BIO(分图G))，其中仅在测定法的第一天添加测试化合物。示出了用荧光核探针和高内涵分析确定的细胞数产率。

图19示出了根据实例15所述方法，在人胚胎干细胞向定形内胚层分化后的细胞数产率。将H1细胞在多种定时暴露方案中暴露于如下物质而总共处理三天：100ng/ml的GDF-8结合所示浓度的测试化合物(化合物181(分图A)、化合物180(分图B)、化合物19(分图C)、化合物202(分图D)、化合物40(分图E)、化合物34(分图F)或GSK3抑制剂BIO(分图G))，其中在测定法的全部三天添加测试化合物。示出了用荧光核探针和高内涵分析确定的细胞数产率。

图20示出了根据实例16所述方法，在分化的全部多个步骤中细胞中的多种蛋白质标志物表达。将H1细胞进行如下处理：用100ng/ml激活素A或100ng/ml GDF-8处理总共三天，结合用20ng/ml Wnt3a处理第一天或结合用仅在第一天添加的2.5μM多种化合物(化合物19、化合物202、化合物40或GSK3抑制剂BIO)处理。图20分图A示出了在分化的第一个步骤后的细胞中，定形内胚层标志物CXCR4的FACS分析。CXCR4表达用荧光抗体探针和流式细胞术来测量，得到所示的阳性细胞百分比。图20分图B示出了由分化的第一个步骤产生的归一化SOX17蛋白表达(黑色柱条)和回收细胞数(白色柱条)的高内涵图像分析，从而测试了所示的对应处理。图20分图C示出了从通过分化步骤5处理的培养物回收的相对细胞数的高内涵图像分析。图20分图D示出了通过分化步骤5处理的培养物的胰高血糖素蛋白表达的高内涵图像分析。图20分图E示出了通过分化步骤5处理的培养物的胰岛素蛋白表达的高内涵图像分析。图20分图F示出了通过分化步骤5处理的培养物的细胞中胰高血糖素与胰岛素表达的比率。为了进行比较，分图B、C、D、E和F中的表达值相对于在步骤1期间使用激活素A和Wnt3a的对照处理进行归一化。

图21示出了根据实例17所述方法，在分化的全部多个步骤中细胞中的多种蛋白质和RT-PCR标志物的表达。将H1细胞进行如下处理：用100ng/ml激活素A或100ng/ml GDF-8处理总共三天，结合用20ng/ml Wnt3a处理第一天或结合用仅在第一天添加的如下浓度的多种化合物(化合物181、化合物180、化合物19、化合物202、化合物40、化合物56或GSK3抑制剂BIO)处理。示出了在分化的第一个步骤后细胞中定形内胚层标志物CXCR4的FACS分析，其中处理包括激活素A(分图A)或GDF-8(分图B)与Wnt3a或多种化合物的组合。CXCR4表达用荧光抗体探针和流式细胞术来测量，得到所示的阳性细胞百分比。在图21的后续分图中，示出了通过在分化的第一个步骤期间使用激活素A或GDF-8进行的各种处理后多种分化标志物的归一化RT-PCR值：结合激活素A(分图C)或GDF-8(分图D)进行处理的分化的第一个步骤结束时的标志物；结合激活素A(分图E)或GDF-8(分图F)进行处理的分化的第三个步骤结束时的标志物；结合激活素A(分图G)或GDF-8(分图H)进行处理的分化的第四个步骤结束时的标志物；结合激活素A(分图I)或GDF-8(分图J)进行处理的分化的第五个步骤结束时的标志物。在分化的第五个步骤结束时，进行高内涵分析以测量在使用激活素A(分图K)或GDF-8(分图M)的分化的第一个步骤期间对应处理的回收细胞数。高内涵分析还用于测量在分化的第五个步骤结束时回收细胞群体中的胰高血糖素和胰岛素强度，对应于在分化的第一个步骤期间用激活素A(分图A)或GDF-8(分图N)进行的处理。

图22示出了根据实例18所述方法处理的细胞中多种蛋白质和RT-PCR标志物的表达。将H1细胞进行如下处理：用100ng/ml激活素A或100ng/mlGDF-8处理总共三天，结合用20ng/ml Wnt3a处理第一天或仅在第一天结合使用2.5μM化合物40或2.5μM化合物202处理全部三天。图22分图A示出了在分化的第一个步骤后的细胞中，定形内胚层标志物CXCR4的FACS分析。CXCR4表达用荧光抗体探针和流式细胞术来测量，得到所示的阳性细胞百分比。在图22分图B中，示出了与在分化的第一个步骤期间使用激活素A/Wnt3a或GDF-8/化合物40或GDF-8/化合物202进行的各种处理相对应的分化的第四个步骤后回收的细胞中多种分化标志物的归一化RT-PCR值。

图23示出了在接受如实例18所述分化方案第四个步骤结束时的细胞的SCID-beige小鼠中检测到的C肽水平。

图24分图A示出了在实例19所述分化方案的第一个步骤结束时细胞中由FACS确定的CXCR4表达。分图B示出了在实例19所述分化方案的第四个步骤结束时细胞中由RT-PCR确定的多种基因的表达。示出了两次不同的实验重复(重复1和重复2)，每一者均经历相同的处理方案。分图C示出了接受了细胞的SCID-beige小鼠中检测到的C肽水平，所述细胞是在体外分化的第一个步骤期间用GDF-8和Wnt3a处理的分化方案的步骤四结束时的细胞。分图D示出了接受了细胞的SCID-beige小鼠中检测到的C肽水平，所述细胞是在体外分化的第一个步骤期间用GDF-8和化合物28处理的分化方案的步骤四结束时的细胞。

图25示出了根据实例22所述的本发明方法处理过的微载体珠上生长的细胞的细胞数(分图A)和CXCR4表达(分图B)。将细胞在未处理的Cytodex3珠上培养(未分化)或在用100ng/ml激活素A与20ng/ml Wnt3a组合进行处理的Cytodex3珠上培养(AA/Wnt3a)或在采用了多种如下的组合GDF-8进行的处理的Cytodex3珠上培养：50ng/ml GDF-8与2.5μM化合物34(化合物34+8)；或50ng/ml GDF-8与2.5μM化合物34和50ng/ml PDGF(化合物34+8+D)；或50ng/ml GDF-8与2.5μM化合物34和50ng/mlPDGF及50ng/ml VEGF(化合物34+8+D+V)；或50ng/ml GDF-8与2.5μM化合物34和50ng/ml PDGF以及50ng/ml VEGF和20ng/ml蝇蕈醇(化合物34+8+D+V+M)。

图26示出了如实例23所述在用本发明化合物处理后细胞的增殖。分图B至分图I示出了使用化合物结合GDF-8的处理并在开始分化测定法后的第1天、第2天和第3天测量MTS OD读数的分析结果。

图27示出了在根据本发明方法处理过的微载体珠上生长细胞的多种蛋白质和基因的表达。分图A示出了在实例24所述分化方案的步骤一结束时细胞中由FACS确定的CXCR4、CD99和CD9的阳性表达百分比。分图B示出了从显示分化通过分化方案步骤三的处理回收的细胞。分图C示出了如在步骤中所示地处理并通过该方案的步骤三分化的细胞中表达的多种基因标志物的ddCT值。

具体实施方式

将本发明的具体实施方式部分分成以下几个分部分，来描述或举例说明本发明的某些特征、实施例或应用，这是为了使公开内容清楚起见，并非限制本发明。

定义

干细胞是由它们在单细胞水平上既自我更新又分化产生子代细胞的能力来定义的未分化细胞，包括自我更新祖细胞、非更新祖细胞和末端分化细胞。干细胞的特征还在于：其具有在体外由多种胚层(内胚层、中胚层和外胚层)分化成各种细胞谱系的功能细胞以及移植后产生多种胚层的组织和注入胚泡后基本上有助于大部分(如果不是所有的话)组织形成的能力。

干细胞根据其发育潜能分为：(1)全能，指能够产生所有的胚胎和胚胎外细胞类型；(2)多能，指能够产生所有的胚胎细胞类型；(3)专能，指能够产生细胞谱系的亚群，但在特定组织、器官或生理系统内能产生所有的细胞(例如造血干细胞(HSC)可产生的后代细胞包括：HSC(自我更新型)、局限于血细胞的寡能祖细胞以及作为血液正常组分的所有细胞类型和成分(如血小板))；(4)寡能，指能够产生比多能干细胞更有限的细胞谱系亚群；以及(5)单能干，指能够产生单一细胞谱系(如生精干细胞)。

分化是未特化的(“未定向的”)或特化不足的细胞获得特化细胞(如神经细胞或肌肉细胞)的特征的过程。分化的细胞或诱导分化的细胞是已经在细胞谱系中占据更特化的(“定向的”)位置的细胞。术语“定向的”当应用到分化的过程时，指在分化途径中已经进行到这么一种程度的细胞：在正常环境下，它会继续分化成特定的细胞类型或细胞类型子集，且在正常环境下不能分化成另一细胞类型或回复到分化程度较低的细胞类型。去分化指细胞回复到细胞的谱系当中特化(或定向)程度较低的地位的过程。如本文所用，“细胞的谱系”限定细胞的遗传关系，即它来自哪些细胞和它能产生什么细胞。细胞谱系将细胞定位于发育和分化的遗传计划内。谱系特异性标志物是指与所关注谱系的细胞表型特异性相关并能够用于评价非定向细胞向所关注谱系的分化的特征。

“β-细胞谱系”是指对于转录因子PDX-1和下列转录因子中的至少一种具有阳性基因表达的细胞：NGN3、NKX2.2、NKX6.1、NEUROD、ISL1、HNF-3β、MAFA、PAX4或PAX6。表达β细胞谱系特征性标志物的细胞包括β细胞。

如本文所用，“表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞”、或“第1阶段细胞”或“第1阶段”指表达至少一种如下标志物的细胞：SOX17、GATA4、HNF-3β、GSC、CER1、Nodal、FGF8、Brachyury、Mix样同源盒蛋白、FGF4 CD48、脱中胚蛋白(eomesodermin，EOMES)、DKK4、FGF17、GATA6、CXCR4、C-Kit、CD99或OTX2。表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞包括原条前体细胞、原条细胞、中内胚层细胞和定形内胚层细胞。

如本文所用，“表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞”是指表达至少一种下列标志物的细胞：PDX1、HNF-1β、PTF1α、HNF6或HB9。表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞包括胰腺内胚层细胞、原肠管细胞和后前肠细胞。

如本文所用，“表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞”或“第5阶段细胞”或“第5阶段”指表达至少一种下列标志物的细胞：NGN3、NEUROD、ISL1、PDX1、NKX6.1、PAX4或PTF-1α。表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞包括胰腺内分泌细胞、胰激素表达细胞、胰激素分泌细胞和b-细胞谱系的细胞。

如本文所用，“定形内胚层”指具有在原肠胚形成过程中从上胚层产生的细胞的特性并形成胃肠道及其衍生物的细胞。定形内胚层细胞表达下列标志物：HNF-3β、GATA4、SOX-17、Cerberus、OTX2、goosecoid、C-Kit、CD99或MIXL1。

如本文所用，“胚胎外内胚层”指表达至少一种下列标志物的细胞群体：SOX7、AFP或SPARC。

如本文所用的，“标志物”是在所关注细胞中差异表达的核酸或多肽分子。关于这一点，差异表达意指阳性标志物的水平增加，而阴性标志物的水平降低。与其他细胞相比，所关注细胞中的核酸或多肽标志物的可检测水平足够高或足够低，使得可以使用本领域已知的多种方法识别所关注细胞，并将所关注细胞与其他细胞区相区分。

如本文所用，“中内胚层细胞”指表达至少一种下列标志物的细胞：CD48、脱中胚蛋白(EOMES)、SOX17、DKK4、HNF-3β、GSC、FGF17或GATA-6。

如本文所用的，“胰腺内分泌细胞”或“胰腺激素表达细胞”是指能够表达至少一种下列激素的细胞：胰岛素、胰胰高血糖素、生长抑素和胰腺多肽。

如本文所用，“胰腺内胚层细胞”或“第4阶段细胞”或“第4阶段”指能够表达至少一种下列标志物的细胞：NGN3、NEUROD、ISL1、PDX1、PAX4或NKX2.2。

如本文所用，“胰腺激素生成细胞”指能够生成至少一种下列激素的细胞：胰岛素、胰胰高血糖素、生长抑素和胰多肽。

如本文所用，“胰腺激素分泌细胞”指能够分泌至少一种下列激素的细胞：胰岛素、胰胰高血糖素、促生长素抑制素和胰多肽。

如本文所用，“后前肠细胞”或“第3阶段细胞”或“阶段3”指能够分泌至少一种下列标志物的细胞：PDX1、HNF1、PTF-1α、HNF6、HB-9或PROX-1。

如本文所用，“前原条细胞”指表达至少一种下列标志物的细胞：Nodal或FGF8。

如本文所用，“原肠管细胞”或“第2阶段细胞”或“第2阶段”指能够分泌至少一种下列标志物的细胞：HNF1、HNF-4α。

如本文所用，“原条细胞”指表达至少一种下列标志物的细胞：Brachyury、Mix样同源盒蛋白或FGF4。

多能干细胞的分离、扩增和培养

多能干细胞的特性描述

可通过(例如)以下方法来确认多能干细胞的多能性：将细胞注入严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠的体内，使用4％的多聚甲醛固定所形成的畸胎瘤，然后用组织学方法检查来自三种胚层的细胞类型的证据。或者，可通过产生拟胚体并评估拟胚体的与三个胚层相关的标志物的存在来确定多能性。

可以使用标准G带技术并比较已公布的相应灵长类物种的核型来分析增殖的多能干细胞系的核型。希望获得具有“正常核型”的细胞，其意指细胞为整倍体，其中所有人染色体都存在并且没有明显的改变。

多能干细胞的来源

可使用的多能干细胞的类型包括从妊娠后形成的组织衍生而来的确立多能细胞系，包括在妊娠期间任何时间取得的胚前组织(例如胚泡)、胚胎组织或胎儿组织，所述时间通常是但不一定是在大约10至12周妊娠前。非限制性的例子是已建立的人胚胎干细胞系或人胚胎生殖细胞系，例如人胚胎干细胞系H1、H7和H9(WiCell)。还可设想的是，在此类细胞的初始建立或稳定期间使用本公开的组合物，在此情况下，源细胞将是直接取自源组织的原代多潜能细胞。另外合适的是取自已在不存在饲养细胞的情况下培养的多能干细胞群体的细胞。同样合适的是突变型人胚胎干细胞系，例如BG01v(BresaGen，Athens，GA)。

在一个实施例中，人胚胎干细胞是如Thomson等人所述制备(美国专利No.5,843,780；Science 282：1145，1998；Curr.Top.Dev.Biol.38：133 ff.，1998；Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92：7844，1995)所描述方法制备人胚胎干细胞。

在一个实施例中，如Takahashi等人(Cell 131：1-12，2007)所述制备多能干细胞。

多能干细胞的培养

在一个实施例中，通常在饲养细胞层上培养多能干细胞，饲养细胞可以多种方式支持多能干细胞。或者，在培养系统中培养多能干细胞，所述培养系统基本上不含饲养细胞，但同样支持多能干细胞的增殖而不会进行显著的分化。使用通过此前培养另一细胞类型而调理过的培养基来支持多能干细胞在无饲养细胞的培养物中生长而不分化。作为另一种选择，用化学成分确定的培养基来支持多能干细胞在无饲养细胞的培养物中生长而不分化。

可将多能干细胞接种至合适的培养基质上。在一个实施例中，合适的培养基质是胞外基质成分，例如衍自基底膜的成分，或者可形成黏着分子受体-配体偶联物的一部分的成分。在一个实施例中，合适的培养基材是(Becton Dickenson)。是来自于Engelbreth-Holm-Swarm肿瘤细胞的可溶性制剂，其在室温下会发生胶化从而形成重构基底膜。

其他的细胞外基质组分和组分混合物适合作为替代物。取决于所扩增的细胞类型，这可包括单独的层粘连蛋白、纤连蛋白、蛋白聚糖、巢蛋白、硫酸乙酰肝素等或者它们的各种组合。

可在存在可促进细胞存活、增殖和保持理想特性的培养基存在的情况下，以合适的分布将多能干细胞接种于所述基质上。所有这些特性可得益于对接种分布的认真考虑并可容易地由本领域技术人员确定。

合适的培养基可以由下列组分制成，例如为：达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)，Gibco#11965-092；Knockout达尔伯克氏改良伊格尔培养基(KO DMEM)，Gibco#10829-018；Ham′s F12/50％DMEM基础培养基；200mM的L-谷氨酰胺，Gibco#15039-027；非必需氨基酸溶液，Gibco11140-050；β-巯基乙醇，Sigma#M7522；人重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，Gibco#13256-029。

由多能干细胞形成胰腺激素生成细胞

在一个实施例中，本发明提供一种从多能干细胞产生胰腺激素生成细胞的方法，该方法包括如下步骤：

a.培养多能干细胞，

b.使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，

c.使表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞，并且

d.使表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。

在本发明的一个方面，胰腺内分泌细胞是胰腺激素生成细胞。在一个替代方面，胰腺内分泌细胞是表达β-细胞谱系特征性标志物的细胞。表达β-细胞谱系特征性标志物的细胞可表达PDX1和至少一种下列转录因子：NGN3、NKX2.2、NKX6.1、NEUROD、ISL1、HNF-3β、MAFA、PAX4或Pax6。在本发明的一个方面，表达β-细胞谱系特征性标志物的细胞是β-细胞。

适用于本发明的多能干细胞包括例如人胚胎干细胞系H9(NIH编码：WA09)、人胚胎干细胞系H1(NIH编码：WA01)、人胚胎干细胞系H7(NIH编码：WA07)和人胚胎干细胞系SA002(Cellartis，瑞典)。同样适用于本发明的是表达至少一种下列多能细胞特征性标志物的细胞：ABCG2、cripto、CD9、FOXD3、连接蛋白43、连接蛋白45、OCT4、SOX2、Nanog、hTERT、UTF-1、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、Tra1-60或Tra1-81。

可在饲养细胞层上培养多能干细胞。或者，可在细胞外基质上培养多能干细胞。细胞外基质可以是从小鼠肉瘤细胞提取的可溶性基底膜制剂(其可由BD Biosciences以商品名MATRIGELTM销售)。或者，细胞外基质可以是低生长因子MATRIGELTM。或者，细胞外基质可以是纤粘蛋白。在一个替代实施例中，将多能干细胞在包被有人血清的组织培养基质上培养和分化。

可在对组织培养基底进行包被前，将细胞外基质进行稀释。用于稀释细胞外基质以及用于包被组织培养基材的合适方法的例子可见于Kleinman，H.K.等人，Biochemistry 25：312(1986)和Hadley，M.A.等人，J.Cell.Biol.101：1511(1985)。

在一个实施例中，细胞外基质是MATRIGELTM。在一个实施例中，组织培养基材包被有以1∶10稀释的MATRIGELTM。在一个替代实施例中，组织培养基材包被有以1∶15稀释的MATRIGELTM。在一个替代实施例中，组织培养基材包被有以1∶30稀释的MATRIGELTM。在一个替代实施例中，组织培养基材包被有以1∶60稀释的MATRIGELTM。在一个实施例中，细胞外基质是低生长因子MATRIGELTM。在一个实施例中，组织培养基材包被有以1∶10稀释的低生长因子MATRIGELTM。在一个替代实施例中，组织培养基材包被有以1∶15稀释的低生长因子MATRIGELTM。在一个替代实施例中，组织培养基材包被有以1∶30稀释的低生长因子MATRIGELTM。在一个替代实施例中，组织培养基材包被有以1∶60稀释的低生长因子MATRIGELTM。

定形内胚层谱系特征性标志物选自SOX17、GATA4、HNF-3β、GSC、CER1、Nodal、FGF8、Brachyury、Mix样同源盒、FGF4 CD48、脱中胚蛋白(EOMES)、DKK4、FGF17、GATA6、CXCR4、C-Kit、CD99和OTX2。适用于本发明的是表达至少一种定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。在本发明的一个方面，表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞为原条前体细胞。在一个替代方面，表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞为中内胚层细胞。在一个替代方面，表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞为定形内胚层细胞。

胰腺内胚层谱系特征性标志物选自PDX1、HNF-1β、PTF1α、HNF6、HB9和PROX1。适用于本发明的是表达至少一种胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。在本发明的一个方面，表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞为胰腺内胚层细胞。

胰腺内分泌谱系特征性标志物选自NGN3、NEUROD、ISL1、PDX1、NKX6.1、PAX4和PTF-1α。在一个实施例中，胰腺内分泌细胞能够表达以下激素中的至少一种：胰岛素、胰胰高血糖素、生长抑素和胰多肽。适用于本发明的细胞为表达至少一种胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。在本发明的一个方面，表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞为胰腺内分泌细胞。胰腺内分泌细胞可以是胰激素表达细胞。或者，胰腺内分泌细胞可以是胰激素分泌细胞。

表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的形成

在本发明的一个方面，多能干细胞可通过在培养基中培养多能干细胞而分化为表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，所述培养基包含足够量的GDF-8以引起多能干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。

可在含有足够量的GDF-8的培养基中培养多能干细胞约一天至约七天。或者，可在含有足够量GDF-8的培养基中培养多能干细胞约一天至约六天。或者，可在含有足够量GDF-8的培养基中培养多能干细胞约一天至约五天。或者，可在含有足够量GDF-8的培养基中培养多能干细胞约一天至约四天。或者，可在含有足够量GDF-8的培养基中培养多能干细胞约一天至约三天。或者，可在含有足够量GDF-8的培养基中培养多能干细胞约一天至约二天。或者，可在含有足够量GDF-8的培养基中培养多能干细胞约一天。

在一个实施例中，使用浓度为约5ng/ml至约500ng/ml的GDF-8。在一个替代实施例中，使用浓度为约5ng/ml至约50ng/ml的GDF-8。在一个替代实施例中，使用浓度为约5ng/ml至约25ng/ml的GDF-8。在一个替代实施例中，使用浓度为约25ng/ml的GDF-8。

在一个实施例中，包含足够量GDF-8的培养基还含有至少一种其他因子。在一个实施例中，所述至少一种其他因子选自EGF、FGF4、PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D、VEGF、蝇蕈醇、PD98059、LY294002、U0124、U0126和丁酸钠。

在一个实施例中，使用浓度为约5ng/ml至约500ng/ml的EGF。在一个替代实施例中，使用浓度为约5ng/ml至约50ng/ml的EGF。在一个替代实施例中，使用浓度为约50ng/ml的EGF。

在一个实施例中，使用浓度为约5ng/ml至约500ng/ml的FGF4。在一个替代实施例中，使用浓度为约5ng/ml至约50ng/ml的FGF4。在一个替代实施例中，使用浓度为约50ng/ml的FGF4。

在一个实施例中，使用浓度为约5ng/ml至约500ng/ml的PDGF-A。在一个替代实施例中，使用浓度为约5ng/ml至约50ng/ml的PDGF-A。在一个替代实施例中，使用浓度为约50ng/ml的PDGF-A。

在一个实施例中，使用浓度为约5ng/ml至约500ng/ml的PDGF-B。在一个替代实施例中，使用浓度为约5ng/ml至约50ng/ml的PDGF-B。在一个替代实施例中，使用浓度为约50ng/ml的PDGF-B。

在一个实施例中，使用浓度为约5ng/ml至约500ng/ml的PDGF-C。在一个替代实施例中，使用浓度为约5ng/ml至约50ng/ml的PDGF-C。在一个替代实施例中，使用浓度为约50ng/ml的PDGF-C。

在一个实施例中，使用浓度为约5ng/ml至约500ng/ml的PDGF-D。在一个替代实施例中，使用浓度为约5ng/ml至约50ng/ml的PDGF-D。在一个替代实施例中，使用浓度为约50ng/ml的PDGF-D。

在一个实施例中，使用浓度为约5ng/ml至约500ng/ml的VEGF。在一个替代实施例中，使用浓度为约5ng/ml至约50ng/ml的VEGF。在一个替代实施例中，使用浓度为约50ng/ml的VEGF。

在一个实施例中，使用浓度为约1μM至约200μM的蝇蕈醇。在一个替代实施例中，使用浓度为约1μM至约20μM的蝇蕈醇。在一个替代实施例中，使用浓度为约20μM的蝇蕈醇。

在一个实施例中，使用浓度为约0.1μM至约10μM的PD98059。在一个替代实施例中，使用浓度为约0.1μM至约1μM的PD98059。在一个替代实施例中，使用浓度为约1μM的PD98059。

在一个实施例中，使用浓度为约0.25μM至约25μM的LY294002。在一个替代实施例中，使用浓度为约0.25μM至约2.5μM的LY294002。在一个替代实施例中，使用浓度为约2.5μM的LY294002。

在一个实施例中，使用浓度为约0.1μM至约10μM的U0124。在一个替代实施例中，使用浓度为约0.1μM至约1μM的U0124。在一个替代实施例中，使用浓度为约1μM的U0124。

在一个实施例中，使用浓度为约0.1μM至约10μM的U0126。在一个替代实施例中，使用浓度为约0.1μM至约1μM的U0126。在一个替代实施例中，使用浓度为约1μM的U0126。

在一个实施例中，使用浓度为约0.05μM至约5μM的丁酸钠。在一个替代实施例中，使用浓度为约0.05μM至约0.5μM的丁酸钠。在一个替代实施例中，使用浓度为约0.5μM的丁酸钠。

在一个替代实施例中，所述至少一种其他因子选自：苯胺-吡啶并三嗪、环苯胺-吡啶并三嗪、N-{[1-(苯基甲基)氮杂环庚烷-4-基]甲基}-2-吡啶-3-基乙酰胺、4-{[4-(4-{[2-(吡啶-2-基氨基)乙基]氨基}-1，3，5-三嗪-2-基)吡啶-2-基]氧基}丁-1-醇、3-({3-[4-({2-[甲基(吡啶-2-基)氨基]乙基}氨基)-1，3，5-三嗪-2-基]吡啶-2-基}氨基)丙-1-醇、N～4～-[2-(3-氟代苯基)乙基]-N～2～-[3-(4-甲基哌嗪-1-基)丙基]吡啶并[2，3-d]嘧啶-2，4-二胺、1-甲基-N-[(4-吡啶-3-基-2-{[3-(三氟甲基)苯基]氨基}-1，3-噻唑-5-基)甲基]哌啶-4-甲酰胺、1，1-二甲乙基{2-[4-({5-[3-(3-羟丙基)苯基]-4H-1，2，4-三唑-3-基}氨基)苯基]乙基}氨基甲酸酯、1，1-二甲乙基{[3-({5-[5-(3-羟丙基)-2-(甲氧基)苯基]-1，3-唑-2-基}氨基)苯基]甲基}氨基甲酸酯、1-({5-[6-({4-[(4-甲基哌嗪-1-基)磺酰基]苯基}氨基)吡嗪-2-基]噻吩-2-基}甲基)哌啶-4-醇、1-({4-[6-({4-[(4-甲基哌嗪-1-基)磺酰基]苯基}氨基)吡嗪-2-基]噻吩-2-基}甲基)哌啶-4-甲酰胺和2-{[4-(1-甲基乙基)苯基]氨基}-N-(2-噻吩-2-基乙基)-7，8-二氢吡啶并[4，3-d]嘧啶-6(5H)-甲酰胺。

本发明的化合物

本发明提供能够使多能干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标志物细胞的化合物。

在一个实施例中，能够使多能干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标志物细胞的化合物是式(1)的苯胺-吡啶并三嗪：

式(1)。

N-氧化物形成药用加成盐及其立体异构形式，其中：

m代表1至4的整数；n代表1至4的整数；Z代表N或C；

R1和R8各自独立地代表氢、Het14、氰基、卤素、羟基、C1-6烷氧基-、C1-6烷基-、单-或二(C1-4烷基)氨基-羰基-、单-或二(C1-4烷基)氨基-磺酰基、被卤素取代的C1-6烷氧基或者R1代表被一个或可能两个或更多个选自羟基或卤素的取代基取代的C1-6烷基；

R2和R9各自独立地代表氢、C1-4烷基、C2-4烯基、Het3、Het4-C1-4烷基-、Het5-C1-4烷基羰基-、单-或二(C1-4烷基)氨基-C1-4烷基-羰基-或任选被一个或可能两个或更多个选自氢、羟基、氨基或C1-4烷氧基-的取代基取代的苯基；

R3和R7各自独立地代表氢、C1-4烷基、Het6、Het7-C1-4烷基-、任选被Het8-C1-4烷氨基羰基-取代的C2-4烯基羰基-、C2-4烯基磺酰基-、C1-4烷氧基C1-4烷基-或任选被一个或可能两个或更多个选自氢、羟基、氨基或C1-4烷氧基的取代基取代的苯基；

R4、R5、R6和R10各自独立地代表氢或任选被羟基取代的C1-4烷基、Het9或C1-4烷氧基；

Het1和Het2各自独立地代表选自吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、咪唑烷基或吡唑烷基的杂环，其中所述Het1和Het2任选被氨基、羟基、C1-4烷基、羟基-C1-4烷基-、苯基、苯基-C1-4烷基-、C1-4烷基-氧基-C1-4烷基-单-或二(C1-4烷基)氨基-或氨基-羰基-取代；

Het3和Het6各自独立地代表选自吡咯烷基或哌啶基的杂环，其中所述Het3和Het6任选被一个或可能两个或更多个选自C1-4烷基、C3-6环烷基、羟基-C1-4烷基-、C1-4烷氧基C1-4烷基或多羟基-C1-4烷基-的取代基取代；

Het4、Het7和Het9各自独立地代表选自吗啉基、吡咯烷基、哌嗪基或哌啶基的杂环，其中所述Het4、Het7和Het9任选被一个或可能两个或更多个选自C1-4烷基、C3-6环烷基、羟基-C1-4烷基-、C1-4烷氧基C1-4烷基或多羟基-C1-4烷基-的取代基取代；

Het5代表选自吗啉基、吡咯烷基、哌嗪基或哌啶基的杂环，其中所述Het5任选被一个或可能两个或更多个选自C1-4烷基、C3-6环烷基、羟基-C1-4烷基-、C1-4烷氧基C1-4烷基或多羟基-C1-4烷基-的取代基取代；

Het10、Het11和Het13各自独立地代表选自吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、咪唑烷基或吡唑烷基的杂环，其中所述Het10、Het11和Het13任选被氨基、羟基、C1-4烷基、羟基-C1-4烷基-、苯基、苯基-C1-4烷基-、C1-4烷基-氧基-C1-4烷基-、氨基-羰基-或单-或二(C1-4烷基)氨基-取代；

Het12代表选自吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、咪唑烷基或吡唑烷基的杂环，其中所述Het12任选被氨基、羟基、C1-4烷基、羟基-C1-4烷基-、苯基、苯基-C1-4烷基-、C1-4烷基-氧基-C1-4烷基-、单-或二(C1-4烷基)氨基-或氨基-羰基-取代；

Het14代表选自吗啉基、吡咯烷基、哌嗪基、咪唑基、吡咯基、2，3，4-三氮杂吡咯基、1，2，3-三唑基、吡唑基或哌啶基的杂环，其中所述Het14任选被一个或可能两个或更多个选自C1-4烷基、C3-6环烷基、羟基-C1-4烷基-、C1-4烷氧基C1-4烷基或多羟基-C1-4烷基-的取代基取代；具体来讲，Het14代表选自吗啉基、吡咯烷基、吡咯基、2，3，4-三氮杂吡咯基、哌嗪基或哌啶基的杂环，其中所述Het14任选被一个或可能两个或更多个选自C1-4烷基、C3-6环烷基、羟基-C1-4烷基-、C1-4烷氧基C1-4烷基或多羟基-C1-4烷基-的取代基取代；更具体来讲，Het14代表选自吗啉基、吡咯烷基、哌嗪基或哌啶基的杂环，其中所述Het14任选被一个或可能两个或更多个选自C1-4烷基、C3-6环烷基、羟基-C1-4烷基-、C1-4烷氧基C1-4烷基或多羟基-C1-4烷基-的取代基取代。

在一个实施例中，苯胺-吡啶并三嗪是式(1)的化合物。

在一个实施例中，苯胺-吡啶并三嗪是式(2)的化合物。

式(2)：3-{3-[(4-吡啶-3-基-1，3，5-三嗪-2-基)氨基]苯基}丙酸。本文称为“化合物1”。

在一个实施例中，苯胺-吡啶并三嗪是式(3)的化合物。

式(3)：2-{3-[(4-吡啶-3-基-1，3，5-三嗪-2-基)氨基]苯基}乙醇。本文称为“化合物2”。

在一个实施例中，苯胺-吡啶并三嗪是式(4)的化合物。

式(4)：{2-[3-({4-[2-(3-羟丙-1-炔-1-基)吡啶-4-基]-1，3，5-三嗪-2-基}氨基)苯基]乙基}氨基甲酸1，1-二甲基乙酯。本文称为“化合物3”。

在一个实施例中，苯胺-吡啶并三嗪是式(5)的化合物。

式(5)：{4-[4-(4-{[3-(羟甲基)苯基]氨基}-1，3，5-三嗪-2-基)吡啶-2-基]丁基}氨基甲酸1，1-二甲基乙酯。本文称为“化合物4”。

在一个实施例中，苯胺-吡啶并三嗪是式(6)的化合物。

式(6)：{3-[{[5-(2-{[3-溴-5-(羟甲基)苯基]氨基}嘧啶-4-基)-2-(甲氧基)苯基]甲基}(甲基)氨基]丙基}氨基甲酸1，1-二甲基乙酯。本文称为“化合物5”。

在一个实施例中，苯胺-吡啶并三嗪是式(7)的化合物。

式(7)：4-{[3-(3-氟代苯基)-3H-[1，2，3]三唑并[4，5-d]嘧啶-5-基]氨基}苯甲酸。本文称为“化合物6”。

在一个实施例中，苯胺-吡啶并三嗪是式(8)的化合物。

式(8)：2-氟-5-[(3-苯基-3H-[1，2，3]三唑[4，5-d]嘧啶-5-基)氨基]苯甲酸。本文称为“化合物7”。

在一个实施例中，苯胺-吡啶并三嗪是式(9)的化合物。

式(9)：N-{[3-(5-{[3-(2-氨基嘧啶-4-基)苯基]氨基}-3H-[1，2，3]三唑并[4，5-d]嘧啶-3-基)苯基]甲基}环丙酰胺。本文称为“化合物8”。

在一个实施例中，苯胺-吡啶并三嗪是式(10)的化合物。

式(10)：4-[(1-环己基-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶-6-基)氨基]-N-[3-(甲氧基)丙基]苯磺酰胺。本文称为“化合物9”。

在一个实施例中，苯胺-吡啶并三嗪是式(11)的化合物。

式(11)：4-氯-2-[(6-{[3-(氯甲基)-4-甲氧苯基]氨基}嘧啶-4-基)氨基]苯酚。本文称为“化合物10”。

在一个实施例中，苯胺-吡啶并三嗪是式(12)的化合物。

式(12)：4-{[4-(4-甲基-3，4-二氢喹喔啉-1(2H)-基)嘧啶-2-基]氨基}-N-(1-甲基哌啶-4-基)苯酰胺。本文称为“化合物11”。

在一个实施例中，苯胺-吡啶并三嗪是式(13)的化合物。

式(13)：N-(2-甲氧基-4-{[(3-甲氧丙基)氨基]甲基}苯基)-4-(1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-3-基)嘧啶-2-胺。本文称为“化合物12”。

在一个实施例中，能够使多能干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标志物细胞的化合物是式(14)的环苯胺-吡啶并三嗪：

式(14)。

N-氧化物形成药用加成盐及其立体异构形式，其中：

m代表1至4的整数；n代表1至4的整数；Z代表N或C；

Y代表-NR2-C1-6烷基-CO-NR4-、-C1-4烷基-NR9-C1-4烷基-、C1-6烷基-CO-Het10-、-Het11-CO-C1-6烷基-、-Het12-C1-6烷基-、-CO-Het13-C1-6烷基-、-CO-NR10-C1-6烷基-、-Het1-C1-6烷基-CO-NR5-或-Het2-CO-NR6-，其中-NR2-C1-6烷基-CO-NR4-或-Het1-C1-6烷基-CO-NR5-中的-C1-6烷基连接基任选被一个或可能两个或更多个选自羟基、甲氧基、氨羰基、卤素、苯基、吲哚基、二甲硫、硫醇、羟苯基、氰基苯基、氨基和羟基羰基的取代基取代；

X1代表直键、C1-4烷基、C1-4烷氧基-、C1-4烷基-CO-、C2-4烯基、C2-4炔基、或C1-4烷基-NR3-，其中所述C1-4烷基或C2-4烯基任选被一个或可能两个或更多卤素取代基取代；

X2代表直键、C1-4烷基、C1-4烷氧基-、C1-4烷基-CO-、C2-4烯基、C2-4炔基或C1-4烷基-NR7-，其中所述C1-4烷基或C2-4烯基任选被一个或可能两个或更多个卤素取代基取代；

R1和R8各自独立地代表氢、Het14、氰基、卤素、羟基、C1-6烷氧基-、C1-6烷基-、单-或二(C1-4烷基)氨基-羰基-、单-或二(C1-4烷基)氨基-磺酰基、被卤素取代的C1-6烷氧基或者R1代表被一个或可能两个或更多个选自羟基或卤素的取代基取代的C1-6烷基；

R2和R9各自独立地代表氢、C1-4烷基、C2-4烯基、Het3、Het4-C1-4烷基-、Het5-C1-4烷基羰基-、单-或二(C1-4烷基)氨基-C1-4烷基-羰基-或任选被一个或可能两个或更多个选自氢、羟基、氨基或C1-4烷氧基-的取代基取代的苯基；

R3和R7各自独立地代表氢、C1-4烷基、Het6、Het7-C1-4烷基-、任选被Het8-C1-4烷氨基羰基-取代的C2-4烯基羰基-、C2-4烯基磺酰基-、C1-4烷氧基C1-4烷基-或任选被一个或可能两个或更多个选自氢、羟基、氨基或C1-4烷氧基的取代基取代的苯基；

R4、R5、R6和R10各自独立地代表氢或任选被羟基取代的C1-4烷基、Het9或C1-4烷氧基；

Het1和Het2各自独立地代表选自吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、咪唑烷基或吡唑烷基的杂环，其中所述Het1和Het2任选被氨基、羟基、C1-4烷基、羟基-C1-4烷基-、苯基、苯基-C1-4烷基-、C1-4烷基-氧基-C1-4烷基-单-或二(C1-4烷基)氨基-或氨基-羰基-取代；

Het3和Het6各自独立地代表选自吡咯烷基或哌啶基的杂环，其中所述Het3和Het6任选被一个或可能两个或更多个选自C1-4烷基、C3-6环烷基、羟基-C1-4烷基-、C1-4烷氧基C1-4烷基或多羟基-C1-4烷基-的取代基取代；

Het4、Het7和Het9各自独立地代表选自吗啉基、吡咯烷基、哌嗪基或哌啶基的杂环，其中所述Het4、Het7和Het9任选被一个或可能两个或更多个选自C1-4烷基、C3-6环烷基、羟基-C1-4烷基-、C1-4烷氧基C1-4烷基或多羟基-C1-4烷基-的取代基取代；

Het5代表选自吗啉基、吡咯烷基、哌嗪基或哌啶基的杂环，其中所述Het5任选被一个或可能两个或更多个选自C1-4烷基、C3-6环烷基、羟基-C1-4烷基-、C1-4烷氧基C1-4烷基或多羟基-C1-4烷基-的取代基取代；

Het10、Het11和Het13各自独立地代表选自吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、咪唑烷基或吡唑烷基的杂环，其中所述Het10、Het11和Het13任选被氨基、羟基、C1-4烷基、羟基-C1-4烷基-、苯基、苯基-C1-4烷基-、C1-4烷基-氧基-C1-4烷基-、氨基-羰基-或单-或二(C1-4烷基)氨基-取代；

Het12代表选自吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、咪唑烷基或吡唑烷基的杂环，其中所述Het12任选被氨基、羟基、C1-4烷基、羟基-C1-4烷基-、苯基、苯基-C1-4烷基-、C1-4烷基-氧基-C1-4烷基-、单-或二(C1-4烷基)氨基-或氨基-羰基-取代；

Het14代表选自吗啉基、吡咯烷基、哌嗪基、咪唑基、吡咯基、2，3，4-三氮杂吡咯基、1，2，3-三唑基、吡唑基或哌啶基的杂环，其中所述Het14任选被一个或可能两个或更多个选自C1-4烷基、C3-6环烷基、羟基-C1-4烷基-、C1-4烷氧基C1-4烷基或多羟基-C1-4烷基-的取代基取代；具体来讲，Het14代表选自吗啉基、吡咯烷基、吡咯基、2，3，4-三氮杂吡咯基、哌嗪基或哌啶基的杂环，其中所述Het14任选被一个或可能两个或更多个选自C1-4烷基、C3-6环烷基、羟基-C1-4烷基-、C1-4烷氧基C1-4烷基或多羟基-C1-4烷基-的取代基取代；更具体来讲，Het14代表选自吗啉基、吡咯烷基、哌嗪基或哌啶基的杂环，其中所述Het14任选被一个或可能两个或更多个选自C1-4烷基、C3-6环烷基、羟基-C1-4烷基-、C1-4烷氧基C1-4烷基或多羟基-C1-4烷基-的取代基取代。

式(7)的化合物在转让给Janssen Pharmaceutica N.V.的WO2007/003525中公开。

在一个实施例中，环苯胺-吡啶并三嗪是式(14)的化合物。

在一个实施例中，环苯胺-吡啶并三嗪是式(15)的化合物。

式(15)：1，8，10，12，17，19，23，27，33-九氮杂五环[25.2.2.1～3，7～.1～9，13～.1～14，18～]三十四烷-3(34)，4，6，9(33)，10，12，14(32)，15，17-壬-24-酮。本文称为“化合物13”。

在一个实施例中，环苯胺-吡啶并三嗪是式(16)的化合物。

式(16)：10-氯-14-乙基-3，5，7，14，17，22，27-七氮杂四环[19.3.1.1～2，6～.1～8，12～]二十七烷-1(25)，2(27)，3，5，8(26)，9，11，21，23-壬-16-酮。本文称为“化合物14”。

在一个实施例中，环苯胺-吡啶并三嗪是式(17)的化合物。

式(17)：14-乙基-3，5，7，14，17，27-六氮杂四环[19.3.1.1～2，6～.1～8，12～]二十七烷-1(25)，2(27)，3，5，8(26)，9，11，21，23-壬-16-酮。本文称为“化合物15”。

在一个实施例中，环苯胺-吡啶并三嗪是式(18)的化合物。

式(18)：10-氯-14-乙基-3，5，7，14，17，27-六氮杂四环[19.3.1.1～2，6～.1～8，12～]二十七烷-1(25)，2(27)，3，5，8(26)，9，11，21，23-壬烷-16-酮。本文称为“化合物16”。

在一个实施例中，环苯胺-吡啶并三嗪是式(19)的化合物。

式(19)：3，5，7，14，20，26，31-七氮杂五环[22.3.1.1～2，6～.1～8，12～.1～14，18～]三十一烷-1(28)，2(31)，3，5，8(30)，9，11，24，26-壬-19-酮。本文称为“化合物17”。

在一个实施例中，环苯胺-吡啶并三嗪是式(20)的化合物。

式(20)：(18S)-3，5，7，14，20，26，30-七氮杂五环[22.3.1.1～2，6～.1～8，12～.0～14，18～]三十烷-1(28)，2(30)，3，5，8(29)，9，11，24，26-壬-19-酮。本文称为“化合物18”。

在一个实施例中，环苯胺-吡啶并三嗪是式(21)的化合物。

式(21)：14-甲基-3，5，7，14，18，24，28-七氮杂四环[20.3.1.1～2，6～.1～8，12～]二十八烷-1(26)，2(28)，3，5，8(27)，9，11，22，24-壬-17-酮。本文称为“化合物19”。

在一个实施例中，环苯胺-吡啶并三嗪是式(22)的化合物。

式(22)：14-甲基-3，5，7，14，19，25，29-七氮杂四环[21.3.1.1～2，6～.1～8，12～]二十九烷-1(27)，2(29)，3，5，8(28)，9，11，23，25-壬-18-酮。本文称为“化合物20”。

在一个实施例中，环苯胺-吡啶并三嗪是式(23)的化合物。

式(23)：14-甲基-3，5，7，14，18，22，29-七氮杂四环[21.3.1.1～2，6～.1～8，12～]二十九烷-1(27)，2(29)，3，5，8(28)，9，11，23，25-壬-17-酮。本文称为“化合物21”。

在一个实施例中，环苯胺-吡啶并三嗪是式(24)的化合物。

式(24)：1，8，10，12，16，22，30-七氮杂五环[22.2.2.1～3，7～.1～9，13～.1～14，18～]三十一烷-3(31)，4，6，9(30)，10，12，14(29)，15，17-壬-23-酮。本文称为“化合物22”。

在一个实施例中，环苯胺-吡啶并三嗪是式(25)的化合物。

式(25)：1，8，10，12，16，22，26，32-八氮杂五环[24.2.2.1～3，7～.1～9，13～.1～14，18～]三十三烷-3(33)，4，6，9(32)，10，12，14(31)，15，17-壬-23-酮。本文称为“化合物23”。

在一个实施例中，环苯胺-吡啶并三嗪是式(26)的化合物。

式(26)：5-氯-17-氟-1，8，10，12，22，26，32-七氮杂五环[24.2.2.1～3，7～.1～9，13～.1～14，18～]三十三烷-3(33)，4，6，9(32)，10，12，14(31)，15，17-壬-23-酮。本文称为“化合物24”。

在一个实施例中，环苯胺-吡啶并三嗪是式(27)的化合物。

式(27)：10-氯-14-乙基-22-氟-3，5，7，14，17，27-六氮杂四环[19.3.1.1～2，6～.1～8，12～]二十七烷-1(25)，2(27)，3，5，8(26)，9，11，21，23-壬-16-酮。本文称为“化合物25”。

在一个实施例中，环苯胺-吡啶并三嗪是式(28)的化合物。

式(28)：10-氯-25-氟-3，5，7，14，20，31-六氮杂五环[22.3.1.1～2，6～.1～8，12～.1～14，18～]三十一烷-1(28)，2(31)，3，5，8(30)，9，11，24，26-壬-19-酮。本文称为“化合物26”。

在一个实施例中，环苯胺-吡啶并三嗪是式(29)的化合物。

式(29)：4-氯-1，8，10，12，17，22，26，32-八氮杂五环[24.2.2.1～3，7～.1～9，13～1～14，18～]三十三烷-3(33)，4，6，9(32)，10，12，14(31)，15，17-壬-23-酮。本文称为“化合物27”。

在一个实施例中，环苯胺-吡啶并三嗪是式(30)的化合物。

式(30)：18-甲基-3，5，7，15，18，28-六氮杂四环[20.3.1.1～2，6～.1～8，12～]二十八烷-1(26)，2(28)，3，5，8(27)，9，11，22，24-壬-16-酮。本文称为“化合物28”。

在一个实施例中，环苯胺-吡啶并三嗪是式(31)的化合物。

式(31)：18-乙基-3，5，7，15，18，28-六氮杂四环[20.3.1.1～2，6～.1～8，12～]二十八烷-1(26)，2(28)，3，5，8(27)，9，11，22，24-壬-16-酮。本文称为“化合物29”。

在一个实施例中，环苯胺-吡啶并三嗪是式(32)的化合物。

式(32)：1，8，10，12，17，19，23，27，33-九氮杂五环[25.2.2.1～3，7～.1～9，13～.1～14，18～]三十四烷-3(34)，4，6，9(33)，10，12，14(32)，15，17-壬-24-酮。本文称为“化合物30”。

在一个实施例中，环苯胺-吡啶并三嗪是式(33)的化合物。

式(33)：1，11，13，15，23，31-六氮杂五环[23.2.2.1～5，9～.1～10，14～.1～16，20～]三十二烷-5(32)，6，8，10(31)，11，13，16(30)，17，19-壬-24-酮。本文称为“化合物31”。

在一个实施例中，环苯胺-吡啶并三嗪是式(34)的化合物。

式(34)：15-乙基-13，14，15，16，18，19-六氢-1H-6，2-(氮烯(azeno))-7，11-(次甲基)-1，3，5，15，18-苯并五氮杂环二十一碳(benzopentaazacyclohenicosin)-17(12H)-酮。本文称为“化合物32”。

在一个实施例中，环苯胺-吡啶并三嗪是式(35)的化合物。

式(35)：20-甲基-3，5，7，15，20，30-六氮杂四环[22.3.1.1～2，6～.1～8，12～]三十烷-1(28)，2(30)，3，5，8(29)，9，11，24，26-壬-16-酮。本文称为“化合物33”。

在一个实施例中，环苯胺-吡啶并三嗪是式(36)的化合物。

式(36)：5-氯-1，8，10，12，16，22，26，32-八氮杂五环[24.2.2.1～3，7～.1～9，13～.1～14，18～]三十三烷-3(33)，4，6，9(32)，10，12，14(31)，15，17-壬-23-酮。本文称为“化合物34”。

在一个实施例中，环苯胺-吡啶并三嗪是式(37)的化合物。

式(37)：10-氯-14-乙基-3，5，7，14，17，23，27-七氮杂四环[19.3.1.1～2，6～.1～8，12～]二十七烷-1(25)，2(27)，3，5，8(26)，9，11，21，23-壬-16-酮。本文称为“化合物35”。

在一个实施例中，环苯胺-吡啶并三嗪是式(38)的化合物。

式(38)：(18S)-10-氯-3，5，7，14，20，26，30-七氮杂五环[22.3.1.1～2，6～.1～8，12～.0～14，18～]三十烷-1(28)，2(30)，3，5，8(29)，9，11，24，26-壬-19-酮。本文称为“化合物36”。

在一个实施例中，环苯胺-吡啶并三嗪是式(39)的化合物。

式(39)：10-氯-3，5，7，14，20，26，31-七氮杂五环[22.3.1.1～2，6～.1～8，12～.1～14，18～]三十一烷-1(28)，2(31)，3，5，8(30)，9，11，24，26-壬-19-酮。本文称为“化合物37”。

在一个实施例中，环苯胺-吡啶并三嗪是式(40)的化合物。

式(40)：5-氯-1，8，10，12，16，22，30-七氮杂五环[22.2.2.1～3，7～.1～9，13～.1～14，18～]三十一烷-3(31)，4，6，9(30)，10，12，14(29)，15，17-壬-23-酮。本文称为“化合物38”。

在一个实施例中，环苯胺-吡啶并三嗪是式(41)的化合物。

式(41)：9-甲基-2，3，4，5，7，8，9，10-八氢-16H-17，21-(氮烯)-11，15-(次甲基)吡啶[3，2-g][1，3，5，9，13，17]六氮杂环二十三烯-6(1H)-酮。本文称为“化合物39”。

在一个实施例中，环苯胺-吡啶并三嗪是式(42)的化合物。

式(42)：14-丙-2-烯-1-基-3，5，7，14，17，23，27-七氮杂四环[19.3.1.1～2，6～.1～8，12～]二十七烷-1(25)，2(27)，3，5，8(26)，9，11，21，23-壬-16-酮。本文称为“化合物40”。

在一个实施例中，环苯胺-吡啶并三嗪是式(43)的化合物。

式(43)：18-氧代-14-氧杂-2，4，8，17，25-五氮杂四环[17.3.1.1～3，7～.1～9，13～]二十五烷-1(23)，3(25)，4，6，9(24)，10，12，19，21-壬-6-腈。本文称为“化合物41”。

在一个实施例中，环苯胺-吡啶并三嗪是式(44)的化合物。

式(44)：14，21-二氧杂-2，4，8，18，28-五氮杂四环[20.3.1.1～3，7～.1～9，13～]二十八烷-1(26)，3(28)，4，6，9(27)，10，12，22，24-壬-19-酮。本文称为“化合物42”。

在一个实施例中，环苯胺-吡啶并三嗪是式(45)的化合物。

式(45)：21-甲基-1，8，10，11，21，24，30-七氮杂五环[22.2.2.1～3，7～.1～9，12～.1～13，17～]三十一烷-3(31)，4，6，9，11，13(29)，14，16-辛烷-23-酮。本文称为“化合物43”。

在一个实施例中，环苯胺-吡啶并三嗪是式(46)的化合物。

式(46)：(18S)-11-(吗啉-4-基羰基)-5，7，14，20，28-五氮杂五环[20.3.1.1～2，6～.1～8，12～.0～14，18～]二十八烷-1(26)，2(28)，3，5，8(27)，9，11，22，24-壬-19-酮。本文称为“化合物44”。

在一个实施例中，环苯胺-吡啶并三嗪是式(47)的化合物。

式(47)：10-甲氧基-17-甲基-2，14，15，17，18，19，20，22-八氢-6H-19，21-亚甲基-7，11-(次甲基)-12-氧杂-2，3，5，6，17，21-六氮杂环二十碳[1，2，3-cd]茚-16(13H)-酮。本文称为“化合物45”。

在一个实施例中，所述至少一种其他因子是式(48)的化合物：

式(48)。N-{[1-(苯甲基)氮杂环庚烷-4-基]甲基}-2-吡啶-3-基乙酰胺。本文称为“化合物46”。

在一个实施例中，所述至少一种其他因子是式(49)的化合物：

式(49)。4-{[4-(4-{[2-(吡啶-2-基氨基)乙基]氨基}-1，3，5-三嗪-2-基)吡啶-2-基]氧基}丁-1-醇。本文称为“化合物47”。

在一个实施例中，所述至少一种其他因子是式(50)的化合物：

式(50)。3-({3-[4-({2-[甲基(吡啶-2-基)氨基]乙基}氨基)-1，3，5-三嗪-2-基]吡啶-2-基}氨基)丙-1-醇。本文称为“化合物48”。

在一个实施例中，所述至少一种其他因子是式(51)的化合物：

式(51)。N～4～-[2-(3-氟代苯基)乙基]-N～2～-[3-(4-甲基哌嗪-1-基)丙基]吡啶[2，3-d]嘧啶-2，4-二胺。本文称为“化合物49”。

在一个实施例中，所述至少一种其他因子是式(52)的化合物：

式(52)。1-甲基-N-[(4-吡啶-3-基-2-{[3-(三氟甲基)苯基]氨基}-1，3-噻唑-5-基)甲基]哌啶-4-甲酰胺。本文称为“化合物50”。

在一个实施例中，所述至少一种其他因子是式(53)的化合物：

式(53)。{2-[4-({5-[3-(3-羟丙基)苯基]-4H-1，2，4-三唑-3-基}氨基)苯基]乙基}氨基甲酸1，1-二甲基乙酯。本文称为“化合物51”。

在一个实施例中，所述至少一种其他因子是式(54)的化合物：

式(54)。{[3-({5-[5-(3-羟丙基)-2-(甲氧基)苯基]-1，3-唑-2-基}氨基)苯基]甲基}氨基甲酸1，1-二甲基乙酯。本文称为“化合物52”。

在一个实施例中，所述至少一种其他因子是式(55)的化合物：

式(55)。1-({5-[6-({4-[(4-甲基哌嗪-1-基)磺酰基]苯基}氨基)吡嗪-2-基]噻吩-2-基}甲基)哌啶-4-醇。本文称为“化合物53”。

在一个实施例中，所述至少一种其他因子是式(56)的化合物：

式(56)。1-({4-[6-({4-[(4-甲基哌嗪-1-基)磺酰基]苯基}氨基)吡嗪-2-基]噻吩-2-基}甲基)哌啶-4-甲酰胺。本文称为“化合物54”。

在一个实施例中，所述至少一种其他因子是式(57)的化合物：

式(57)。2-{[4-(1-甲基乙基)苯基]氨基}-N-(2-噻吩-2-基乙基)-7，8-二氢化吡啶[4，3-d]嘧啶-6(5H)-甲酰胺。本文称为“化合物55”。

在一个实施例中，所述至少一种其他因子是式(58)的化合物：

式(58)。6-[(2-{[4-(2，4-二氯苯基)-5-(4-甲基-1H-咪唑-2-基)嘧啶-2-基]氨基}乙基)氨基]吡啶-3-腈。本文称为“化合物56”。

在一个实施例中，所述至少一种其他因子是式(59)的化合物：

式(59)。4-(6-{[(3-氯苯基)甲基]氨基}咪唑并[1，2-b]哒嗪-3-基)-N-[2-(二甲氨基)乙基]苯酰胺。本文称为“化合物57”。

表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的检测

表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的形成可通过在特定方案前后检测标志物的存在情况来确定。多能干细胞通常不表达这类标志物。因而，当细胞开始表达它们时即检测到多潜能细胞的分化。

可通过将处理过的细胞群体暴露于可特异性识别由表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞表达的蛋白质标志物的试剂(例如抗体)来确定分化效率。

用于评估蛋白质标志物和核酸标志物在培养的或分离的细胞中的表达的方法是本领域的标准方法。这些方法包括定量逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)、RNA印记、原位杂交(参见例如，Current Protocols in MolecularBiology(Ausubel等人(编辑)，2001增刊))以及免疫测定法(例如切片材料的免疫组织化学分析)、蛋白印记以及针对完整细胞中可触及的标志物的流式细胞检测分析(FACS)(参见例如，Harlow和Lane，Using Antibodies：A Laboratory Manual，New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press(1998))。

例如，多能干细胞的特征是本领域技术人员所熟知的，并且多能干细胞的其他特征不断地被鉴别。多能干细胞标志物包括(例如)一种或多种下列标志物的表达：ABCG2、cripto、FOXD3、连接蛋白43、连接蛋白45、OCT4、SOX2、Nanog、hTERT、UTF-1、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、Tra1-60或Tra1-81。

在用本发明方法处理多能干细胞后，可通过将处理过的细胞群体暴露于特异性识别由表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞表达的蛋白质标志物(例如CXCR4)来进行纯化。

表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞的形成

可通过本领域的任何方法或通过本发明提出的任何方法，使表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。

例如，可根据D’Amour等人，Nature Biotechnology 24，1392-1401(2006)中公开的方法，使表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。

可通过用成纤维细胞生长因子和hedgehog信号转导途径抑制剂KAAD-环巴胺处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，然后移除含有纤维细胞生长因子和KAAD-环巴胺的培养基，并随后将所述细胞在含有视黄酸、成纤维细胞生长因子和KAAD-环巴胺的培养基中进行培养，来使表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。这个方法的一个例子在Nature Biotechnology 24，1392-1401(2006)中公开。

在本发明的一个方面，根据转让给LifeScan，Inc.的美国专利申请序列号11/736,908中公开的方法，通过用视黄酸和至少一种成纤维细胞生长因子处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞一段时间，来使表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。

在本发明的一个方面，根据转让给LifeScan，Inc.的美国专利申请序列号11/779,311中公开的方法，通过用视黄酸和至少一种成纤维细胞生长因子处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞一段时间，来使表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。

在本发明的一个方面，根据序列号为60/990,529的美国专利申请中公开的方法，通过处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，来使表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。

可以将表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞用至少一种其他额外的因子进行处理，这些因子可增强表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞的形成。作为另一种选择，所述至少一种其他额外的因子可增强通过本发明方法形成的表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞的增殖。另外，所述至少一种其他额外的因子可增强通过本发明方法形成的表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞形成其他细胞类型的能力，或可改善任意其他额外分化步骤的效率。

所述至少一种额外的因子可以是(例如)烟酰胺、TGF-β家族的成员(包括TGF-β1、2和3)、血清白蛋白、成纤维细胞生长因子家族的成员、血小板衍生生长因子-AA和-BB、富血小板血浆、胰岛素生长因子(IGF-I、II)、生长分化因子(例如，GDF-5、-6、-8、-10、-11)、胰胰高血糖素样肽-I和II(GLP-I和II)、GLP-1和GLP-2模拟体、毒蜥外泌肽-4、视黄酸、甲状旁腺激素、胰岛素、孕酮、抑酶肽、氢化可的松、乙醇胺、β巯基乙醇、表皮生长因子(EGF)、胃泌素I和II、铜螯合剂(例如，三亚乙基五胺)、毛喉素、丁酸-Na、激活素、β细胞素、ITS、成头蛋白、神经突生长因子、nodal、丙戊酸、曲古抑菌素A、丁酸钠、肝细胞生长因子(HGF)、鞘氨醇-1、VEGF、MG132(EMD，CA)、N2和B27添加剂(Gibco，CA)、甾体类生物碱(例如，环巴胺(EMD，CA))、角质细胞生长因子(KGF)、Dickkopf蛋白家族、牛垂体提取物、胰岛新生相关蛋白(INGAP)、印第安豪猪蛋白、音猬蛋白、蛋白酶体抑制剂、notch通路抑制剂、音猬蛋白抑制剂或它们的组合。

所述至少一种其他额外的因子可由从胰腺细胞系(例如PANC-1(ATCC No：CRL-1469)、CAPAN-1(ATCC No：HTB-79)、BxPC-3(ATCC No：CRL-1687)、HPAF-II(ATCC No：CRL-1997))、肝细胞系例如HepG2(ATCC No：HTB-8065)、肠细胞系例如FHs 74(ATCC No：CCL-241)获得的调理培养基提供。

表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞的检测

胰腺内胚层谱系特征性标志物是本领域技术人员所熟知的，并且其他胰腺内胚层谱系特征性标志物不断被鉴别。这些标志物可用于确定根据本发明处理过的细胞是否已分化而获得胰腺内胚层谱系特征性特性。胰腺内胚层谱系的特异性标志物包括一种或多种转录因子，例如Hlxb9、PTF-1a、PDX-1、HNF-6、HNF-1β的表达。

可通过将处理过的细胞群体暴露于可特异性识别由表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞表达的蛋白质标志物的试剂(例如抗体)来确定分化效率。

用于评估蛋白质标志物和核酸标志物在培养的或分离的细胞中的表达的方法是本领域的标准方法。这些方法包括定量逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)、RNA印记、原位杂交(参见例如，Current Protocols in MolecularBiology(Ausubel等人(编辑)，2001增刊))以及免疫测定法(例如切片材料的免疫组织化学分析)、蛋白印记以及针对完整细胞中可触及的标志物的流式细胞检测分析(FACS)(参见例如，Harlow和Lane，Using Antibodies：A Laboratory Manual，New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press(1998))。

表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞的形成

可通过本领域的任何方法或通过本发明公开的任何方法，使表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。

例如，可根据D’Amour等人，Nature Biotechnology 24，1392-1401(2006)中公开的方法，使表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。

例如，可通过将表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞在含有DAPT和毒蜥外泌肽-4的培养基中进行培养，然后移除含有DAPT和毒蜥外泌肽-4的培养基，并随后将所述细胞在含有毒蜥外泌肽1、IGF-1和HGF的培养基中进行培养，来使表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。这个方法的一个例子在NatureBiotechnology 24，1392-1401(2006)中公开。

例如，可通过将表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞在含有毒蜥外泌肽4的培养基中进行培养，然后移除该含有毒蜥外泌肽4的培养基，并随后将所述细胞在含有毒蜥外泌肽1、IGF-1和HGF的培养基中进行培养，来使表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。该方法的一个例子在D’Amour等人，NatureBiotechnology，2006中公开。

例如，可通过将表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞在含有DAPT和毒蜥外泌肽4的培养基中进行培养，来使表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。该方法的一个例子在D’Amour等人，NatureBiotechnology，2006中公开。

例如，可通过将表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞在含有毒蜥外泌肽4的培养基中进行培养，来使表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。该方法的一个例子在D’Amour等人，NatureBiotechnology，2006中公开。

在本发明的一个方面，根据转让给LifeScan，Inc.的美国专利申请系列号11/736,908中公开的方法，通过用可抑制Notch信号传导途径的因子处理表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞，来使表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。

在本发明的一个方面，根据转让给LifeScan，Inc.的美国专利申请系列号11/779,311中公开的方法，通过用可抑制Notch信号传导途径的因子处理表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞，来使表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。

在本发明的一个方面，根据转让给LifeScan，Inc.的美国专利申请系列号60/953,178中公开的方法，通过用抑制Notch信号传导途径的因子处理表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞，来使表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。

在本发明的一个方面，通过根据序列号为60/990,529的美国专利申请中公开的方法处理表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞，来使表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。

可以将表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞用至少一种其他额外的因子进行处理，这些因子可增强表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞的形成。作为另一种选择，所述至少一种其他额外的因子可增强通过本发明方法形成的表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞的增殖。另外，所述至少一种其他额外的因子可增强通过本发明方法形成的表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞形成其他细胞类型的能力，或可改善任意其他额外分化步骤的效率。

所述至少一种额外的因子可以是(例如)烟酰胺、TGF-β家族的成员(包括TGF-β1、2和3)、血清白蛋白、成纤维细胞生长因子家族的成员、血小板衍生生长因子-AA和-BB、富血小板血浆、胰岛素生长因子(IGF-I、II)、生长分化因子(例如，GDF-5、-6、-8、-10、-11)、胰胰高血糖素样肽-I和II(GLP-I和II)、GLP-1和GLP-2模拟体、毒蜥外泌肽-4、视黄酸、甲状旁腺激素、胰岛素、孕酮、抑酶肽、氢化可的松、乙醇胺、β巯基乙醇、表皮生长因子(EGF)、胃泌素I和II、铜螯合剂(例如，三亚乙基五胺)、毛喉素、丁酸-Na、激活素、β细胞素、ITS、成头蛋白、神经突生长因子、nodal、丙戊酸、曲古抑菌素A、丁酸钠、肝细胞生长因子(HGF)、鞘氨醇-1、VEGF、MG132(EMD，CA)、N2和B27添加剂(Gibco，CA)、甾体类生物碱(例如，环巴胺(EMD，CA))、角质细胞生长因子(KGF)、Dickkopf蛋白家族、牛垂体提取物、胰岛新生相关蛋白(INGAP)、印第安豪猪蛋白、音猬蛋白、蛋白酶体抑制剂、notch通路抑制剂、音猬蛋白抑制剂或它们的组合。

所述至少一种其他额外的因子可由从胰腺细胞系(例如PANC-1(ATCC No：CRL-1469)、CAPAN-1(ATCC No：HTB-79)、BxPC-3(ATCC No：CRL-1687)、HPAF-II(ATCC No：CRL-1997))、肝细胞系例如HepG2(ATCC No：HTB-8065)、肠细胞系例如FHs 74(ATCC No：CCL-241)获得的调理培养基提供。

表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞的检测

胰腺内分泌谱系特征性标志物是本领域技术人员所熟知的，并且其他胰腺内分泌谱系特征性标志物不断被鉴别。这些标志物可用于确定根据本发明处理过的细胞是否已分化而获得胰腺内分泌谱系特征性特性。胰腺内分泌谱系特异性标志物包括一种或多种转录因子例如NGN3、NEURO或ISL1的表达。

β细胞谱系特征性标志物是本领域技术人员熟知的，并且其他的β细胞谱系特征性标志物有待继续鉴别。这些标志物可用于确定根据本发明处理过的细胞是否已分化而获得β细胞谱系特征性特性。除了别的以外，β细胞谱系特异性特征包括一种或多种转录因子例如PDX1、NKX2.2、NKX6.1、ISL1、PAX6、PAX4、NEUROD、HNF1β、HNF6、HNF3β或MAFA的表达。这些转录因子在内分泌细胞鉴别领域中已得到公认。参见例如Edlund(Nature Reviews Genetics 3：524-632(2002))。

可通过将处理过的细胞群体暴露于可特异性识别由表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞表达的蛋白质标志物的试剂(例如抗体)来确定分化效率。或者，可以通过将处理过的细胞群暴露于特别地识别以下蛋白质标志物的试剂(例如抗体)来测定分化效率，该标志物由表达β细胞谱系特征性标志物的细胞表达。

用于评估蛋白质标志物和核酸标志物在培养的或分离的细胞中的表达的方法是本领域的标准方法。这些方法包括定量逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)、RNA印记、原位杂交(参见例如，Current Protocols in MolecularBiology(Ausubel等人(编辑)，2001增刊))以及免疫测定法(例如切片材料的免疫组织化学分析)、蛋白印记以及针对完整细胞中可触及的标志物的流式细胞检测分析(FACS)(参见例如，Harlow和Lane，Using Antibodies：A Laboratory Manual，New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press(1998))。

在本发明的一个方面，通过在处理后测定给定细胞培养物中胰岛素阳性细胞的百分比来确定分化的效率。在一个实施例中，本发明方法在给定培养物中产生约100％的胰岛素阳性细胞。在一个替代实施例中，本发明方法在给定培养物中产生约90％的胰岛素阳性细胞。在一个替代实施例中，本发明方法在给定培养物中产生约80％的胰岛素阳性细胞。在一个替代实施例中，本发明方法在给定培养物中产生约70％的胰岛素阳性细胞。在一个替代实施例中，本发明方法在给定培养物中产生约60％的胰岛素阳性细胞。在一个替代实施例中，本发明方法在给定培养物中产生约50％的胰岛素阳性细胞。在一个替代实施例中，本发明方法在给定培养物中产生约40％的胰岛素阳性细胞。在一个替代实施例中，本发明方法在给定培养物中产生约30％的胰岛素阳性细胞。在一个替代实施例中，本发明方法在给定培养物中产生约20％的胰岛素阳性细胞。在一个替代实施例中，本发明方法在给定培养物中产生约10％的胰岛素阳性细胞。在一个替代实施例中，本发明方法在给定培养物中产生约5％的胰岛素阳性细胞。

在本发明的一个方面，通过测定葡萄糖刺激的胰岛素分泌来确定分化的效率，胰岛素分泌可通过测量由细胞释放的C-肽的量测定。在一个实施例中，由本发明方法产生的细胞可产生约1000ng C-肽/pg DNA。在一个替代实施例中，由本发明方法产生的细胞可产生约900ng C-肽/pg DNA。在一个替代实施例中，由本发明方法产生的细胞可产生约800ng C-肽/pg DNA。在一个替代实施例中，由本发明方法产生的细胞可产生约700ng C-肽/pgDNA。在一个替代实施例中，由本发明方法产生的细胞可产生约600ng C-肽/pg DNA。在一个替代实施例中，由本发明方法产生的细胞可产生约500ng C-肽/pg DNA。在一个替代实施例中，由本发明方法产生的细胞可产生约400ng C-肽/pg DNA。在一个替代实施例中，由本发明方法产生的细胞可产生约500ng C-肽/pg DNA。在一个替代实施例中，由本发明方法产生的细胞可产生约400ng C-肽/pg DNA。在一个替代实施例中，由本发明方法产生的细胞可产生约300ng C-肽/pg DNA。在一个替代实施例中，由本发明方法产生的细胞可产生约200ng C-肽/pg DNA。在一个替代实施例中，由本发明方法产生的细胞可产生约100ng C-肽/pg DNA。在一个替代实施例中，由本发明方法产生的细胞可产生约90ng C-肽/pg DNA。在一个替代实施例中，由本发明方法产生的细胞可产生约80ng C-肽/pg DNA。在一个替代实施例中，由本发明方法产生的细胞可产生约70ng C-肽/pg DNA。在一个替代实施例中，由本发明方法产生的细胞可产生约60ng C-肽/pg DNA。在一个替代实施例中，由本发明方法产生的细胞可产生约50ng C-肽/pg DNA。在一个替代实施例中，由本发明方法产生的细胞可产生约40ng C-肽/pgDNA。在一个替代实施例中，由本发明方法产生的细胞可产生约30ng C-肽/pg DNA。在一个替代实施例中，由本发明方法产生的细胞可产生约20ngC-肽/pg DNA。在一个替代实施例中，由本发明方法产生的细胞可产生约10ng C-肽/pg DNA。

疗法

在一个方面，本发明提供了一种用于治疗患有1型糖尿病，或有发展1型糖尿病风险的患者的方法。此方法涉及：培养多能干细胞，在体外将多能干细胞分化成β-细胞谱系，以及将β-细胞谱系的细胞植入患者体内。

在另一个方面，本发明提供了一种用于治疗患有2型糖尿病，或有发展2型糖尿病风险的患者的方法。此方法涉及：培养多能干细胞，在体外将多能干细胞分化成β-细胞谱系，以及将β-细胞谱系的细胞植入患者体内。

如果合适，可用有利于该植入细胞存活和功能的药剂或生物活性剂对患者进行进一步处理。除了别的以外，这些试剂可包括(例如)胰岛素、TGF-β家族的成员(包括TGF-β1、2和3)、骨形态发生蛋白(BMP-2、-3、-4、-5、-6、-7、-11、-12和-13)、成纤维细胞生长因子-1和-2、血小板衍生生长因子-AA和-BB、富血小板血浆、胰岛素生长因子(IGF-I、II)、生长分化因子(例如，GDF-5、-6、-7、-8、-10、-15)、血管内皮细胞衍生生长因子(VEGF)、多效蛋白(pleiotrophin)、内皮素。其他药物化合物可包括(例如)烟酰胺、胰高血糖素样肽-I(GLP-1)和胰高血糖素样肽-II、GLP-1和2模拟体、毒蜥外泌肽-4、视黄酸、甲状旁腺激素、MAPK抑制剂例如美国已公布的专利申请2004/0209901和美国已公布的专利申请2004/0132729中所公开的化合物。

可使多能干细胞在移植进接受者前分化成胰岛素生成细胞。在一个具体实施例中，在移植到受体中之前，使多能干细胞完全分化成β-细胞。作为另一种选择，可将多能干细胞以未分化状态或部分分化的状态移植进接受者中。可在该接受者中发生进一步分化。

定形内胚层细胞或者胰腺内胚层细胞或者β细胞可作为分散细胞或形成集落，通过输注到肝门静脉中植入。作为另一种选择，可将细胞设置在生物相容性的可降解聚合物型支持物中、多孔的非可降解性装置中或可进行封装以保护其免受宿主免疫应答的破坏。可将细胞移植进接受者中的合适位置内。植入位点包括(例如)肝脏、天然的胰腺、肾包膜下空间、网膜、腹膜、浆膜下空间、肠、胃或皮下袋。

为了增强植入细胞的进一步分化、存活率或活性，可在施用细胞之前、与其同时或之后施用额外的因子，例如生长因子、抗氧化剂或抗炎剂。在某些实施例中，利用生长因子使施用的细胞在体内分化。这些因子可由内源性细胞分泌并原位暴露于所施用的细胞。可通过本领域已知的内源生长因子或外源施用的生长因子的任意组合来诱导植入细胞进行分化。

移植中所用的量取决于多种因素，包括患者的状况和对该疗法的响应，并且可由本领域技术人员确定。

在一个方面，本发明提供了一种用于治疗患有糖尿病，或有发展糖尿病风险的患者的方法。本方法涉及：培养多能干细胞，在体外使培养的细胞分化成β-细胞谱系，以及将细胞掺入三维支承体中。在移植进患者前，可将该细胞在该支持物上体外维持。作为另一种选择，可将包含该细胞的支持物直接移植进患者中而无需进行额外的体外培养。可任选将至少一种有利于植入细胞的存活和功能的药剂掺入该支持物中。

适用于本发明目的的支持材料包括可用于组织修复的组织模板、导管、屏障物和贮器。具体地讲，已经在体外和体内用于生物组织重建或再生，以及用于递送趋化剂来诱导组织生长的泡沫、海绵、凝胶、水凝胶、纺织物和非织造结构形式的合成材料和天然材料适用于实践本发明的方法。参见，例如在美国专利5,770,417、美国专利6,022,743、美国专利5,567,612、美国专利5,759,830、美国专利6,626,950、美国专利6,534,084、美国专利6,306,424、美国专利6,365,149、美国专利6,599,323、美国专利6,656,488、美国已公布的专利申请2004/0062753 A1、美国专利4,557,264和美国专利6,333,029中所公开的材料。

为了形成含有药剂的支承体，可在形成支承体前将药剂与聚合物溶液混合。作为另一种选择，可将药剂涂覆于制好的支持物上，优选在存在药物载体的情况下进行。药物可以液体、细分固体或任何其他合适的物理形式存在。作为另一种选择，可将赋形剂加入支持物中以改变药剂的释放速率。在一个替代实施例中，将至少一种为抗炎化合物的药物化合物掺入支持物中，例如在美国专利6,509,369中所公开的化合物。

可将至少一种为抗凋亡化合物的药物化合物掺入支持物中，例如美国专利6,793,945中所公开的化合物。

可将至少一种为纤维变性抑制剂的药物化合物掺入支持物中，例如美国专利6,331,298中所公开的化合物。

支持物还可掺有至少一种能够增强血管生成的药物化合物，例如美国已公布的专利申请2004/0220393和美国已公布的专利申请2004/0209901中所公开的化合物。

支持物还可掺有至少一种为免疫抑制化合物的药物化合物，例如美国已公布的专利申请2004/0171623中所公开的化合物。

支承体也可以掺有至少一种为生长因子的药物化合物，例如TGF-β家族的成员(包括TGF-β1、2和3)、骨形态发生蛋白(BMP-2、-3、-4、-5、-6、-7、-11、-12和-13)、成纤维细胞生长因子-1和-2、血小板衍生生长因子-AA和-BB、富血小板血浆、胰岛素生长因子(IGF-I、II)、生长分化因子(例如，GDF-5、-6、-8、-10、-15)、血管内皮细胞衍生生长因子(VEGF)、多效蛋白、内皮素等等。其他药物化合物可包括(例如)烟酰胺、缺氧诱导因子1-α、胰胰高血糖素样肽-I(GLP-1)、GLP-1和GLP-2模拟体、毒蜥外泌肽-4、nodal、成头蛋白、NGF、视黄酸、甲状旁腺激素、腱生蛋白-C、弹性蛋白原、凝血酶衍生的肽、凯萨林菌素(cathelicidin)、防御素(defensin)、层粘连蛋白、含有粘附性细胞外基质蛋白例如纤粘蛋白和玻璃粘连蛋白的细胞结合结构域和肝素结合结构域的生物肽、MAPK抑制剂(例如在美国已公布的专利申请2004/0209901和美国已公布的专利申请2004/0132729中所公开的化合物)。

可通过将细胞简单地沉积在该支架上来实现将本发明细胞掺入支架中。细胞可通过简单扩散进入支架中(J.Pediatr.Surg.23(1 Pt 2)：3-9(1988))。已经发展了若干其他方法来增强细胞接种的效率。例如，已经将转瓶用于将软骨细胞接种于聚乙醇酸支架上(Biotechnol.Prog.14(2)：193-202(1998))。用于细胞接种另一种方法是利用离心，这种离心产生最小的应力给接种的细胞并增强接种效率。例如，Yang等人开发了一种细胞接种方法(J.Biomed.Mater.Res.55(3)：379-86(2001))，称为离心细胞固定(Centrifugational Cell Immobilization，CCI)。

本发明通过(但不限于)以下实例进一步说明。

实例

将本发明的具体实施方式部分分成以下几个分部分，来描述或举例说明本发明的某些特征、实施例或应用，这是为了使公开内容清楚起见，并非限制本发明。

实例1

人胚胎干细胞培养物

从WiCell Research Institute，Inc.，(Madison，WI)获得人胚胎干细胞系H1、H7和H9，并根据该来源公司提供的说明进行培养。也可将人胚胎干细胞接种于包被有以1∶30稀释的低生长因子MATRIGELTM(BDBiosciences；目录号356231)的板上并在补充有8ng/ml的bFGF(R&DSystems；目录号233-FB)的MEF调理培养基中培养。用胶原酶IV(Invitrogen/GIBCO；目录号17104-019)、分散酶(Invitrogen；目录号17105-041)或释放酶CI酶(Roche；目录号11814435001)将在MATRIGELTM上培养的细胞作为簇进行常规传代。在某些情况下，用ACCUTASE(Sigma；目录号A6964)将细胞作为单细胞进行传代。

将在这些实例中使用的人胚胎干细胞维持在未分化、多能状态，平均每四天传代一次。传代通过这样进行：使细胞培养物在37℃下暴露于胶原酶溶液(1或10mg/ml；Sigma-Aldrich)10至30分钟，然后用移液管头小心刮擦以回收细胞簇。让细胞簇借重力沉淀下来，然后进行洗涤以除去残余的胶原酶。将细胞簇以1∶3的比例分传以进行例行维持培养，或以1∶1比例分传以进行后面的测定。将所有人胚胎干细胞系以小于50的传代数进行维持，并例行评估核型表型是否正常和支原体污染是否存在。

实例2

表达定形内胚层谱系特征性标志物细胞形成的生物测定法

激活素A是各种细胞类型分化(包括胚胎干细胞分化成定形内胚层的分化)的重要介体。当用激活素A和Wnt3a的组合处理人胚胎干细胞时，代表定形内胚层的多种基因上调。测量人胚胎干细胞中的这种分化的生物测定法以小型化设计适于用于筛选目的96孔板。利用采用市售激活素A和Wnt3a重组蛋白的处理并测量被视为定形内胚层的代表性标志物的转录因子SOX17的蛋白质表达来完成验证。

活细胞分析：简而言之，将H1人胚胎干细胞簇在低生长因子MATRIGELTM(Invitrogen；目录号356231)包被的组织培养塑料上培养。细胞通过以下方式来传代：利用胶原酶(Invitrogen；目录号17104-019)处理并小心刮擦、洗涤以除去残余酶，并以1∶1(表面面积)的比例接种于低生长因子MATRIGELTM包被的96孔黑色板(Packard ViewPlates；PerkinElmer；目录号6005182)上。让细胞成簇贴附，然后在1至3天时间内恢复对数期生长，每天用100μl/孔的补充有8ng/ml的bFGF(R&D Systems；目录号233-FB)的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)调理培养基饲养。

在测定法的最开始将各板的孔在PBS(Invitrogen；目录号14190)中洗涤两次，然后将DMEM:F12基础培养基(Invitrogen；目录号11330-032)中的测试样品的等分试样(100μl)添加至各孔。测试条件一式三份进行，在总共四天测定期间每隔一天通过从各孔抽吸出培养基并用测试样品替换培养基来进行饲养。在测定法的第一天和第二天，将添加至测定孔的测试样品稀释于具有0.5％FCS(HyClone；目录号SH30070.03)和20ng/ml Wnt3a(R&DSystems；目录号1324-WN)的DMEM:F12中。在测定法的第三天和第四天，将添加至测定孔的测试样品稀释于具有2％FCS但没有任何Wnt3a的DMEM:F12中。阳性对照样品由如下组成：在整个测定法中以100ng/ml的浓度加入的重组人激活素A(PeproTech；目录号120-14)和在第1天和第2天加入到Wnt3a(20ng/ml)。阴性对照样品省略了用激活素A和Wnt3a两者进行的处理。

高内涵分析：在四天的培养结束时，将测试平板用PBS(Invitrogen；目录号14190)洗涤两次，用4％多聚甲醛(Alexis Biochemical；目录号ALX-350-011)在室温下固定20分钟，然后用PBS洗涤三次并用0.5％Triton X-100(Sigma；目录号T8760-2)在室温下透化处理20分钟。将细胞再用PBS洗涤三次，然后用4％鸡血清(Invitrogen；目录号16110082)在PBS中于室温下封闭30分钟。将一抗(山羊抗人SOX17；R&D Systems；目录号AF1924)在4％鸡血清中以1∶100稀释，在室温下加至每个孔保持一小时。将Alexa Fluor 488缀合的二抗(鸡抗山羊IgG；Molecular Probes；目录号AZ1467)在PBS中以1∶200稀释，并在用PBS洗涤三次后加至每个样品孔。为了对细胞核进行复染，在室温下加入4μg/mlHoechst 33342(Invitrogen；目录号H3570)保持十分钟。将板用PBS洗涤一次，并保留在100μl/孔PBS中以进行成像。

用IN Cell Analyzer 1000细胞分析仪(GE Healthcare)进行成像，对于用Hoechst 33342和Alexa Fluor 488染色的细胞采用51008bs二向分色镜。根据阳性对照孔并根据单独用二抗染色的无处理阴性对照孔来优化曝光时间。每孔获取15个视野的图像，以补偿生物鉴定和后续染色程序中的任何细胞损失。用IN Cell Developer Toolbox 1.7(GE Healthcare)软件从每个孔获得总细胞数目和总SOX17强度的测量值。基于灰阶水平(基线范围100-300)和核大小确定细胞核的分裂情况。计算每个重复数据集的平均值和标准偏差。总SOX17蛋白表达记录为总强度或累积强度，该强度定义为细胞总荧光乘以细胞面积。基于灰阶范围在200至3500之间的接受标准来去除背景。通过将每个孔的总强度除以阳性对照的平均总强度，将总强度数据进行归一化。对于每个重复组，对归一化的数据计算平均值和标准偏差。

图1示出了对该筛选测定法的验证，检验了市售激活素A(PeproTech)的两倍稀释曲线并同时测量了细胞数(图1A)和SOX17强度(图1B)两者。通常在100-200ng/ml范围内观察到激活素A对诱导SOX17表达的最佳效果，其中EC50为30-50ng/ml。在测定法的第1天和第2天在处理中忽略Wnt3a不能产生可测量的SOX17表达(图1B，白色柱条)。没有激活素A也不能产生SOX17表达(图1B)。

实例3

初步筛选：在没有激活素A的情况下本发明化合物对人胚胎干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的作用

多能干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞通过一系列受体-配体相互作用来介导，所述受体-配体相互作用继而激活受体激酶，从而引起下游底物的磷酸化和核转运，最终调控特定靶基因的表达。在一些细胞类型中这些信号级联放大的最佳活化可能需要抑制相对的默认通路。在其他情况下，涉及较大激酶家族的备选成员的冗余通路可能部分代替一种或多种信号转导分子。在其他情况下，经典和非经典通路可能因不同引发刺激物而分道，但可能会引起类似的功能结果。

基于细胞的功能筛选是一种鉴别新靶点的方法并且是可影响特定细胞响应的方法。一种非常有效的方法涉及一系列的迭代筛选，其中一次筛选的先导物(lead)或命中物(hit)被并入进后续筛选。或者，将一系列的不同变量以组合方式(例如，生长因子与激酶抑制剂组合)并入，以鉴别对细胞分化的新作用。在这种情况下，对包括苯胺-吡啶并三嗪、环苯胺-吡啶并三嗪及其合成中的中间结构的小分子库检验其在人胚胎干细胞的定形内胚层分化期间重要的特性，尤其是检验其在低血清且没有生长因子激活素A的情况下在“第一”分化步骤结束时保持或提高细胞数的作用。

筛选测定法

细胞测定接种：简而言之，将H1人胚胎干细胞簇在低生长因子MATRIGELTM(Invitrogen；目录号356231)包被的组织培养塑料上培养。细胞通过以下方式来传代：利用胶原酶(Invitrogen；目录号17104-019)处理并小心刮擦、洗涤以除去残余酶，并以1∶1(表面面积)的比例使用100μl/孔的体积在低生长因子MATRIGELTM包被的96孔黑色板(PackardViewPlates；PerkinElmer；目录号6005182)上均匀分散接种。让细胞成簇贴附，然后在1至3天时间内恢复对数期生长，每天用补充有8ng/ml的bFGF(R&D Systems；目录号233-FB)的MEF调理培养基饲养。在整个测定法期间，将板在加湿箱中维持在37℃、5％CO2下。

化合物和测定法的准备：将所测试的化合物制备为96孔板形式的5mM母液供用，其溶解于100％DMSO(Sigma；目录号D2650)并保存于-80℃下。将库化合物在50mM HEPES(Invitrogen；目录号15630-080)、20％DMSO中进一步稀释至0.2mM的中间浓度并保存于4℃下。测试条件一式三份进行，在四天测定期间每隔一天供料。如下开始初级筛选测定法：从每个孔抽吸掉培养基，然后在PBS(Invitrogen；目录号14190)中洗涤三次以除去残余的生长因子和血清。在测定法的第一天，重新添加200ml/孔的测试体积，其含有补充有0.5％FCS(HyClone；目录号SH30070.03)和20ng/ml Wnt3a(R&D Systems；目录号1324-WN)加2.5mM测试化合物的DMEM:F12基础培养基(Invitrogen；目录号11330-032)。在测定法的第三天，重新添加200ml每孔的测试体积，其含有补充有2％FCS加2.5mM测试化合物但没有Wnt3a的DMEM:F12基础培养基。阳性对照样品含有补充有FCS的相同基础培养基，在整个四天的测定法期间用100ng/ml重组人激活素A(PeproTech；目录号120-14)代替测试化合物，以及在仅在第1天和第2天添加Wnt3a(20ng/ml)。阴性对照样品含有补充有FCS的DMEM:F12基础培养基，在第1天和第2天添加Wnt3a，但省去激活素A。

高内涵分析：在四天的培养结束时，将测试平板用PBS(Invitrogen；目录号14190)洗涤两次，用4％多聚甲醛(Alexis Biochemical；目录号ALX-350-011)在室温下固定20分钟，然后用PBS洗涤三次并用0.5％Triton X-100(Sigma；目录号T8760-2)在室温下透化处理20分钟。将细胞再用PBS洗涤三次，然后用4％鸡血清(Invitrogen；目录号16110082)在PBS中于室温下封闭30分钟。将一抗(山羊抗人SOX17；R&D Systems；目录号AF1924)在4％鸡血清中以1∶100稀释，在室温下加至每个孔保持一小时。将Alexa Fluor 488缀合的二抗(鸡抗山羊IgG；Molecular Probes；目录号AZ1467)在PBS中以1∶200稀释，并在用PBS洗涤三次后加至每个样品孔。为了对细胞核进行复染，在室温下加入4μg/mlHoechst 33342(Invitrogen；目录号H3570)保持十分钟。将板用PBS洗涤一次，并保留在100μl/孔PBS中以进行成像。

用IN Cell Analyzer 1000细胞分析仪(GE Healthcare)进行成像，对于用Hoechst 33342和Alexa Fluor 488染色的细胞采用51008bs二向分色镜。根据阳性对照孔并根据单独用二抗染色的无处理阴性对照孔来优化曝光时间。每孔获取15个视野的图像，以补偿生物鉴定和后续染色程序中的任何细胞损失。用IN Cell Developer Toolbox 1.7(GE Healthcare)软件从每个孔获得总细胞数目和总SOX17强度的测量值。基于灰阶水平(基线范围100-300)和核大小确定细胞核的分裂情况。计算每个重复数据集的平均值和标准偏差。总SOX17蛋白表达记录为总强度或累积强度，该强度定义为细胞总荧光乘以细胞面积。基于灰阶范围在200至3500之间的接受标准来去除背景。通过将每个孔的总强度除以阳性对照的平均总强度，将总强度数据进行归一化。对于每个重复组，对归一化的数据计算平均值和标准偏差。

表1示出了对所测化合物的初步筛选的结果，显示其在不存在激活素A的情况下对人胚胎干细胞向表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的分化的作用。结果包括对细胞数和SOX17强度两者的定量测量，其中对一式三份重复孔的各个数据点求平均值，并使用各孔中相同的视野针对各参数来分析各个数据点。转录因子SOX17的表达被视为可指示定形内胚层分化。从八个96孔板获得初步筛选结果。板与板的变化性由于在各板上包含单独的阳性和阴性对照而减少。将结果进行归一化并表示为阳性对照的百分比。重点放在测定法结束时细胞数的保持或扩增。

表2列出了27种化合物的子集及其从初步筛选得到的分析结果，其中尽管在筛选测定法中没有激活素A，但这些命中物似乎将细胞数保持在等于或优于阳性对照的水平。

在一些情况下，在没有激活素A的情况下诱导了SOX17的表达，例如，环苯胺-吡啶并三嗪化合物35和化合物22。

选择表2所示的化合物，用以进一步评估在不存在激活素A的情况下对人胚胎干细胞向表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化的作用。

实例4

二次筛选：在没有激活素A的情况下本发明化合物与EGF/FGF4对人胚胎干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的作用

恒定量的Wnt3a的情况下激活素A的滴定曲线显示在DE分化期间的至少两种作用：1)维持细胞数或防止细胞损失；以及2)诱导DE的标志物，例如SOX17表达(实例2)。实例3的初步筛选鉴定了相对于单独添加激活素A/Wnt3a可在测定法中维持类似的或改善的细胞数的化合物。进行二次筛选测定以评估所鉴定的化合物与其他生长因子(特别是EGF和FGF4)组合对定形内胚层生成的作用。

细胞测定接种：将H1人胚胎干细胞簇在低生长因子MATRIGELTM(Invitrogen；目录号356231)包被的组织培养塑料上培养。细胞通过以下方式来传代：利用胶原酶(Invitrogen；目录号17104-019)处理并小心刮擦、洗涤以除去残余酶，并以1∶1(表面面积)的比例使用100μl/孔的体积在低生长因子MATRIGELTM包被的96孔黑色板(Packard ViewPlates；PerkinElmer；目录号6005182)上均匀分散接种。让细胞成簇贴附，然后在1至3天时间内恢复对数期生长，每天用补充有8ng/ml的bFGF(R&DSystems；目录号233-FB)的MEF调理培养基饲养。在整个测定法期间，将板在加湿箱中维持在37℃、5％CO2下。

化合物和生长因子的准备：EGF(R&D Systems；目录号236-EG)和FGF4(R&D Systems；目录号235-F4)的母液浓度为250ng/ml，各溶于具有0.1％BSA(Sigma；目录号A7888)的PBS中。将化合物制备为96孔板形式的5mM母液供用，其溶于100％DMSO(Sigma；目录号D2650)中并保存于-80℃下。将化合物在50mM HEPES(Invitrogen；目录号15630-080)、20％DMSO中进一步稀释至0.2mM的中间浓度并保存于4℃下。所有生长因子和抑制剂在深孔96孔聚丙烯板中制备，在测定法开始时在DMEM:F12基础培养基中稀释至5x中间母液并保存于4℃下。

进行二次筛选测定法，重复检验三次并在四天测试时间段内隔天供料。如下开始测定：从每个孔抽吸掉培养基，然后在PBS中洗涤三次以除去残余的生长因子和血清。每孔重新添加含有DMEM:F12基础培养基(Invitrogen；目录号11330-032)的80ml的测试体积，所述基础培养基补充有0.625％FCS(HyClone；目录号SH30070.03)、25ng/ml Wnt3a(R&DSystems)和3.125μM化合物加20μl生长因子的5x母液，以在该测定法中得到0.5％FCS、20ng/ml Wnt3a和2.5μM化合物加50ng/ml EGF和50ng/mlFGF4的最终浓度。阳性对照孔(100ml/孔)装有补充有0.5％FCS、20ng/mlWnt3a和100ng/m激活素A的相同基础培养基。阴性对照孔(100μl/孔)装有补充有0.5％FCS和20ng/ml Wnt3a但省去激活素A的相同基础培养基。

在第3天，抽吸孔并每孔供给80ml DMEM:F12基础培养基，所述基础培养基补充有2.5％FCS(HyClone)和3.125μM化合物加20μl生长因子的5x母液，以在该测定法中得到2％FCS和2.5mM化合物(省去Wnt3a)加50ng/ml EGF和FGF4的最终浓度。阳性对照孔(100μl/孔)装有补充有2％FCS和100ng/ml激活素A但省去Wnt3a的相同基础培养基。阴性对照孔(100μl/孔)装有补充有2％FCS但省去激活素A和Wnt3a两者的相同基础培养基。

高内涵分析：在四天的培养结束时，用PBS洗涤测试平板两次，用4％多聚甲醛(Alexis Biochemical；目录号ALX-350-011)在室温下固定20分钟，然后用PBS洗涤三次并用0.5％Triton X-100(Sigma；目录号T8760-2)在室温下透化处理20分钟。将细胞再用PBS洗涤三次，然后用4％鸡血清(Invitrogen；目录号16110082)在PBS中于室温下封闭30分钟。将一抗(山羊抗人SOX17；R&D Systems；目录号AF1924)在4％鸡血清中以1∶100稀释，在室温下加至每个孔保持一小时。将Alexa Fluor 488缀合的二抗(鸡抗山羊IgG；Molecular Probes；目录号AZ1467)在PBS中以1∶200稀释，并在用PBS洗涤三次后加至每个样品孔。为了对细胞核进行复染，在室温下加入4μg/ml Hoechst 33342(Invitrogen；目录号H3570)保持十分钟。将板用PBS洗涤一次，并保留在100μl/孔PBS中以进行成像。

用IN Cell Analyzer 1000细胞分析仪(GE Healthcare)进行成像，对于用Hoechst 33342和Alexa Fluor 488染色的细胞采用51008bs二向分色镜。根据阳性对照孔并根据单独用二抗染色的无处理阴性对照孔来优化曝光时间。每孔获取15个视野的图像，以补偿生物鉴定和后续染色程序中的任何细胞损失。用IN Cell Developer Toolbox 1.7(GE Healthcare)软件从每个孔获得总细胞数目和总SOX17强度的测量值。基于灰阶水平(基线范围100-300)和核大小确定细胞核的分裂情况。计算每个重复数据集的平均值和标准偏差。总SOX17蛋白表达记录为总强度或累积强度，该强度定义为细胞总荧光乘以细胞面积。基于灰阶范围在200至3500之间的接受标准来去除背景。通过将每个孔的总强度除以阳性对照的平均总强度，将总强度数据进行归一化。对于每个重复组，对归一化的数据计算平均值和标准偏差。

表3A示出了所检测的两种生长因子EGF和FGF4(各50ng/ml)与表2所示苯胺-吡啶并三嗪化合物结合对人胚胎干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的作用的结果。结果以对SOX17表达的最佳效果降序排列。尽管这些化合物对SOX17表达的作用被认为相对于激活素A/Wnt3a阳性对照较弱，但对这些化合物中一些的响应被认为是显著的。例如，在测定期间就保持较高的每孔细胞数目而言，所述化合物的选择看起来具有独特的性质，大概是通过防止细胞凋亡或通过调节细胞周期来实现。另外，这些化合物看起来与EGF和FGF4协同作用而促进适度的定形内胚层分化，这通过SOX17表达测量。最有效的化合物在表3B中列出。在该测定法中与EGF和FGF4结合检验的其他化合物对诱导SOX17表达无效，但可在测定中保持细胞数(如，化合物90：85％细胞数；2％SOX17表达)。

实例5

在没有激活素A的情况下本发明化合物与其他因子结合对人胚胎干细胞向表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化的作用

进行二次测试以评价本发明化合物与其他各种从文献已知可调控定形内胚层分化的生长因子或化合物结合的作用。

细胞测定接种：将H1人胚胎干细胞簇在低生长因子MATRIGELTM(Invitrogen；目录号356231)包被的组织培养塑料上培养。细胞通过以下方式来传代：利用胶原酶(Invitrogen；目录号17104-019)处理并小心刮擦、洗涤以除去残余酶，并以1∶1(表面面积)的比例使用100μl/孔的体积在低生长因子MATRIGELTM包被的96孔黑色板(Packard ViewPlates；PerkinElmer；目录号6005182)上均匀分散接种。让细胞成簇贴附，然后在1至3天时间内恢复对数期生长，每天用补充有8ng/ml的bFGF(R&DSystems；目录号233-FB)的MEF调理培养基饲养。在整个测定法期间，将板在加湿箱中维持在37℃、5％CO2下。

化合物和生长因子的准备：从R&D Systems购得的生长因子母液为EGF(目录号236-EG)、FGF4(目录号235-F4)、PDGF-A(目录号221-AA)、PDGF-B(目录号220-BB)、PDGF-C(目录号1687-CC)、PDGF-D(目录号1159-SB)、PDGF-A/B(目录号222-AB)、VEGF(目录号293-VE)、BMP-1(目录号1927-ZN)、BMP-2(目录号355-BM)、BMP-4(目录号314-BP)、BMP-6(目录号507-BP)、BMP-7(目录号222-AB)、BMP-2/7(目录号3229-BM)。所检测的其他试剂如下购得：BMP-7(Sigma；目录号B1434)、LY294002(Cayman；目录号70920)、PD98059、U0126、U0124(EMD Biosciences；目录号453710)、蝇蕈醇(Tocris；目录号0289)、荷包牡丹碱(biuculline)(Tocris；目录号0130)、丁酸钠(Sigma；目录号B5887)。将所有生长因子溶于具有0.1％BSA(Sigma；目录号A7888)的PBS中并冷冻保存于-80℃下。将小分子溶于100％DMSO(Sigma；目录号D2650)中并冷冻保存于-80℃下。将化合物制备为96孔板形式的5mM母液供用，其溶于100％DMSO中并保存于-80℃下。将本发明的化合物在50mM HEPES(Invitrogen；目录号15630-080)、20％DMSO中进一步稀释至0.2mM的中间浓度并保存于4℃下。所有生长因子和抑制剂在深孔96孔聚丙烯板中制备，在测定法开始时在DMEM:F12基础培养基中稀释至5x中间母液并保存于4℃下。

进行二次筛选测定法，重复检验三次并在四天测试时间段内隔天供料。如下开始测定：从每个孔抽吸掉培养基，然后在PBS中洗涤三次以除去残余的生长因子和血清。每孔重新添加含有DMEM:F12基础培养基(Invitrogen；目录号11330-032)的80μl的测试体积，所述基础培养基补充有0.625％FCS(HyClone；目录号SH30070.03)、25ng/ml Wnt3a(R&DSystems)和3.125μM化合物加20ml生长因子或小分子的5x母液，以得到0.5％FCS、20ng/ml Wnt3a和2.5μM化合物的最终浓度。所有其余的生长因子以50ng/ml的最终测定浓度进行测试(EGF、FGF4、PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D、PDGF-A/B、VEGF、BMP-1、BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7、BMP-2/7)。所检测的小分子的最终测定浓度如下：蝇蕈醇(20μM)、PD98059(1μM)、LY294002(2.5mM)、U0124(1μM)、U0126(1μM)、丁酸钠(0.5mM)。阳性对照孔(100μl/孔)装有补充有0.5％FCS、20ng/ml Wnt3a和100ng/m激活素A的相同基础培养基。阴性对照孔(100μl/孔)装有补充有0.5％FCS和20ng/ml Wnt3a但省去激活素A的相同基础培养基。

在第3天，抽吸孔并每孔供给80μl DMEM:F12基础培养基，所述基础培养基补充有2.5％FCS(HyClone)和3.125μM环苯胺-吡啶并三嗪化合物加20ml生长因子或小分子的5x母液，以产生2％FCS和2.5μM化合物(省去Wnt3a)的最终浓度以及在第一天所标明的所有其余生长因子或小分子的最终浓度。阳性对照孔(100μl/孔)装有补充有2％FCS和100ng/ml激活素A但省去Wnt3a的相同基础培养基。阴性对照孔(100μl/孔)装有补充有2％FCS但省去激活素A和Wnt3a两者的相同基础培养基。

高内涵分析：在四天的培养结束时，用PBS洗涤测试平板两次，用4％多聚甲醛(Alexis Biochemical；目录号ALX-350-011)在室温下固定20分钟，然后用PBS洗涤三次并用0.5％Triton X-100(Sigma；目录号T8760-2)在室温下透化处理20分钟。将细胞再用PBS洗涤三次，然后用4％鸡血清(Invitrogen；目录号16110082)在PBS中于室温下封闭30分钟。将一抗(山羊抗人SOX17；R&D Systems；目录号AF1924)在4％鸡血清中以1∶100稀释，在室温下加至每个孔保持一小时。将Alexa F1uor 488缀合的二抗(鸡抗山羊IgG；Molecular Probes；目录号AZ1467)在PBS中以1∶200稀释，并在用PBS洗涤三次后加至每个样品孔。为了对细胞核进行复染，在室温下加入4μg/ml Hoechst 33342(Invitrogen；目录号H3570)保持十分钟。将板用PBS洗涤一次，并保留在100μl/孔PBS中以进行成像。

用IN Cell Analyzer 1000细胞分析仪(GE Healthcare)进行成像，对于用Hoechst 33342和Alexa Fluor 488染色的细胞采用51008bs二向分色镜。根据阳性对照孔并根据单独用二抗染色的无处理阴性对照孔来优化曝光时间。每孔获取15个视野的图像，以补偿生物鉴定和后续染色程序中的任何细胞损失。用IN Cell Developer Toolbox 1.7(GE Healthcare)软件从每个孔获得总细胞数目和总SOX17强度的测量值。基于灰阶水平(基线范围100-300)和核大小确定细胞核的分裂情况。计算每个重复数据集的平均值和标准偏差。总SOX17蛋白表达记录为总强度或累积强度，该强度定义为细胞总荧光乘以细胞面积。基于灰阶范围在200至3500之间的接受标准来去除背景。通过将每个孔的总强度除以阳性对照的平均总强度，将总强度数据进行归一化。对于每个重复组，对归一化的数据计算平均值和标准偏差。

表4示出了在用本发明化合物与各生长因子或其他小分子结合处理后人胚胎干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的结果。通常，BMP家族(BMP-1、BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7、BMP-2/7)的成员抑制SOX17表达或对其作用可忽略不计。在该测定法中检测的大部分小分子酶抑制剂(LY294002、PD98059、U0126、U0124、丁酸钠)也是如此。然而，PDGF家族(PDGF-A、-AB、-C和-D)的一些成员导致SOX17表达增加(激活素A/Wnt3a对照的10-25％)。显示SOX17表达类似增加的其他生长因子包括EGF(34％)、VEGF(18％)和FGF4(17％)，但FGF4不能支持细胞数的保持。与化合物35结合检测的小分子蝇蕈醇(GABAA受体激动剂)也导致SOX17表达适度增加；GABAA拮抗剂荷苞牡丹碱对SOX17表达没有作用。选择EGF、FGF4、PDGF-A、PDGF-B、PDGF-AB、PDGF-C和PDGF-D及蝇蕈醇用以在定形内胚层分化期间另行评价。

实例6

在没有激活素A的情况下本发明化合物与其他因子结合对人胚胎干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的作用

进行二次测定以评价不同化合物与其他各试剂的组合对定形内胚层分化的作用。选择用于本次筛选的其他试剂先前已显示在定形内胚层形成有适度提高，如用化合物17所测试以及如表5所指明的。在此筛选中，更广泛的一组化合物与这些试剂一起以单独成对比较或合并组合来评价。

细胞测定接种：将H1人胚胎干细胞簇在低生长因子MATRIGELTM(Invitrogen；目录号356231)包被的组织培养塑料上培养。细胞通过以下方式来传代：利用胶原酶(Invitrogen；目录号17104-019)处理并小心刮擦、洗涤以除去残余酶，并以1∶1(表面面积)的比例使用100μl/孔的体积在低生长因子MATRIGELTM包被的96孔黑色板(Packard ViewPlates；PerkinElmer；目录号6005182)上均匀分散接种。让细胞成簇贴附，然后在1至3天时间内恢复对数期生长，每天用补充有8ng/ml的bFGF(R&DSystems；目录号233-FB)的MEF调理培养基饲养。在整个测定法期间，将板在加湿箱中维持在37℃、5％CO2下。

化合物和生长因子的准备：从R&D Systems购得的生长因子母液是EGF(目录号236-EG)、FGF4(目录号235-F4)、PDGF-A(目录号221-AA)、PDGF-D(目录号1159-SB)、PDGF-A/B(目录号222-AB)和VEGF(目录号293-VE)。蝇蕈醇从Tocris购得(目录号0289)。将所有生长因子溶于具有0.1％BSA(Sigma；目录号A7888)的PBS并冷冻保存于-80℃下。将蝇蕈醇溶于100％DMSO(Sigma；目录号D2650)，并冷冻保存于-80℃下。将化合物制备为96孔板形式的5mM母液供用，其溶于100％DMSO中并保存于-80℃下。将化合物在50mM HEPES(Invitrogen；目录号15630-080)、20％DMSO中进一步稀释至0.2mM的中间浓度并保存于4℃下。所有生长因子和抑制剂在深孔96孔聚丙烯板中制备，在测定法开始时在DMEM:F12基础培养基中稀释至5x中间母液并保存于4℃下。

进行二次筛选测定法，重复检验三次并在四天测试时间段内隔天供料。如下开始测定：从每个孔抽吸掉培养基，然后在PBS中洗涤三次以除去残余的生长因子和血清。每孔重新添加含有DMEM:F12基础培养基(Invitrogen；目录号11330-032)的80μl的测试体积，所述基础培养基补充有0.625％FCS(HyClone；目录号SH30070.03)、25ng/ml Wnt3a(R&DSystems)和3.125μM化合物加20μl生长因子或小分子的5x母液，以产生0.5％FCS、20ng/ml Wnt3a和2.5μM的最终浓度。将所有其余的生长因子以50ng/ml的最终测定浓度测试(EGF、FGF4、PDGF-A、PDGF-A/B、VEGF)。蝇蕈醇的最终测定浓度为20μM。阳性对照孔(100μl/孔)装有补充有0.5％FCS、20ng/ml Wnt3a和100ng/m激活素A的相同基础培养基。阴性对照孔(100μl/孔)装有补充有0.5％FCS和20ng/ml Wnt3a但省去激活素A的相同基础培养基。

在第3天，抽吸孔并每孔供给80μl DMEM:F12基础培养基饲养，所述基础培养基补充有2.5％FCS(HyClone)和3.125μM化合物加20μl生长因子或小分子的5x母液，以产生2％FCS和2.5μM化合物(省去Wnt3a)的的最终浓度以及在第一天所标明的所有其余生长因子或小分子的最终浓度。阳性对照孔(100μl/孔)装有补充有2％FCS和100ng/ml激活素A但省去Wnt3a的相同基础培养基。阴性对照孔(100μl/孔)装有补充有2％FCS但省去激活素A和Wnt3a两者的相同基础培养基。

高内涵分析：在四天的培养结束时，用PBS洗涤测试平板两次，用4％多聚甲醛(Alexis Biochemical；目录号ALX-350-011)在室温下固定20分钟，然后用PBS洗涤三次并用0.5％Triton X-100(Sigma；目录号T8760-2)在室温下透化处理20分钟。将细胞再用PBS洗涤三次，然后用4％鸡血清(Invitrogen；目录号16110082)在PBS中于室温下封闭30分钟。将一抗(山羊抗人SOX17；R&D Systems；目录号AF1924)在4％鸡血清中以1∶100稀释，在室温下加至每个孔保持一小时。将Alexa Fluor 488缀合的二抗(鸡抗山羊IgG；Molecular Probes；目录号AZ1467)在PBS中以1∶200稀释，并在用PBS洗涤三次后加至每个样品孔。为了对细胞核进行复染，在室温下加入4μg/ml Hoechst 33342(Invitrogen；目录号H3570)保持十分钟。将板用PBS洗涤一次，并保留在100μl/孔PBS中以进行成像。

用IN Cell Analyzer 1000细胞分析仪(GE Healthcare)进行成像，对于用Hoechst 33342和Alexa Fluor 488染色的细胞采用51008bs二向分色镜。根据阳性对照孔并根据单独用二抗染色的无处理阴性对照孔来优化曝光时间。每孔获取15个视野的图像，以补偿生物鉴定和后续染色程序中的任何细胞损失。用IN Cell Developer Toolbox 1.7(GE Healthcare)软件从每个孔获得总细胞数目和总SOX17强度的测量值。基于灰阶水平(基线范围100-300)和核大小确定细胞核的分裂情况。计算每个重复数据集的平均值和标准偏差。总SOX17蛋白表达记录为总强度或累积强度，该强度定义为细胞总荧光乘以细胞面积。基于灰阶范围在200至3500之间的接受标准来去除背景。通过将每个孔的总强度除以阳性对照的平均总强度，将总强度数据进行归一化。对于每个重复组，对归一化的数据计算平均值和标准偏差。

表5显示先前鉴定为命中物的化合物(表2)，其在定形内胚层生物测定法中以与生长因子和蝇蕈醇但没有激活素A的多种组合进行了检测。一些化合物与所检测的所有生长因子组合一起对SOX17表达具有极微或很弱的作用。然而，一些化合物能够与一些但非所有生长因子组合一起诱导显著的SOX17表达。特别是一种化合物(化合物34)在该测定法中与所检测的所有生长因子具有显著协同反应并介导了细胞数和SOX17表达两者的增加：化合物39与1)EGF+FGF4＝阳性对照反应的77％；或2)EGF+FGF4+PDGF-AB＝阳性对照反应的68％；或3)EGF+FGF4+PDGF-A+VEGF＝阳性对照反应的31％。

实例7

在没有激活素A的情况下化合物34与其他因子结合对人胚胎干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的作用

在该实例中，尝试分析与最佳环苯胺-吡啶并三嗪化合物(化合物34)结合所需的生长因子的最小数量，以在没有激活素A的情况下产生强的SOX17反应。同样在该实例中，添加一种新的生长因子GDF-8来进行评价。GDF-8也称为肌生成抑素，是TGF-β家族的成员，并已显示可利用II型激活素及TGF-βI型受体(ALK4/5)来诱导SMAD 2/3磷酸化作用。

细胞测定接种：将H1人胚胎干细胞簇在低生长因子MATRIGELTM(Invitrogen；目录号356231)包被的组织培养塑料上培养。细胞通过以下方式来传代：利用胶原酶(Invitrogen；目录号17104-019)处理并小心刮擦、洗涤以除去残余酶，并以1∶1(表面面积)的比例使用100μl/孔的体积在低生长因子MATRIGELTM包被的96孔黑色板(Packard ViewPlates；PerkinElmer；目录号6005182)上均匀分散接种。让细胞成簇贴附，然后在1至3天时间内恢复对数期生长，每天用补充有8ng/ml的bFGF(R&DSystems；目录号233-FB)的MEF调理培养基饲养。在整个测定法期间，将板在加湿箱中维持在37℃、5％CO2下。

化合物和生长因子的准备：从R&D Systems购得的生长因子母液是EGF(目录号236-EG)、FGF4(目录号235-F4)、PDGF-A(目录号221-AA)、PDGF-D(目录号1159-SB)、PDGF-A/B(目录号222-AB)、VEGF(目录号293-VE)和GDF-8(目录号788-G8)。蝇蕈醇从Tocris购得(目录号0289)。将所有生长因子溶于具有0.1％BSA(Sigma；目录号A7888)的PBS中并冷冻保存于-80℃下。将蝇蕈醇溶于100％DMSO(Sigma；目录号D2650)，并冷冻保存于-80℃下。将环苯胺-吡啶并三嗪化合物制备为96孔板形式的5mM母液供用，其溶于100％DMSO并保存于-80℃下。将化合物34在50mM HEPES(Invitrogen；目录号15630-080)、20％DMSO中进一步稀释至0.2mM的中间浓度并保存于4℃下。所有生长因子和抑制剂在深孔96孔聚丙烯板中制备，在测定法开始时在DMEM:F12基础培养基中稀释至5x中间母液并保存于4℃下。

进行二次筛选测定法，重复检验三次并在四天测试时间段内隔天供料。如下开始测定：从每个孔抽吸掉培养基，然后在PBS中洗涤三次以除去残余的生长因子和血清。每孔重新添加含有DMEM:F12基础培养基(Invitrogen；目录号11330-032)的80ml的测试体积，所述基础培养基补充有0.625％FCS(HyClone；目录号SH30070.03)、25ng/ml Wnt3a(R&DSystems)和3.125mM化合物27加20ml生长因子或小分子的5x母液，以得到0.5％FCS、20ng/ml Wnt3a和2.5μM化合物34的最终浓度。除了GDF-8以25ng/ml测试外，所有其余的生长因子以50ng/ml的最终测定浓度进行测试(EGF、FGF4、PDGF-A、PDGF-A/B、VEGF)。蝇蕈醇的最终测定浓度为20μM。阳性对照孔(100ml/孔)装有补充有0.5％FCS、20ng/ml Wnt3a和100ng/m激活素A的相同基础培养基。阴性对照孔(100ml/孔)装有补充有0.5％FCS和20ng/ml Wnt3a但省去激活素A的相同基础培养基。

在第3天，抽吸孔并每孔供给80μl DMEM:F12基础培养基饲养，所述基础培养基补充有2.5％FCS(HyClone)和3.125μM化合物34加20μl生长因子或小分子的5x母液，以产生2％FCS和2.5μM化合物34(省去Wnt3a)以及在第一天所标明的所有其余生长因子或小分子的最终浓度。阳性对照孔(100μl/孔)装有补充有2％FCS和100ng/ml激活素A但省去Wnt3a的相同基础培养基。阴性对照孔(100μl/孔)装有补充有2％FCS但省去激活素A和Wnt3a两者的相同基础培养基。

高内涵分析：在四天的培养结束时，用PBS洗涤测试平板两次，用4％多聚甲醛(Alexis Biochemical；目录号ALX-350-011)在室温下固定20分钟，然后用PBS洗涤三次并用0.5％Triton X-100(Sigma；目录号T8760-2)在室温下透化处理20分钟。将细胞再用PBS洗涤三次，然后用4％鸡血清(Invitrogen；目录号16110082)在PBS中于室温下封闭30分钟。将一抗(山羊抗人SOX17；R&D Systems；目录号AF1924)在4％鸡血清中以1∶100稀释，在室温下加至每个孔保持一小时。将Alexa Fluor 488缀合的二抗(鸡抗山羊IgG；Molecular Probes；目录号AZ1467)在PBS中以1∶200稀释，并在用PBS洗涤三次后加至每个样品孔。为了对细胞核进行复染，在室温下加入4μg/ml Hoechst 33342(Invitrogen；目录号H3570)保持十分钟。将板用PBS洗涤一次，并保留在100μl/孔PBS中以进行成像。

用IN Cell Analyzer 1000细胞分析仪(GE Healthcare)进行成像，对于用Hoechst 33342和Alexa Fluor 488染色的细胞采用51008bs二向分色镜。根据阳性对照孔并根据单独用二抗染色的无处理阴性对照孔来优化曝光时间。每孔获取15个视野的图像，以补偿生物鉴定和后续染色程序中的任何细胞损失。用IN Cell Developer Toolbox 1.7(GE Healthcare)软件从每个孔获得总细胞数目和总SOX17强度的测量值。基于灰阶水平(基线范围100-300)和核大小确定细胞核的分裂情况。计算每个重复数据集的平均值和标准偏差。总SOX17蛋白表达记录为总强度或累积强度，该强度定义为细胞总荧光乘以细胞面积。基于灰阶范围在200至3500之间的接受标准来去除背景。通过将每个孔的总强度除以阳性对照的平均总强度，将总强度数据进行归一化。对于每个重复组，对归一化的数据计算平均值和标准偏差。

表6示出了该测定法的结果。在GDF-8以与化合物34的任意组合存在时，观察到SOX17表达的显著增加。此外，GDF-8和Wnt3a与化合物34一起足以产生类似于使用100ng/ml激活素A/Wnt3a处理时所见范围的范围内的SOX17表达(对照的88％)。看起来，生长因子GDF-8可在人胚胎干细胞的定形内胚层分化期间用作激活素A的替代物。

实例8

对能够使多能干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的化合物的另外筛选

基于目前为止辨别的命中物的化合物结构，进行类似物搜索以发现另外的相关化合物以在定形内胚层生物测定中检测。亚结构搜索产生了用于筛选的化合物。设计了用于该测定法的筛选参数，使用已在先前测定法中产生最佳结果的因子的组合，特别是将EGF、FGF、PDGF-A、VEGF、PDGF-D、蝇蕈醇和GDF-8与小分子化合物组合。

细胞测定接种：简而言之，将H1人胚胎干细胞簇在低生长因子MATRIGELTM(Invitrogen；目录号356231)包被的组织培养塑料上培养。细胞通过以下方式来传代：利用胶原酶(Invitrogen；目录号17104-019)处理并小心刮擦、洗涤以除去残余酶，并以1∶1(表面面积)的比例使用100μl/孔的体积在低生长因子MATRIGELTM包被的96孔黑色板(PackardViewPlates；PerkinElmer；目录号6005182)上均匀分散接种。让细胞成簇贴附，然后在1至3天时间内恢复对数期生长，每天用补充有8ng/ml的bFGF(R&D Systems；目录号233-FB)的MEF调理培养基饲养。在整个测定法期间，将板在加湿箱中维持在37℃、5％CO2下。

化合物和生长因子的准备：从R&D Systems购得的生长因子母液是EGF(目录号236-EG)、FGF4(目录号235-F4)、PDGF-A(目录号221-AA)、PDGF-D(目录号1159-SB)、PDGF-A/B(目录号222-AB)、VEGF(目录号293-VE)和GDF-8(目录号788-G8)。蝇蕈醇从Tocris购得(目录号0289)。使用制备为96孔板形式的5mM母液供用的化合物的库进行筛选，其溶解于100％DMSO(Sigma；目录号D2650)中并保存于-80℃下。将化合物在50mM HEPES(Invitrogen；目录号15630-080)、20％DMSO中进一步稀释至0.2mM的中间浓度并保存于4℃下。测试条件在单个孔中进行，在四天测试期间每隔一天供料。如下开始初级筛选测定法：从每个孔抽吸掉培养基，然后在PBS(Invitrogen；目录号14190)中洗涤三次以除去残余的生长因子和血清。在测定法的第一天，重新添加200ml/孔的测试体积，其含有补充有0.5％FCS(HyClone；目录号SH30070.03)和20ng/l Wnt3a(R&D Systems；目录号1324-WN)加2.5mM化合物的DMEM:F12基础培养基(Invitrogen；目录号11330-032)。除了GDF-8以25ng/ml测试外，所有其余的生长因子以50ng/ml的最终测定浓度进行测试(EGF、FGF4、PDGF-A、PDGF-A/B、VEGF)。蝇蕈醇的最终测定浓度为20μM。阳性对照样品含有补充有0.5％FCS加20ng/ml Wnt3a和100ng/ml重组人激活素A(PeproTech；目录号120-14)的相同基础培养基。阴性对照样品含有补充有0.5％FCS和20ng/ml Wnt3a的DMEM:F12基础培养基。在测试的第三天，重新添加200μl每孔的测试体积，其含有补充有2％FCS加2.5μM化合物但没有Wnt3a的DMEM:F12基础培养基。除了GDF-8以25ng/ml测试外，所有其余的生长因子以50ng/ml的最终测定浓度进行测试(EGF、FGF4、PDGF-A、PDGF-A/B、VEGF)。蝇蕈醇的最终测定浓度为20μM。阳性对照样品含有补充有2％FCS和100ng/ml重组人激活素A(PeproTech；目录号120-14)的相同基础培养基。阴性对照样品含有补充有2％FCS的DMEM:F12基础培养基。阳性对照样品含有补充有FCS的相同基础培养基，在整个四天的测定法期间用100ng/ml重组人激活素A(PeproTech；目录号120-14)代替苯胺-吡啶并三嗪化合物，以及在在第1天和第2天添加Wnt3a(20ng/ml)。阴性对照样品含有补充有FCS的DMEM:F12基础培养基，在第1天和第2天添加Wnt3a，但省去用激活素A处理。

高内涵分析：在培养的四天结束时，将测试平板用PBS(Invitrogen；目录号14190)洗涤两次，用4％多聚甲醛(Alexis Biochemical；目录号ALX-350-011)在室温下固定20分钟，然后用PBS洗涤三次并用0.5％Triton X-100(Sigma；目录号T8760-2)在室温下透化处理20分钟。将细胞再用PBS洗涤三次，然后用4％鸡血清(Invitrogen；目录号16110082)在PBS中于室温下封闭30分钟。将一抗(山羊抗人SOX17；R&D Systems；目录号AF1924)在4％鸡血清中以1∶100稀释，在室温下加至每个孔保持一小时。将Alexa Fluor 488缀合的二抗(鸡抗山羊IgG；Molecular Probes；目录号AZ1467)在PBS中以1∶200稀释，并在用PBS洗涤三次后加至每个样品孔。为了对细胞核进行复染，在室温下加入4μg/mlHoechst 33342(Invitrogen；目录号H3570)保持十分钟。将板用PBS洗涤一次，并保留在100μl/孔PBS中以进行成像。

用IN Cell Analyzer 1000细胞分析仪(GE Healthcare)进行成像，对于用Hoechst 33342和Alexa Fluor 488染色的细胞采用51008bs二向分色镜。根据阳性对照孔并根据单独用二抗染色的无处理阴性对照孔来优化曝光时间。每孔获取15个视野的图像，以补偿生物鉴定和后续染色程序中的任何细胞损失。用IN Cell Developer Toolbox 1.7(GE Healthcare)软件从每个孔获得总细胞数目和总SOX17强度的测量值。基于灰阶水平(基线范围100-300)和核大小确定细胞核的分裂情况。计算每个重复数据集的平均值和标准偏差。总Sox17蛋白表达记述为总强度或累积强度，该强度定义为细胞总荧光乘以细胞面积。基于灰阶范围在200至3500之间的接受标准来去除背景。通过将每个孔的总强度除以阳性对照的平均总强度，将总强度数据进行归一化。对于每个重复组，对归一化的数据计算平均值和标准偏差。

在表7中，测试了GDF-8和一组生长因子/激动剂(EGF、FGF、PDGF-A、VEGF、PDGF-D、蝇蕈醇)与新的一组苯胺-吡啶并三嗪化合物的组合。将该单个实验中两个测试板的结果关于SOX17响应(记录为使用激活素A和Wnt3a的阳性对照处理的百分比)来排序。鉴别了显示出与生长因子/激动剂组合有显著协同活性的另外的化合物。在没有激活素A的情况下这些化合物在人胚胎干细胞分化期间保持测试细胞数以及导致SOX17表达两方面均有效。这些大于阳性对照25％活性的命中物列表在表8中示出。

值得注意的是，最初的初步筛选得到的四个命中物(表2)在类似物库中重复。这些化合物中的两种作为命中物与类似物筛选重复(化合物34和化合物35；表8所框示)；一种是类似物筛选中的弱命中物，而一种化合物不重复。

实例9

在存在低浓度激活素A的情况下本发明化合物对人胚胎干细胞向表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化的作用

确定已在上面定形内胚层生物测定法中鉴定为命中物的化合物是否还可以显示出与非常低剂量的激活素A有协同活性是重要的。使用表3B所标示的环苯胺-吡啶并三嗪化合物的短命中物列表来进行最初的评估。

细胞测定接种：将H1人胚胎干细胞簇在低生长因子MATRIGELTM(Invitrogen；目录号356231)包被的组织培养塑料上培养。细胞通过以下方式来传代：利用胶原酶(Invitrogen；目录号17104-019)处理并小心刮擦、洗涤以除去残余酶，并以1∶1(表面面积)的比例使用100μl/孔的体积在低生长因子MATRIGELTM包被的96孔黑色板(Packard ViewPlates；PerkinElmer；目录号6005182)上均匀分散接种。让细胞成簇贴附，然后在1至3天时间内恢复对数期生长，每天用补充有8ng/ml的bFGF(R&DSystems；目录号233-FB)的MEF调理培养基饲养。在整个测定法期间，将板在加湿箱中维持在37℃、5％CO2下。

化合物和生长因子的准备：从R&D Systems购得的生长因子母液是EGF(目录号236-EG)、FGF4(目录号235-F4)、PDGF-A(目录号221-AA)、PDGF-D(目录号1159-SB)、PDGF-A/B(目录号222-AB)、VEGF(目录号293-VE)和GDF-8(目录号788-G8)。激活素A从PeproTech(目录号)购得。蝇蕈醇从Tocris购得(目录号0289)。将所有生长因子溶于具有0.1％BSA(Sigma；目录号A7888)的PBS中并冷冻保存于-80℃下。将蝇蕈醇溶于100％DMSO(Sigma；目录号D2650)，并冷冻保存于-80℃下。将化合物制备为96孔板形式的5mM母液供用，其溶于100％DMSO中并保存于-80℃下。将化合物在50mM HEPES(Invitrogen；目录号15630-080)、20％DMSO中进一步稀释至0.2mM的中间浓度并保存于4℃下。所有生长因子和抑制剂在深孔96孔聚丙烯板中制备，在测定法开始时在DMEM:F12基础培养基中稀释至5x中间母液并保存于4℃下。

进行二次筛选测定法，重复检验三次并在四天测试时间段内隔天供料。如下开始测定：从每个孔抽吸掉培养基，然后在PBS中洗涤三次以除去残余的生长因子和血清。每孔重新添加含有DMEM:F12基础培养基(Invitrogen；目录号11330-032)的80ml的测试体积，所述基础培养基补充有0.625％FCS(HyClone；目录号SH30070.03)、25ng/ml Wnt3a(R&DSystems)、12.5ng/ml激活素A和3.125μM化合物加20μl生长因子或小分子的5x母液，以产生0.5％FCS、20ng/ml Wnt3a、10ng/ml激活素A和2.5μM化合物的最终浓度。除了GDF-8以25ng/ml使用以外，所有其余的生长因子以50ng/ml的最终测定浓度测试(EGF、FGF4、PDGF-A、PDGF-A/B、VEGF)。蝇蕈醇的最终测定浓度为20μM。阳性对照孔(100μl/孔)装有补充有0.5％FCS、20ng/ml Wnt3a和10ng/m(低剂量)或100ng/ml(高剂量)激活素A的相同基础培养基。阴性对照孔(100μl/孔)装有补充有0.5％FCS和20ng/ml Wnt3a但省去激活素A的相同基础培养基。

在第3天，抽吸孔并每孔供给80μl DMEM:F12基础培养基饲养，所述基础培养基补充有2.5％FCS(HyClone)、12.5ng/ml激活素A和3.125μM化合物加20μl生长因子或小分子的5x母液，以产生2％FCS、10ng/ml激活素A和2.5μM化合物(省去Wnt3a)的最终浓度以及在第一天所标明的所有其余生长因子或小分子的最终浓度。阳性对照孔(100μl/孔)装有补充有2％FCS和10ng/ml或100ng/ml激活素A但省去Wnt3a的相同基础培养基。阴性对照孔(100μl/孔)装有补充有2％FCS但省去激活素A和Wnt3a两者的相同基础培养基。

高内涵分析：在四天的培养结束时，用PBS洗涤测试平板两次，用4％多聚甲醛(Alexis Biochemical；目录号ALX-350-011)在室温下固定20分钟，然后用PBS洗涤三次并用0.5％Triton X-100(Sigma；目录号T8760-2)在室温下透化处理20分钟。将细胞再用PBS洗涤三次，然后用4％鸡血清(Invitrogen；目录号16110082)在PBS中于室温下封闭30分钟。将一抗(山羊抗人SOX17；R&D Systems；目录号AF1924)在4％鸡血清中以1∶100稀释，在室温下加至每个孔保持一小时。将Alexa Fluor 488缀合的二抗(鸡抗山羊IgG；Molecular Probes；目录号AZ1467)在PBS中以1∶200稀释，并在用PBS洗涤三次后加至每个样品孔。为了对细胞核进行复染，在室温下加入4μg/ml Hoechst 33342(Invitrogen；目录号H3570)保持十分钟。将板用PBS洗涤一次，并保留在100μl/孔PBS中以进行成像。

用IN Cell Analyzer 1000细胞分析仪(GE Healthcare)进行成像，对于用Hoechst 33342和Alexa Fluor 488染色的细胞采用51008bs二向分色镜。根据阳性对照孔并根据单独用二抗染色的无处理阴性对照孔来优化曝光时间。每孔获取15个视野的图像，以补偿生物鉴定和后续染色程序中的任何细胞损失。用IN Cell Developer Toolbox 1.7(GE Healthcare)软件从每个孔获得总细胞数目和总SOX17强度的测量值。基于灰阶水平(基线范围100-300)和核大小确定细胞核的分裂情况。计算每个重复数据集的平均值和标准偏差。总SOX17蛋白表达记录为总强度或累积强度，该强度定义为细胞总荧光乘以细胞面积。基于灰阶范围在200至3500之间的接受标准来去除背景。通过将每个孔的总强度除以阳性对照的平均总强度，将总强度数据进行归一化。对于每个重复组，对归一化的数据计算平均值和标准偏差。

表9示出了使用多种化合物以及生长因子与低剂量激活素A的不同组合的测定法的结果。一些化合物显示出与多种生长因子的强的协同响应。在其他情况下，协同效应更为适度，但相对于低剂量激活素A对照而言是显著的。其他化合物相对于低剂量激活素A对照不具有活性。

实例10

在没有激活素A的情况下本发明化合物对单个人胚胎干细胞向表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化的作用

环苯胺-吡啶并三嗪化合物还利用通过酶处理分散为单细胞并为测定法而涂布为单层的细胞以筛选形式进行测试。还对该测定法进行改变，以除去甚至是在低剂量下都可提供生长因子的血清。为了该目的，改变基础培养基并用无脂肪酸的BSA替换血清。该测定法从四天缩短为三天，以用更窄的时段来测量结果。最后，该测定法包括先前已显示出在没有激活素A的情况下对定形内胚层分化有显著但次最佳作用的两种生长因子EGF和FGF4。

筛选测定法

细胞测定接种：简而言之，将H1人胚胎干细胞簇在低生长因子MATRIGELTM(Invitrogen；目录号356231)包被的组织培养塑料上培养。将培养物每10cm2表面积用10ml等体积Accutase(Sigma；目录号A6964)在37℃下处理5分钟，然后轻轻地进行再悬浮，通过离心得到沉淀物，并再悬浮于MEF调理培养基中用以计数。为了进行测定法接种，将细胞以50,000细胞/cm2使用100μl/孔的体积涂布于低生长因子MATRIGELTM包被的96孔黑色板(Packard ViewPlates；目录号6005182)上。让细胞贴附，并用3至5天时间恢复对数期生长，每天供以补充有8ng/ml的bFGF(R&DSystems；目录号233-FB)的MEF调理培养基。在整个测定法期间，将板在加湿箱中维持在37℃、5％CO2下。

化合物和测定法的准备：将EGF和FGF4的母液在96孔聚丙烯板(Corning，Inc.；目录号3960)中制备。化合物22作为5mM母液待用，其溶解于100％DMSO(Sigma；目录号D2650)并保存于-80℃下。如下开始测定：从每个孔抽吸掉培养基，然后在PBS中洗涤三次以除去残余的生长因子和血清。每孔重新添加含有RPMI 1640基础培养基(Invitrogen；目录号22400-089)的80ml测试体积，所述基础培养基补充有2.5％无脂肪酸BSA(MP Biomedicals LLC；目录号152401)、10ng/ml bFGF(PeproTechInc；目录号100-18B)、25ng/ml Wnt3a(R&D Systems；目录号1324-WN)和3.125mM化合物22加20ml生长因子的5x母液，以产生测试中2％无脂肪酸BA、8ng/ml bFGF(PeproTech Inc；目录号100-18B)、20ng/mlWnt3a和2.5μM化合物22的最终浓度。阳性对照孔装有补充有2％无脂肪酸BSA、8ng/ml bFGF、20ng/ml Wnt3a和100ng/ml重组人激活素A(PeproTech；目录号120-14)的相同基础培养基。阴性对照孔装有补充有2％无脂肪酸BSA、8ng/ml bFGF、20ng/ml Wnt3a但省去用激活素A处理的相同基础培养基。

在该测定法的第二天，再次抽吸孔并每孔重新供以含有RPMI 1640基础培养基的80μl体积，所述基础培养基补充有2.5％无脂肪酸BSA、10ng/mlbFGF和3.125μM化合物22加20μl生长因子的5x母液，以在测试中产生2％无脂肪酸BSA、8ng/ml bFGF和2.5μM化合物22的最终浓度。阳性对照孔装有补充有2％无脂肪酸BSA、8ng/ml bFGF和100ng/ml重组人激活素A的相同基础培养基。阴性对照样品装有补充有2％无脂肪酸BSA、8ng/mlbFGF但省去用激活素A处理的相同基础培养基。

高内涵分析：在四天的培养结束时，用PBS洗涤测试平板两次，用4％多聚甲醛(Alexis Biochemical；目录号ALX-350-011)在室温下固定20分钟，然后用PBS洗涤三次并用0.5％Triton X-100(Sigma；目录号T8760-2)在室温下透化处理20分钟。将细胞再用PBS洗涤三次，然后用4％鸡血清(Invitrogen；目录号16110082)在PBS中于室温下封闭30分钟。将一抗(山羊抗人SOX17；R&D Systems；目录号AF1924)在4％鸡血清中以1∶100稀释，在室温下加至每个孔保持一小时。将Alexa Fluor 488缀合的二抗(鸡抗山羊IgG；Molecular Probes；目录号AZ1467)在PBS中以1∶200稀释，并在用PBS洗涤三次后加至每个样品孔。为了对细胞核进行复染，在室温下加入4μg/ml Hoechst 33342(Invitrogen；目录号H3570)保持十分钟。将板用PBS洗涤一次，并保留在100μl/孔PBS中以进行成像。

用IN Cell Analyzer 1000细胞分析仪(GE Healthcare)进行成像，对于用Hoechst 33342和Alexa Fluor 488染色的细胞采用51008bs二向分色镜。根据阳性对照孔并根据单独用二抗染色的无处理阴性对照孔来优化曝光时间。每孔获取15个视野的图像，以补偿生物鉴定和后续染色程序中的任何细胞损失。用IN Cell Developer Toolbox 1.7(GE Healthcare)软件从每个孔获得总细胞数目和总SOX17强度的测量值。基于灰阶水平(基线范围100-300)和核大小确定细胞核的分裂情况。计算每个重复数据集的平均值和标准偏差。总SOX17蛋白表达记录为总强度或累积强度，该强度定义为细胞总荧光乘以细胞面积。基于灰阶范围在200至3500之间的接受标准来去除背景。通过将每个孔的总强度除以阳性对照的平均总强度，将总强度数据进行归一化。对于每个重复组，对归一化的数据计算平均值和标准偏差。

表10示出了采用化合物34的该测定法的结果。具有仅EGF和/或FGF4而没有化合物34的对照样品具有低的SOX17表达。添加化合物34显著增强了SOX17的表达。

实例11

激活素A和GDF-8使人胚胎干细胞向表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化的能力的比较

先前的实例显示，GDF-8能够替代激活素A来使人胚胎干细胞向表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化。了解GDF-8和激活素A关于其使人胚胎干细胞向表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化的能力的相对效力是重要的。使用当量浓度的各生长因子来进行剂量响应测定法，以比较胚胎干细胞分化期间的结果。

用于测定法的细胞准备：将人胚胎干细胞(H1人胚胎干细胞系)的母培养物以未分化、多能状态维持在MEF调理培养基中的低生长因子MATRIGEL包被的平皿上，平均每四天进行传代。传代通过这样进行：使细胞培养物在37℃下暴露于1mg/ml分散酶(Invitrogen，目录号：17105-041)的溶液5至7分钟，然后用MEF调理培养基冲洗该单层并小心刮擦以回收细胞簇。将细胞簇低速离心以收集细胞沉淀并除去残余的分散酶。将细胞簇以1∶3或1∶4的比例分传以进行例行维持培养，或者以1∶1比例分传以立即进行测试。将所有的人胚胎干细胞系以小于50次传代的传代数目进行维持，并例行评估核型表型是否正常和支原体污染是否存在。

将用于该测定法的细胞簇均匀地再悬浮于补充有8ng/ml bFGF的MEF调理培养基中，并以100ml/孔的体积接种至低生长因子MATRIGELTM包被的96孔Packard VIEWPLATES(PerkinElmer；目录号6005182)上。补充有8ng/mL bFGF的MEF调理培养基用于初始接种和扩增。日常饲养是通过从每个孔抽吸掉废培养基并用等体积的新鲜培养基替换来进行。在整个测定法期间，将板在加湿箱中维持在37℃、5％CO2下。

测定法：如下开始该测定法：从每个孔抽吸掉培养基，并重新添加测试培养基的等分试样(100μl)。测试条件在总共三天的测定期间重复进行四次，在第1天和第2天通过从各孔抽吸培养基并用新鲜测试培养基替换该培养基来饲养。使用两个12道聚丙烯移液槽(Argos technologies，Inc，目录号：B3135)来制备含有不同浓度的激活素A(PeproTech；目录号120-14)或GDF-8(R&D Systems，目录号788-G8)的测试培养基。各移液槽编号2至12的槽道包含1ml由RPMI-1640培养基(Invitrogen；目录号：22400)组成的测试培养基，所述RPMI-1640培养基补充有2％牛血清白蛋白第V组分、无脂肪酸(FAF BSA)(MP Biomedicals，Inc；目录号152401)和8ng/mlbFGF(PeproTech Inc.；目录号：100-18B)，并在第1天添加但在第2天和第3天省去20ng/ml Wnt3a(R&D Systems；目录号1324-WN/CF)。各移液槽的1号槽道包含1600ng/ml激活素A或1600ng/ml GDF-8，其稀释于相同测试培养基中。将一毫升培养基从1号槽道转移到2号槽道，并完全混合。将新移液管头用于将一毫升培养基从2号槽道转移到3号槽道，然后彻底混合。相同的步骤在各个单独移液槽依次重复直到11号槽道。各移液槽的12号槽道包含没有激活素A或GDF-8的培养基。通过这样做，产生用于添加到各测定孔的一系列两倍测试稀释液，所述稀释液含有浓度范围为1.6ng/ml至1600ng/ml的激活素A或GDF-8。

高内涵分析：在三天的培养结束时，将测试平板用PBS(Invitrogen；目录号14190)洗涤一次，用4％多聚甲醛(Alexis Biochemical；目录号ALX-350-011)在室温下固定20分钟，然后用PBS洗涤三次并用0.5％Triton X-100(Sigma；目录号T8760-2)在室温下透化处理20分钟。将细胞再用PBS洗涤三次，然后用4％鸡血清(Invitrogen；目录号16110082)在PBS中于室温下封闭30分钟。将一抗(山羊抗人SOX17；R&D Systems；目录号AF1924)在4％鸡血清中以1∶100稀释，在室温下加至每个孔保持两小时。在用PBS洗涤三次后，将以1∶200稀释于PBS中的Alexa Fluor 488缀合的二抗(鸡抗山羊IgG；Invitrogen；目录号A21467)加至每个孔。为了对细胞核进行复染，在室温下加入5μg/ml Hoechst 33342(Invitrogen；目录号H3570)保持十分钟。将板用PBS洗涤一次，并保留在100μl/孔PBS中以进行成像。

用IN Cell Analyzer 1000细胞分析仪(GE Healthcare)进行成像，对于用Hoechst 33342和Alexa Fluor 488染色的细胞采用51008bs二向分色镜。从每孔的25个视野获得图像。用IN Cell Developer Toolbox 1.7(GE Healthcare)软件从每个孔获得总细胞数目和总SOX17强度的测量值。基于灰阶水平(基线范围100-300)和核大小确定细胞核的分裂情况。计算每一式四份的数据集的平均值和标准偏差。总SOX17蛋白表达记录为总强度或累积强度，该强度定义为细胞总荧光乘以细胞面积。基于灰阶范围在200至4500之间的接受标准来去除背景。总SOX17强度数据用GraphPad Prism 4.02(GraphPadSoftware，Inc.，Lo Jolla，CA)来计算。将数据归一化以将各数据集中的最小值和最大值分别定义为0％和100％。表11示出了激活素A和GDF-8数据集中每一者的归一化值。在图2中示出了用表11所示归一化值生成的两条S形剂量响应曲线。用GraphPad Prism来计算指示曲线拟合度的R2值，并确定为对激活素A为0.9944而对GDF-8为0.9964。各生长因子的EC50值用GraphPad Prism计算，并确定为对激活素A为13.9ng/ml而对GDF-8为184.8ng/ml。这些数据表明，GDF-8在关于诱导人胚胎干细胞向表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化方面比激活素A效力低。尽管如此，GDF-8可以代替激活素A，并且在特定浓度下可诱导等量的定形内胚层细胞群，如SOX17表达所指示的。

实例12

根据本发明方法形成的表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞能够进一步分化为表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞

使用GDF-8结合化合物34或化合物56使人胚胎干细胞的平行群体分化为表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。此后，将分步分化方案应用于处理细胞，以促进向胰腺内胚层和内分泌谱系的分化。在整个分步分化过程中，维持由用激活素A和Wnt3a处理过的细胞组成的平行对照以用于比较目的。在分化的每个阶段取得样品，以确定代表分化的多个阶段的蛋白质和mRNA生物标记的出现。

用于测定法的细胞准备：将人胚胎干细胞(H1人胚胎干细胞系)的母培养物以未分化、多能状态维持在MEF调理培养基中的低生长因子MATRIGELTM包被的平皿上，平均每四天进行传代。传代通过这样来完成：将细胞培养物在37℃下暴露于1mg/ml分散酶(Invitrogen；目录号17105-041)溶液5至7分钟，然后用MEF调理培养基冲洗该单层并小心刮擦以回收细胞簇。将细胞簇低速离心以收集细胞沉淀并除去残余分散酶。将细胞簇以1∶3或1∶4的比例分传以进行例行维持培养，或者以1∶1比例分传以立即进行测试。将所有的人ES细胞系以小于50的传代数进行维持，并例行评估核型是否正常和支原体是否存在。

将细胞簇均匀地再悬浮于补充有8ng/ml bFGF的MEF调理培养基中，并以0.5ml/孔的体积接种到低生长因子MATRIGELTM包被的24孔黑壁培养板(Arctic White；目录号AWLS-303012)上。日常饲养是通过从每个孔抽吸掉废培养基并用等体积的新鲜培养基替换来进行。在整个测定法期间，将板维持在37℃、5％CO2下。

测定法：如下开始该测定法：从每个孔抽吸掉培养基，并重新添加测试培养基的等分试样(0.5ml)。在三天的周期内进行分化第一步的测试条件，每天通过从各孔抽吸培养基并用新鲜的测试培养基替换该培养基来饲养。在测定法的第一天，将100ng/ml激活素A(PeproTech；目录号120-14)或200ng/ml GDF-8(R&D Systems，目录号788-G8)添加至各测定孔，其中各生长因子被稀释进具有1％牛血清白蛋白第V组分、无脂肪酸(FAF BSA)(MP Biomedicals，Inc；目录号152401)、1％Probumin(Millipore；目录号81-068-3)和20ng/ml Wnt3a(R&D Systems；目录号1324-WN/CF)的RPMI-1640培养基(Invitrogen；目录号22400)中。在该测定法的第二天，将100ng/ml激活素A或200ng/ml GDF-8稀释进补充有2％FAF BSA但没有Wnt3a的RPMI-1640培养基中。在一些使用GDF-8的测试样品中，Wnt3a用2.5μM浓度的化合物34或化合物56替换，并且在定形内胚层分化的全部三天期间每天添加化合物34或化合物56。在分化的第一步结束时，从一些孔收获细胞进行流式细胞检测分析，以评价CXCR4(定形内胚层形成的标志物)的水平。从另外的孔收获样品用于RT-PCR分析，以测量其他分化标志物。

在分化的第一步结束时，各处理组的重复平行孔组经受进一步分步分化。重要的是注意在第一个分化步骤之后，所有经历连续培养和分化的孔接受相同的处理。这种连续分化的方案在下面描述。

用二天进行该分化方案的步骤2。通过从各孔抽吸培养基并用新鲜等分量(0.5ml)的DMEM:F12培养基(Invitrogen；目录号11330-032)替换每天对细胞进行饲养，所述DMEM:F12培养基含有2％牛血清白蛋白第V组分、无脂肪酸(FAF BSA)(MP Biomedicals，Inc；目录号152401)、50ng/mlFGF7(PeproTech；目录号100-19)和250nM环巴胺(Calbiochem；目录号239804)。

用四天进行该分化方案的步骤3。通过从各孔抽吸培养基并用新鲜等分量(0.5ml)的高葡萄糖DMEM(Invitrogen；目录号10569)替换每天对细胞进行饲养，所述高葡萄糖DMEM补充有1％B27(Invitrogen；目录号17504-044)、50ng/ml FGF7、100ng/ml成头蛋白(R&D Systems；目录号3344-NG)、250nM KAAD-环巴胺(Calbiochem；目录号239804)和2mM全反式视黄酸(RA)(Sigma-Aldrich；目录号R2625)。在该分化的第三个步骤结束时，从一些孔收获细胞用于通过RT-PCR分析以测量分化的标志物。对其他培养孔进行Pdx1(一种与胰腺内胚层相关的转录因子)和Cdx2(一种与肠内胚层相关的转录因子)的蛋白质表达水平的高内涵图像分析。

用三天进行该分化方案的步骤4。通过从各孔抽吸培养基并用新鲜等分量(0.5ml)的高葡萄糖DMEM替换每天对细胞进行饲养，所述高葡萄糖DMEM补充有1％B27、100ng/ml成头蛋白、100ng/ml轴突导向因子-4、1μM DAPT(EMD Biosciences；目录号565770)和1μM Alk 5抑制剂(Axxora；目录号ALX-270-445)。在该分化的第四个步骤结束时，从一些孔收获细胞用于通过RT-PCR分析以测量分化的标志物。对其他培养孔进行PDX1蛋白质表达水平的高内涵图像分析。

该分化方案的步骤5在具有1％B27和1μM Alk 5抑制剂的高葡萄糖DMEM中进行七天。每天抽吸各孔中的培养基并用新鲜等分试样(0.5ml)替换。在该分化的第五个步骤结束时，从一些孔收获细胞用于通过RT-PCR分析以测量分化的标志物。对其他培养孔进行胰岛素和胰高血糖素的蛋白质表达水平的高内涵图像分析。

该分化方案的步骤6在具有1％B27的高葡萄糖DMEM中进行七天。隔日抽吸各孔中的培养基并用新鲜等分试样(0.5ml)替换。在该分化的第六个步骤结束时，从一些孔收获细胞用于通过RT-PCR分析以测量分化的标志物。

FACS分析：将用于FACS分析的细胞于4℃下在PBS(Invitrogen；目录号14040-133)中的0.5％人γ-球蛋白(Sigma；目录号G-4386)：BDFACS染色缓冲液-BSA(BD；目录号554657)的1∶5溶液中封闭15分钟。然后将细胞在4℃下用CD9 PE(BD；目录号555372)、CD99 PE(Caltag；目录号MHCD9904)和CXCR4 APC(R&D Systems；目录号FAB173A)的抗体染色30分钟。在BD FACS染色缓冲液中的一系列洗涤后，将细胞用7-AAD(BD；目录号559925)针对生活力进行染色并在BDFACSArray上进行。将针对PE和APC两者的小鼠IgG1K同种型对照抗体用于测量阳性细胞百分数。

RT-PCR分析：通过在存在含乙醇的高盐缓冲液的情况下与硅胶膜(Rneasy Mini Kit，Qiagen，CA)结合，随后通过洗涤来除去污染物来对RNA样品进行纯化。用TURBO DNA-free试剂盒(Ambion，INC)使RNA进一步纯化，并随后将高质量的RNA在水中稀释。通过在分光光度计上读取A260和A280读数来评估产率和纯度。用ABI(ABI，CA)大容量cDNA库试剂盒从纯化的RNA制备cDNA拷贝。

除非另外指明，否则所有试剂均购自Applied Biosystems。实时PCR反应用ABI7900序列检测系统来进行。将UNIVERSALPCR MASTER(ABI，CA)用于20ng的逆转录RNA，总反应体积为20μl。每种cDNA样品重复运行两次以校正吸量误差。引物和FAM标记的TAQMAN探针以200nm的浓度使用。使用此前由Applied Biosystems开发的人3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)内源性对照对每一个靶标基因的表达水平进行归一化。引物和探针组在表12中列出。在50℃下初始孵育2分钟然后95℃下孵育10分钟后，将样品进行40次的两阶段循环：变性步骤，95℃15秒，然后退火/延伸步骤，60℃1分钟。用7000序列检测系统软件进行数据分析。对于每个引物/探针组，Ct值确定为荧光强度达到扩增指数区中部中的特定值时的循环数。用比较性Ct方法来计算相对基因表达水平。简而言之，对于每种cDNA样品，从所关注基因的Ct值减去内源对照Ct值而得到改变的Ct值(ΔCt)。靶标的归一化量计算为2-ΔCt，假设扩增为100％的效率。最终的数据是相对于校准样品表示的。

高内涵分析：在培养结束时，将测试平板用PBS(Invitrogen；目录号14190)洗涤一次，用4％多聚甲醛(Alexis Biochemical；目录号ALX-350-011)在室温下固定20分钟，然后用PBS洗涤三次并用0.5％Triton X-100(Sigma；目录号T8760-2)在室温下透化处理20分钟。将细胞再用PBS洗涤三次，然后用4％鸡血清(Invitrogen；目录号16110082)在PBS中于室温下封闭30分钟。将一抗(山羊抗人SOX17；R&D Systems；目录号AF1924)在4％鸡血清中以1∶100稀释，在室温下加至每个孔保持两小时。在用PBS洗涤三次后，将以1∶200稀释于PBS中的Alexa Fluor 488缀合的二抗(鸡抗山羊IgG；Invitrogen；目录号A21467)加至每个孔。为了对细胞核进行复染，在室温下加入5μg/ml Hoechst 33342(Invitrogen；目录号H3570)保持十分钟。将板用PBS洗涤一次，并保留在100μl/孔PBS中以进行成像。用于分析的其他一抗包括1∶100稀释的小鼠抗人CDX2(Invitrogen；目录号397800)、1∶100稀释的山羊抗人Pdx1(Santa CruzBiotechnology；目录号SC-14664)、1∶200稀释的兔抗人胰岛素(CellSignaling；目录号C27C9)和1∶1500稀释的小鼠抗人胰高血糖素(Sigma-Aldrich；目录号G2654)。用于分析的二抗包括1∶400稀释的Alexa Fluor647鸡抗小鼠IgG(Invitrogen；目录号A-21463)、1∶200稀释的Alexa Fluor488驴抗山羊IgG(Invitrogen；目录号A11055)、1∶1000稀释的AlexaFluor 647鸡抗兔IgG(Invitrogen；目录号A21443)和1∶1000稀释的AlexaFluor 488鸡抗小鼠(Invitrogen；目录号A21200)。

用IN Cell Analyzer 1000细胞分析仪(GE Healthcare)进行成像，对于用Hoechst 33342和Alexa Fluor 488染色的细胞采用51008bs二向分色镜。从每孔的25个视野获得图像。用IN Cell Developer Toolbox 1.7(GE Healthcare)软件从每个孔获得总强度的测量值。基于灰阶水平(基线范围100-300)和核大小确定细胞核的分裂情况。计算每个重复数据集的平均值和标准偏差。总蛋白表达记录为总强度或累积强度，该强度定义为细胞总荧光乘以细胞面积。基于灰阶范围在200至4500之间的接受标准来去除背景。通过将每个孔的总强度除以阳性对照的平均总强度，将总强度数据进行归一化。

从分化各步收获的细胞的代表性分化标志物的PCR结果在表13中示出。用GDF-8和Wnt3a处理或用GDF-8和化合物34或化合物56处理的样品显示类似的，或在某些情况下，显示出改善的与内胚层和内分泌分化相关的表达标志物的表达水平。

图3示出了FACS分析的结果，显示了在分化的第一个步骤后定形内胚层标志物CXCR4的表达。用GDF-8和Wnt3a处理人胚胎干细胞与用激活素A和Wnt3a处理相比产生了相等百分比的CXCR4阳性细胞。类似地，用GDF-8和小分子(化合物34或化合物56)处理人胚胎干细胞也产生相等或稍高百分比的CXC4阳性细胞。图4示出了在三天的向定形内胚层分化后人胚胎干细胞中归一化的SOX17蛋白表达的高内涵图像分析。使用GDF-8与Wnt3a或GDF-8与小分子的处理组的表达水平类似于用激活素A和Wnt3a的处理。

图5示出了在向胰腺内胚层分化的第三个步骤后人胚胎干细胞中归一化的Pdx1和Cdx2蛋白表达的高内涵图像分析。使用GDF-8与Wnt3a或GDF-8与Wnt3a或GDF-8与本发明化合物的处理组的表达水平显示出相当水平的PDX1和CDX2。在一些处理组中，在分化后保持的细胞数减少，从而增加了表达PDX1的细胞的比例。在分化的第四个步骤后，在所有处理组中获得显示相当的归一化PDX1表达的类似结果，如图6所示。在图7中，示出了胰岛素和胰高血糖素的归一化蛋白质水平，从而说明激活素A和GDF-8处理组之间的相当表达。

这些综合结果说明，GDF-8与Wnt3a或化合物34或化合物56结合可在定形内胚层分化以及后续的胰腺内胚层和内分泌分化期间替代激活素A。

实例13

使用GDF蛋白家族的其他成员形成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞

确定用其他GDF家族成员处理人胚胎干细胞是否可以形成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞是重要的。在人胚胎干细胞上测试了与化合物34或化合物56结合的Wnt3a与六种不同GDF生长因子[GDF-3、GDF-5、GDF-8、GDF-10、GDF-11和GDF-15]的结合，以确定GDF蛋白家族的成员使人胚胎干细胞向表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化的能力。维持用激活素A和Wnt3a处理过的细胞的平行对照以用于比较目的。

用于测定法的细胞准备：将人胚胎干细胞(H1人胚胎干细胞系)的母培养物以未分化、多能状态维持在MEF调理培养基中的低生长因子MATRIGELTM(BD Biosciences；目录号356231)包被的平皿上，平均每四天传代。传代通过这样来完成：将细胞培养物在37℃下暴露于1mg/ml分散酶(Invitrogen；目录号17105-041)溶液5至7分钟，然后用MEF调理培养基冲洗该单层并小心刮擦以回收细胞簇。将细胞簇低速离心以收集细胞沉淀并除去残余分散酶。将细胞簇以1∶3或1∶4的比例分传以进行例行维持培养，或者以1∶1比例分传以立即进行测试。将所有的人ES细胞系以小于50的传代数进行维持，并例行评估核型是否正常和支原体是否存在。

将细胞簇均匀地再悬浮于补充有8ng/ml bFGF的MEF调理培养基中，并以0.1ml/孔的体积接种至低生长因子MATRIGELTM包被的96孔PackardVIEWPLATES(PerkinElmer；目录号6005182)上。日常饲养是通过从每个孔抽吸掉废培养基并用等体积的新鲜培养基替换来进行。在整个测定法期间，将板维持在37℃、5％CO2下。

测定法：如下开始该测定法：从每个孔抽吸掉培养基，并重新添加测试培养基的等分试样(100μl)。测试条件在总共四天的测定期间重复进行三次，在第1天和第3天通过从各孔抽吸培养基并用新鲜测试培养基替换该培养基来饲养。获得GDF蛋白家族的多个成员用于如下测试：GDF-3(PeproTech；目录号120-22)；GDF-5(DePuy Orthopaedics，Inc.，Johnson& Johnson的公司)；GDF-8(R&D Systems；目录号788-G8)；GDF-10(R&D Systems；目录号1543-BP)；GDF11(PeproTech；目录号120-11)；GDF-15(R&D Systems；目录号957-GD)。在测定的第一天，所有孔均接受等分量(80μl)的补充有0.5％胎牛血清(Hyclone；目录号SH30070.03)的基础培养基DMEM:F12培养基(Invitrogen；目录号11330-032)。产生一系列五个不同的对照或实验测试样品来评价激活素A或多种GDF与Wnt3a或化合物34或化合物56的结合。这些测试样品以20μl等分试样(5x浓缩液)添加到经适当匹配的测定孔，以在所指示的最终测定条件下在各孔中产生100μl的最终测定体积。在第一组对照样品中，测试下面的条件：1)没有添加剂(即，没有补充的生长因子或小分子)；2)100ng/ml激活素A(PeproTech；目录号120-14)结合20ng/ml Wnt3a(R&DSystems；目录号1324-WN/CF)；3)仅20ng/ml Wnt3a；4)仅化合物34(2.5μM)而无任何生长因子或小分子；5)仅化合物56(2.5μM)而无任何生长因子或小分子。在第二组测试样品中，测试了与100ng/ml GDF3结合的如下条件：1)没有添加剂(即，仅GDF-3)；2)20ng/ml Wnt3a；3)20ng/mlWnt3a与化合物34(2.5μM)；4)化合物34(2.5μM)；5)化合物56(2.5μM)和6)20ng/ml Wnt3a与化合物56(2.5μM)。在第三组测试样品中，将六种条件中的每一种与100ng/ml GDF-5组合。在第四组测试样品中，将六种条件中的每一种与100ng/ml GDF-8组合。在第五组测试样品中，将六种条件中的每一种与100ng/ml GDF-10组合。在第六组测试样品中，将六种条件中的每一种与100ng/ml GDF-11组合。在第七组测试样品中，将六种条件中的每一种与100ng/ml GDF-15组合。在测定法的第三天，所有测试样品的所有孔均接受稀释进补充有2％FBS的DMEM:F12培养基中的100ng/ml激活素A或100ng/ml各GDF生长因子，而没有Wnt3a或化合物34或化合物56。

高内涵分析：在培养结束时，将测试平板用PBS(Invitrogen；目录号14190)洗涤一次，用4％多聚甲醛(Alexis Biochemical；目录号ALX-350-011)在室温下固定20分钟，然后用PBS洗涤三次并用0.5％Triton X-100(Sigma；目录号T8760-2)在室温下透化处理20分钟。将细胞再用PBS洗涤三次，然后用4％鸡血清(Invitrogen；目录号16110082)在PBS中于室温下封闭30分钟。将一抗(山羊抗人SOX17；R&D Systems；目录号AF1924)在4％鸡血清中以1∶100稀释，在室温下加至每个孔保持两小时。在用PBS洗涤三次后，将以1∶200稀释于PBS中的Alexa Fluor 488缀合的二抗(鸡抗山羊IgG；Invitrogen；目录号A21467)加至每个孔。为了对细胞核进行复染，在室温下加入5μg/ml Hoechst 33342(Invitrogen；目录号H3570)保持十分钟。将板用PBS洗涤一次，并保留在100μl/孔PBS中以进行成像。

用IN Cell Analyzer 1000细胞分析仪(GE Healthcare)进行成像，对于用Hoechst 33342和Alexa Fluor 488染色的细胞采用51008bs二向分色镜。从每孔的25个视野获得图像。用IN Cell Developer Toolbox 1.7(GE Healthcare)软件从每个孔获得总强度的测量值。基于灰阶水平(基线范围100-300)和核大小确定细胞核的分裂情况。计算每个重复数据集的平均值和标准偏差。总蛋白表达记录为总强度或累积强度，该强度定义为细胞总荧光乘以细胞面积。基于灰阶范围在200至4500之间的接受标准来去除背景。通过将每个孔的总强度除以阳性对照的平均总强度，将总强度数据进行归一化。

图8示出了在四天的向定形内胚层分化后人胚胎干细胞中SOX17蛋白表达的高内涵图像分析。在每种情况下，将结果相对于使用激活素A和Wnt3a的阳性对照处理进行归一化。在图8A中，仅阳性对照处理产生显著的SOX17表达，而单独用Wnt3a或单独用化合物34或化合物56的处理不能诱导SOX17表达。在图8的分图B至分图G中，示出了在各个处理中替代激活素A的各GDF生长因子的归一化SOX17表达水平。GDF-3(图8B)和GDF-5(图8C)诱导了较弱的SOX17表达，并且仅在存在其中一种本发明化合物的测试样品。GDF10(图8D)、GDF11(图8E)和GDF15(图8G)诱导了显著水平的SOX17表达，其超过采用GDF3或5处理所观察到的，但少于采用激活素A和Wnt3a处理所观察到的。通常，SOX17表达在GDF-10、GDF-11或GDF-15与Wnt3a结合时可忽略不计，但在与其中一种本发明化合物结合时尤其是在与化合物34结合时得到改善。图8D示出了使用GDF-8的处理组的结果，其中GDF-8与化合物34或化合物56结合导致强的SOX17诱导，超过了采用激活素A/Wnt3a阳性对照所观察到的结果。在这些实例的一些中，与GDF生长因子组合的化合物34或化合物56的存在也在分化期间引起细胞数的增加。

这些综合结果说明，在与化合物34或化合物56结合使用时GDF-8优于所检测的所有其他GDF家族成员，并可在定形内胚层分化期间替代激活素A。

实例14

使用TGF蛋白超家族的其他成员形成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞

确定用其他TGF超级族成员处理人胚胎干细胞是否可促进形成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞是重要的。在人胚胎干细胞上测试了与TGFβ-1、BMP2、BMP3或BMP4相结合的化合物34和Wnt3a，以确定TGF蛋白超家族的成员使人胚胎干细胞向表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化的能力。同时，将两种不同商业来源的GDF-8与Wnt3a一起进行测试，以测试其使人胚胎干细胞向表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化的能力。维持使用激活素A与Wnt3a的阳性对照以用于比较目的。

用于测定法的细胞的准备：将人胚胎干细胞(H1人胚胎干细胞系)的母培养物以未分化、多能状态维持在MEF调理培养基中的低生长因子MATRIGELTM-(BD Biosciences；目录号356231)包被的平皿上，平均每四天进行传代。传代通过如下来完成：将细胞培养物在37℃下暴露于1mg/ml分散酶(Invitrogen；目录号17105-041)溶液5至7分钟，然后用MEF调理培养基冲洗该单层并小心刮擦以回收细胞簇。将细胞簇低速离心以收集细胞沉淀并除去残余分散酶。将细胞簇以1∶3或1∶4的比例分传以进行例行维持培养，或者以1∶1比例分传以立即进行测试。将所有的人胚胎干细胞系以小于50的传代数进行维持，并例行评价核型是否正常和支原体是否存在。

将细胞簇均匀地再悬浮于补充有8ng/ml bFGF的MEF调理培养基中，并以0.1ml/孔的体积接种至低生长因子MATRIGELTM包被的96孔PackardVIEWPLATES(PerkinElmer；目录号6005182)上。日常饲养是通过从每个孔抽吸掉废培养基并用等体积的新鲜培养基替换来进行。在整个测定法期间，将板维持在37℃、5％CO2下。

测定法：如下开始该测定法：从每个孔抽吸掉培养基，并重新添加测试培养基的等分试样(100μl)。测试条件在总共三天的测定期间重复进行三次，在第1天和第2天通过从各孔抽吸培养基并用新鲜测试培养基替换该培养基来饲养。获得多种生长因子蛋白用于如下测试：BMP-2(R&DSystems；目录号355-BM)；BMP-3(R&D Systems；目录号113-BP)；BMP-4(R&D Systems；目录号314-BP)；TGFβ-1(R&D Systems；目录号240-B)；GDF-8(PeproTech；目录号120-00)；GDF-8(Shenandoah；目录号100-22)和激活素A(PeproTech；目录号120-14)。在测定法的第一天，各孔用80μl的生长培养基[含有2.5％牛血清白蛋白第V组分、无脂肪酸(FAF)BSA(MP Biomedicals，Inc；目录号152401)和10ng/ml bFGF的RPMI-1640(Invitrogen；目录号：22400)]处理。在一些孔中，将25ng/mlWnt3a(R&D Systems；目录号1324-WN/CF)添加至生长培养基以产生20ng/ml的最终测定浓度。在一些孔中，将激活素A添加至生长培养基以产生100ng/ml的最终测定浓度。在一些孔中，将3.125μM化合物34添加至生长培养基以产生2.5μM的最终测定浓度。生长因子(5x浓缩物，稀释于RPMI-1640中)的剂量滴定也添加至各测定孔以对所有测试条件在各孔中产生100μl的最终测试体积。在测定法的第二天，Wnt3a和化合物34从该测定法中省去。所有孔均接受80μl的生长培养基[含有2.5％FAF BSA和10ng/ml bFGF的RPMI-1640]和20μl的各生长因子稀释液(5x浓缩物，稀释于RPMI-1640中)。用于该测定法的比较对照包括：1)无添加的生长因子；2)仅Wnt3a；以及3)激活素A与Wnt3a。测试了与Wnt3a相结合的每种市售GDF-8。将BMP生长因子的每一种以及TGFβ-1与Wnt3a结合、与化合物34结合以及与Wnt3a和化合物34两者结合来测试。

高内涵分析：在培养结束时，将测试平板用PBS(Invitrogen；目录号14190)洗涤一次，用4％多聚甲醛(Alexis Biochemical；目录号ALX-350-011)在室温下固定20分钟，然后用PBS洗涤三次并用0.5％Triton X-100(Sigma；目录号T8760-2)在室温下透化处理20分钟。将细胞再用PBS洗涤三次，然后用4％鸡血清(Invitrogen；目录号16110082)在PBS中于室温下封闭30分钟。将一抗(山羊抗人SOX17；R&D Systems；目录号AF1924)在4％鸡血清中以1∶100稀释，在室温下加至每个孔保持两小时。在用PBS洗涤三次后，将以1∶200稀释于PBS中的Alexa Fluor 488缀合的二抗(鸡抗山羊IgG；Invitrogen；目录号A21467)加至每个孔。为了对细胞核进行复染，在室温下加入5μg/ml Hoechst 33342(Invitrogen；目录号H3570)保持十分钟。将板用PBS洗涤一次，并保留在100μl/孔PBS中以进行成像。

用IN Cell Analyzer 1000细胞分析仪(GE Healthcare)进行成像，对于用Hoechst 33342和Alexa Fluor 488染色的细胞采用51008bs二向分色镜。从每孔的25个视野获得图像。用IN Cell Developer Toolbox 1.7(GE Healthcare)软件从每个孔获得总强度的测量值。基于灰阶水平(基线范围100-300)和核大小确定细胞核的分裂情况。计算每个重复数据集的平均值和标准偏差。总蛋白表达记录为总强度或累积强度，该强度定义为细胞总荧光乘以细胞面积。基于灰阶范围在200至4500之间的接受标准来去除背景。通过将每个孔的总强度除以阳性对照的平均总强度，将总强度数据进行归一化。

图9示出了在三天的向定形内胚层分化后人胚胎干细胞中SOX17蛋白表达的高内涵图像分析。在每种情况下，将结果相对于采用激活素A与Wnt3a的阳性对照处理进行归一化。图9A中的结果显示，仅使用生长因子或仅使用Wnt3a的处理不能诱导SOX17表达；只有添加激活素A才引起强的SOX17表达。在图9的分图B和分图C中，描述了所述市售GDF-8中每一者的结果，其显示两供应商之间的效力差别。尽管比激活素A效力低，但是在用GDF-8结合Wnt3a处理的细胞中有显著的SOX17表达诱导。在图9的分图D、E、F和G中，示出了使用BMP2、BMP3、BMP4和TGFβ-1，掺入各生长因子的剂量滴定，结合Wnt3a或化合物34或结合Wnt3a和化合物34两者的定形内胚层分化的结果。尽管一些处理在测定法结束时对细胞数具有显著影响(如，BMP2和BMP4)，但由这些生长因子和处理组合中任一者引起SOX17表达的诱导与单独Wnt3a处理相比是微弱或可忽略不计的。

实例15

对用所选择的本发明化合物形成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的剂量范围研究

了解将介导表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞形成的化合物181、化合物180、化合物19、化合物202、化合物40和化合物34的最佳工作浓度是重要的。与之相结合，在定形内胚层测定法中针对与激活素A或GDF-8结合的各化合物滴定进行并列比较。最后，在测定法中测试了各化合物的暴露持续时间，同样是与激活素A或GDF-8相结合，仅在测定法的第一天或在整个定形内胚层形成的全部三天期间添加化合物。

用于测定法的细胞的准备：将人胚胎干细胞(H1人胚胎干细胞系)的母培养物以未分化、多能状态维持在补充有8ng/ml bFGF(PeproTech Inc.；目录号100-18B)的MEF调理培养基中的低生长因子MATRIGELTM(BDBiosciences；目录号356231)包被的平皿上，平均每四天进行传代。传代通过如下来进行：使细胞培养物在37℃下暴露于1mg/ml分散酶(Invitrogen；目录号17105-041)溶液5至7分钟，然后用MEF调理培养基冲洗该单层并小心刮擦以回收细胞簇。将细胞簇低速离心以收集细胞沉淀并除去残余分散酶。将细胞簇以1∶3或1∶4的比例分传以进行例行维持培养，或者以1∶1比例分传以立即进行测试。将所有的人胚胎干细胞系以小于50的传代数进行维持，并例行评价核型是否正常和支原体是否存在。

将细胞簇均匀地再悬浮于补充有8ng/ml bFGF的MEF调理培养基中，并以0.1ml/孔的体积接种至低生长因子MATRIGELTM包被的96孔PackardVIEWPLATES(PerkinElmer；目录号6005182)上。日常饲养是通过从每个孔抽吸掉废培养基并用等体积的新鲜培养基替换来进行。在整个测定法期间，将板维持在37℃、5％CO2下。

测定法：如下开始该测定法：从每个孔抽吸掉培养基，并重新添加测试培养基的等分试样(100μl)。测试条件在总共四天测试期间重复进行四次，每天通过从各孔抽吸培养基并用新鲜测试培养基替换该培养基来饲养。各孔用80μl的生长培养基[含有2.5％牛血清白蛋白第V组分、无脂肪酸(FAF)BSA(MP Biomedicals，Inc；目录号152401)、10ng/ml bFGF和另外的生长因子(1.25x浓缩物)的RPMI-1640(Invitrogen；目录号：22400)]以及20μl的测试化合物(5x浓缩物，稀释于RPMI-1640中)处理，以在各孔中产生100ul的最终测定浓度。在本测定法中的测试化合物包括六种本发明的化合物：化合物181、化合物180、化合物19、化合物202、化合物40和化合物34，以及市售的GSK3i抑制剂BIO(EMD Chemicals，Inc.；目录号361550)。在测定法的第一天，将孔用多种对照或实验条件处理。具有所指示的最终测定浓度的对照条件如下：1)仅生长培养基；2)仅20ng/mlWnt3a(R&D Systems；目录号1324-WN/CF)；3)100ng/ml激活素A(PeproTech；目录号120-14)；4)100ng/ml激活素A和20ng/ml Wnt3a；5)100ng/ml GDF-8(R&D Systems，目录号788-G8)；6)100ng/ml GDF-8和20ng/ml Wnt3a。将测试化合物进行系列两倍稀释，以在最终测定法中产生78nM至10μM的浓度范围。实验测试样品组合了各单独的化合物系列稀释物与100ng/ml激活素A或100ng/ml GDF-8，两种处理组均无Wnt3a。在测定法的第二天和第三天，将一些孔继续用20ng/ml Wnt3a或稀释的测试化合物与激活素A或GDF-8结合来处理。在其他孔中，激活素A或GDF-8处理在测定法的第二天和第三天继续进行，但移除了Wnt3a或稀释的测试化合物。

高内涵分析：在培养结束时，将测试平板用PBS(Invitrogen；目录号14190)洗涤一次，用4％多聚甲醛(Alexis Biochemical；目录号ALX-350-011)在室温下固定20分钟，然后用PBS洗涤三次并用0.5％Triton X-100(Sigma；目录号T8760-2)在室温下透化处理20分钟。将细胞再用PBS洗涤三次，然后用4％鸡血清(Invitrogen；目录号16110082)在PBS中于室温下封闭30分钟。将一抗(山羊抗人SOX17；R&D Systems；目录号AF1924)在4％鸡血清中以1∶100稀释，在室温下加至每个孔保持两小时。在用PBS洗涤三次后，将以1∶200稀释于PBS中的Alexa Fluor 488缀合的二抗(鸡抗山羊IgG；Invitrogen；目录号A21467)加至每个孔。为了对细胞核进行复染，在室温下加入5μg/ml Hoechst 33342(Invitrogen；目录号H3570)保持十分钟。将板用PBS洗涤一次，并保留在100μl/孔PBS中以进行成像。

用IN Cell Analyzer 1000细胞分析仪(GE Healthcare)进行成像，对于用Hoechst 33342和Alexa Fluor 488染色的细胞采用51008bs二向分色镜。从每孔的25个视野获得图像。用IN Cell Developer Toolbox 1.7(GE Healthcare)软件从每个孔获得总强度的测量值。基于灰阶水平(基线范围100-300)和核大小确定细胞核的分裂情况。计算每个重复数据集的平均值和标准偏差。总蛋白表达记录为总强度或累积强度，该强度定义为细胞总荧光乘以细胞面积。基于灰阶范围在200至4500之间的接受标准来去除背景。通过将每个孔的总强度除以阳性对照的平均总强度，将总强度数据进行归一化。

结果：SOX17表达的高内涵分析结果在图10-14中示出，在测定结束时所得的细胞数在图15-19中示出。在图10中，示出了由单独或与Wnt3a结合使用激活素A或GDF-8的对照处理产生的SOX17表达的结果。激活素A处理导致比用GDF-8处理所观察到的明显更高的SOX17表达。类似地，如图15所示，不论测定期间Wnt3a存在一天或三天，激活素A处理导致在测定法结束时比用GDF-8处理所观察到的更高的细胞数。不论化合物在测定开始时存在一天还是在整个测定期间存在三天，激活素A处理添加化合物181、化合物180、化合物19、化合物202、化合物40或化合物34中任一者不会增强SOX17表达(图11-12)或增加细胞数(图17-18)。然而，使用化合物181、化合物180、化合物19、化合物202、化合物40或化合物34结合GDF-8的处理显著改善了SOX17表达(图13-14)并且也提高了测定法结束时的细胞数(图18-19)。当化合物181、化合物180、化合物19、化合物202、化合物40或化合物34以及GDF-8结合使用时，在许多情况下对SOX17表达和细胞数的改善与使用激活素A处理所观察到的结果相当。尽管有时在最高浓度下观察到毒性，但结合GDF-8的改善分化对许多化合物的剂量滴定效果明显。在大部分情况下，仅在测定法开始时暴露于化合物一天，通过化合物和GDF-8处理获得的最佳有益效果是明显的。在一些情况下，在整个测定法期间化合物的存在没有不利的效果或具有略微有益的效果。根据这些综合结果，与GDF8处理相结合的每种化合物的最佳工作浓度范围得以确定。如本测定法所测试的，结果是化合物特异性的，通常在1-10μM的范围内。

实例16

不根据本发明方法形成的表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞能够进一步分化为表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞

就定形内胚层分化对另外的小分子与GDF-8相结合进行了测试。这些包括市售的GSK3抑制剂以及本发明的化合物。将分步分化方案应用到用GDF-8结合多种小分子处理过的细胞。通过代表胰腺内胚层或胰腺内分泌谱系的生物标志物的基因表达来确定分化的效力。在整个分步分化过程中，维持用激活素A和Wnt3a处理的细胞的平行对照样品以用于比较目的。

用于测定法的细胞准备：将人胚胎干细胞(H1人胚胎干细胞系)的母培养物以未分化、多能状态维持在MEF调理培养基中的低生长因子MATRIGELTM(BD Biosciences；目录号356231)包被的平皿上，平均每四天传代。传代通过这样进行：使细胞培养物在37℃下暴露于1mg/ml分散酶(Invitrogen，目录号：17105-041)的溶液5至7分钟，然后用MEF调理培养基冲洗该单层并小心刮擦以回收细胞簇。将细胞簇低速离心以收集细胞沉淀并除去残余的分散酶。将细胞簇以1∶3或1∶4的比例分传以进行例行维持培养，或者以1∶1比例分传以立即进行测试。将所有的人胚胎干细胞系以小于50的传代数进行维持，并例行评价核型是否正常和支原体是否存在。

将细胞簇均匀地再悬浮于补充有8ng/ml bFGF的MEF调理培养基中，并以0.5ml/孔的体积接种到低生长因子MATRIGEL包被的24孔黑壁培养板(Arctic White；目录号AWLS-303012)上。日常饲养是通过从每个孔抽吸掉废培养基并用等体积的新鲜培养基替换来进行。在整个测定法期间，将板维持在37℃、5％CO2下。

测定法：如下开始该测定法：从每个孔抽吸掉培养基，并重新添加测试培养基的等分试样(0.5ml)。在三天的周期内进行分化第一步的测试条件，每天通过从各孔抽吸培养基并用新鲜的测试培养基替换该培养基来饲养。在测定法的第一天，将100ng/ml激活素A(PeproTech；目录号120-14)或100ng/ml GDF-8(R&D Systems，目录号788-G8)添加至各测定孔，其中各生长因子被稀释进具有2％牛血清白蛋白第V组分、无脂肪酸(FAF BSA)(Proliant Inc.，目录号：SKU 68700)和20ng/ml Wnt3a(R&D Systems；目录号1324-WN/CF)的RPMI-1640培养基(Invitrogen；目录号：22400)中。在该测定法的第二天，将100ng/ml激活素A或100ng/ml GDF-8稀释进补充有2％FAF BSA但没有Wnt3a的RPMI-1640培养基中。在一些使用GDF-8的测试样品中，用小分子化合物代替Wnt3a，其仅在定形内胚层分化的第一天添加。这些小分子包括化合物19(在测定法中为2.5μM)、化合物202(在测定法中为2.5μM)、化合物40(在测定法中为2.5μM)或市售的GSK3抑制剂BIO(在测定法中为0.5μM)(EMD Chemicals，Inc.；目录号361550)。在分化的第一步结束时，从一些孔收获细胞进行流式细胞检测分析，以评价CXCR4(定形内胚层形成的标志物)的水平。从另外的孔收获样品用于RT-PCR分析，以测量其他分化标志物。

在定形内胚层分化第一步结束时，使各处理组的重复平行孔组进行进一步分步分化。重要的是注意在第一个分化步骤之后，所有经历后续培养和分化的孔均接受相同的处理。这种连续分化的方案在下面描述。

用二天进行该分化方案的步骤2。通过从各孔抽吸培养基并用新鲜等分量(0.5ml)的DMEM:F12培养基(Invitrogen；目录号11330-032)替换每天对细胞进行饲养，所述DMEM:F12培养基含有2％FAF BSA、50ng/ml FGF7(PeproTech；目录号100-19)和250nM环巴胺-KAAD(Calbiochem；目录号239804)。

用七天进行该分化方案的步骤3。通过从各孔抽吸培养基并用新鲜等分量(0.5ml)的高葡萄糖DMEM(Invitrogen；目录号10569)替换每天对细胞进行饲养，所述高葡萄糖DMEM补充有0.1％Albumax(Invitrogen；目录号：11020-021)、0.5x胰岛素-转铁蛋白-硒(ITS-X；Invitrogen；目录号51500056)、50ng/ml FGF7、100ng/ml成头蛋白(R&D Systems；目录号3344-NG)、250nM KAAD-环巴胺和2mM全反式视黄酸(RA)(Sigma-Aldrich；目录号R2625)。在该分化的第三个步骤结束时，从一些孔收获细胞用于通过RT-PCR分析以测量分化的标志物。对其他培养孔进行Pdx1和Cdx2的蛋白质表达水平的高内涵图像分析。

用三天进行该分化方案的步骤4。通过从各孔抽吸培养基并用新鲜等分量(0.5ml)的高DMEM葡萄糖替换每天对细胞进行饲养，所述高葡萄糖DMEM补充有0.1％Albumax、0.5x胰岛素-转铁蛋白-硒、100ng/ml成头蛋白和1μM Alk 5抑制剂(Axxora；目录号ALX-270-445)。在该分化的第四个步骤结束时，从一些孔收获细胞用于通过RT-PCR分析以测量分化的标志物。对其他培养孔进行Pdx1蛋白质表达水平的高内涵图像分析。

该分化方案的步骤5在具有0.1％Albumax、0.5x胰岛素-转铁蛋白-硒和1μM Alk 5抑制剂的高葡萄糖DMEM中进行七天。每天抽吸各孔中的培养基并用新鲜等分试样(0.5ml)替换。在该分化的第五个步骤结束时，从一些孔收获细胞用于通过RT-PCR分析以测量分化的标志物。对其他培养孔进行胰岛素和胰高血糖素的蛋白质表达水平的高内涵图像分析。

FACS分析：将用于FACS分析的细胞于4℃下在PBS(Invitrogen；目录号14040-133)中的0.5％人γ-球蛋白(Sigma；目录号G-4386)：BDFACS染色缓冲液-BSA(BD；目录号554657)的1：5溶液中封闭15分钟。然后将细胞在4℃下用CD9 PE(BD；目录号555372)、CD99 PE(Caltag；目录号MHCD9904)和CXCR4 APC(R&D Systems；目录号FAB173A)的抗体染色30分钟。在BD FACS染色缓冲液中的一系列洗涤后，将细胞用7-AAD(BD；目录号559925)针对生活力进行染色并在BDFACSArray上进行。将针对PE和APC两者的小鼠IgG1K同种型对照抗体用于测量阳性细胞百分数。

RT-PCR分析：通过在存在含乙醇的高盐缓冲液的情况下与硅胶膜(Rneasy Mini Kit，Qiagen，CA)结合，随后通过洗涤来除去污染物来对RNA样品进行纯化。用TURBO DNA-free试剂盒(Ambion，INC)使RNA进一步纯化，并随后将高质量的RNA在水中稀释。通过在分光光度计上读取A260和A280读数来评估产率和纯度。用ABI(ABI，CA)大容量cDNA库试剂盒从纯化的RNA制备cDNA拷贝。

除非另外指明，否则所有试剂均购自Applied Biosystems。实时PCR反应用ABI7900序列检测系统来进行。将UNIVERSALPCR MASTER(ABI，CA)用于20ng的逆转录RNA，总反应体积为20μl。每种cDNA样品重复运行两次以校正吸量误差。引物和FAM标记的TAQMAN探针以200nm的浓度使用。使用此前由Applied Biosystems开发的人3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)内源性对照对每一个靶标基因的表达水平进行归一化。引物和探针组在表12中列出。在50℃下初始孵育2分钟然后95℃下孵育10分钟后，将样品进行40次的两阶段循环：变性步骤，95℃15秒，然后退火/延伸步骤，60℃1分钟。数据分析用7000序列检测系统的软件进行。对于每个引物/探针组，Ct值确定为荧光强度达到扩增指数区中部中的特定值时的循环数。用比较性Ct方法来计算相对基因表达水平。简而言之，对于每种cDNA样品，从所关注基因的Ct值减去内源对照Ct值而得到改变的Ct值(ΔCt)。靶标的归一化量计算为2-ΔCt，假设扩增为100％的效率。最终的数据是相对于校准样品表示的。

高内涵分析：在培养结束时，将测试平板用PBS(Invitrogen；目录号14190)洗涤一次，用4％多聚甲醛(Alexis Biochemical；目录号ALX-350-011)在室温下固定20分钟，然后用PBS洗涤三次并用0.5％Triton X-100(Sigma；目录号T8760-2)在室温下透化处理20分钟。将细胞再用PBS洗涤三次，然后用4％鸡血清(Invitrogen；目录号16110082)在PBS中于室温下封闭30分钟。将一抗(山羊抗人SOX17；R&D Systems；目录号AF1924)在4％鸡血清中以1∶100稀释，在室温下加至每个孔保持两小时。在用PBS洗涤三次后，将以1∶200稀释于PBS中的Alexa Fluor 488缀合的二抗(鸡抗山羊IgG；Invitrogen；目录号A21467)加至每个孔。为了对细胞核进行复染，在室温下加入5μg/ml Hoechst 33342(Invitrogen；目录号H3570)保持十分钟。将板用PBS洗涤一次，并保留在100μl/孔PBS中以进行成像。用于分析的其他一抗包括1∶200稀释的兔抗人胰岛素(CellSignaling；目录号C27C9)和1∶1500稀释的小鼠抗人胰高血糖素(Sigma-Aldrich；目录号G2654)。用于分析的二抗包括：1∶1000稀释的Alexa Fluor647鸡抗兔IgG(Invitrogen；目录号A21443)和1∶1000稀释的Alexa Fluor488鸡抗小鼠IgG(Invitrogen；目录号A21200)。

用IN Cell Analyzer 1000细胞分析仪(GE Healthcare)进行成像，对于用Hoechst 33342和Alexa Fluor 488染色的细胞采用51008bs二向分色镜。从每孔的25个视野获得图像。用IN Cell Developer Toolbox 1.7(GE Healthcare)软件从每个孔获得总强度的测量值。基于灰阶水平(基线范围100-300)和核大小确定细胞核的分裂情况。计算每个重复数据集的平均值和标准偏差。总蛋白表达记录为总强度或累积强度，该强度定义为细胞总荧光乘以细胞面积。基于灰阶范围在200至4500之间的接受标准来去除背景。通过将每个孔的总强度除以阳性对照的平均总强度，将总强度数据进行归一化。

从分化各步收获的细胞的代表性分化标志物的PCR结果在表14中示出。用GDF-8和Wnt3a处理或用GDF-8和小分子处理的样品显示出类似的与内胚层和内分泌分化相关的标志物的表达水平。

图20分图A示出了在分化的第一个步骤后定形内胚层标志物CXCR4的FACS分析。用GDF-8和Wnt3a处理人胚胎干细胞与用激活素A和Wnt3a处理相比产生了类似百分比的CXCR4阳性细胞。用GDF-8和本发明的化合物(化合物19、化合物202、化合物40或GSK3抑制剂IX BIO)处理人胚胎干细胞也产生相当的或稍高的百分比的CXCR4阳性细胞。图20分图B示出了在三天的向定形内胚层分化后人胚胎干细胞中归一化的SOX17蛋白表达的高内涵图像分析。在一些情况下，用GDF-8处理导致在分化的第一步结束时细胞数较低。然而，与Wnt3a或与小分子抑制剂相结合的GDF-8处理明显诱导了SOX17(一种定形内胚层的标志物)的表达。在一种情形下，用GDF-8和化合物40处理导致培养物中的细胞数和SOX17表达与用激活素A和Wnt3处理的相当。

图20分图C示出了从通过分化步骤5处理的培养物回收的相对细胞数的高内涵图像分析。如较早在步骤1结束时所观察到的，相对于用激活素A和Wnt3a处理，一些处理引起细胞回收率的下降。这种细胞数的降低尤其见于使用GDF-8与GSK3抑制剂BIO以及使用GDF-8与化合物19的处理组。另外的GDF-8处理组的细胞回收率类似于使用激活素A和Wnt3a的处理。在图20分图D-F中，示出了各处理组的胰岛素和胰高血糖素的归一化蛋白质水平连同它们相应的比率。相对于用激活素A和Wnt3a处理，类似水平的胰岛素和胰高血糖素可通过GDF-8处理中的每一者获得，从而证实了GDF-8结合Wnt3a或小分子可以在定形内胚层分化和后续胰腺内胚层和内分泌分化期间替代激活素A。

实例17

使用GDF8和本发明化合物形成的表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞能够进一步分化为表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞

针对定形内胚层分化对与GDF-8和激活素A相结合的另外的小分子进行了测试。这些包括市售的GSK3抑制剂以及本发明的化合物。将分步分化方案应用于用GDF-8结合多种小分子处理的细胞。通过代表胰腺内胚层和胰腺内分泌谱系的生物标志物的基因表达来确定分化的效力。在整个分步分化过程中，维持用激活素A和Wnt3a处理过的细胞的平行对照以用于比较目的。

用于测定法的细胞的准备：将人胚胎干细胞(H1人胚胎干细胞系)的母培养物以未分化、多能状态维持在补充有8ng/ml bFGF(PeproTech Inc.；目录号100-18B)的MEF调理培养基中的低生长因子MATRIGELTM(BDBiosciences；目录号356231)包被的平皿上，平均每四天进行传代。传代通过这样来完成：将细胞培养物在37℃下暴露于1mg/ml分散酶(Invitrogen；目录号17105-041)溶液5至7分钟，然后用MEF调理培养基冲洗该单层并小心刮擦以回收细胞簇。将细胞簇低速离心以收集细胞沉淀并除去残余的分散酶。将细胞簇以1∶3或1∶4的比例分传以进行例行维持培养，或者以1∶1比例分传以立即进行测试。将所有的人ES细胞系以小于50的传代数进行维持，并例行评估核型是否正常和支原体是否存在。

将细胞簇均匀地再悬浮于补充有8ng/ml bFGF的MEF调理培养基中，并以0.5ml/孔的体积接种到低生长因子MATRIGELTM包被的24孔黑壁培养板(Arctic White；目录号AWLS-303012)上。日常饲养是通过从每个孔抽吸掉废培养基并用等体积的新鲜培养基替换来进行。在整个测定法期间，将板维持在37℃、5％CO2下。

测定法：如下开始该测定法：从每个孔抽吸掉培养基，并重新添加测试培养基的等分试样(0.5ml)。在三天的周期内进行分化第一步的测试条件，每天通过从各孔抽吸培养基并用新鲜的测试培养基替换该培养基来饲养。在测定法的第一天，将100ng/ml激活素A(PeproTech；目录号120-14)或100ng/ml GDF-8(R&D Systems，目录号788-G8)添加至各测定孔，其中各生长因子被稀释进具有2％牛血清白蛋白第V组分、无脂肪酸(FAF)BSA(MP Biomedicals，Inc；目录号152401)的RPMI-1640培养基(Invitrogen；目录号22400)中。在一些样品中，还包括20ng/ml Wnt3a(R&D Systems；目录号1324-WN/CF)。在测定法的第二天，将100ng/ml激活素A或100ng/ml GDF-8稀释进补充有2％FAF BSA的RPMI-1640培养基中，将Wnt3a从所有样品省去。在一些使用GDF-8的测试样品中，用给定浓度的小分子化合物替换Wnt3a，其仅在定形内胚层分化的第一天添加。这些小分子包括：化合物181(在测定法中为1.25μM)、化合物180(在测定法中为2.5μM)、化合物19(在测定法中为10μM)、化合物202(在测定法中为2.5μM)、化合物40(在测定法中为5μM)、化合物34(在测定法中为2.5μM)、化合物206(在测定法中为2.5μM)和市售的GSK3抑制剂IXBIO(在测定法中为10μM)(EMD Chemicals，Inc.；目录号361550)。在分化的第一步结束时，从一些孔收获细胞进行流式细胞检测分析，以评价CXCR4(定形内胚层形成的标志物)的水平。从另外的孔收获样品用于RT-PCR分析，以测量其他分化标志物。

在定形内胚层分化的第一个步骤结束时，各处理组的重复平行孔组经受进一步分步分化。重要的是注意到在第一个分化步骤之后，所有经历后续培养和分化的孔接受相同的处理。这种连续分化的方案在下面描述。

用二天进行该分化方案的步骤2。通过从各孔抽吸培养基并用新鲜等分量(0.5ml)的DMEM:F12培养基(Invitrogen；目录号11330-032)替换每天对细胞进行饲养，所述DMEM:F12培养基含有2％FAF BSA、50ng/ml FGF7(PeproTech；目录号100-19)和250nM环巴胺-KAAD(Calbiochem；目录号239804)。

用四天进行该分化方案的步骤3。通过从各孔抽吸培养基并用新鲜等分量(0.5ml)的高葡萄糖DMEM(Invitrogen；目录号10569)替换每天对细胞进行饲养，所述高葡萄糖DMEM补充有0.1％Albumax(Invitrogen；目录号：11020-021)、0.5x胰岛素-转铁蛋白-硒(ITS-X；Invitrogen；目录号51500056)、50ng/ml FGF7、100ng/ml成头蛋白(R&D Systems；目录号3344-NG)、250nM KAAD-环巴胺和2μM全反式视黄酸(RA)(Sigma-Aldrich；目录号R2625)。在该分化的第三个步骤结束时，从一些孔收获细胞用于通过RT-PCR分析以测量分化的标志物。

用三天进行该分化方案的步骤4。通过从各孔抽吸培养基并用新鲜等分量(0.5ml)的高葡萄糖DMEM替换每天对细胞进行饲养，所述高葡萄糖DMEM补充有0.1％Albumax、0.5x胰岛素-转铁蛋白-硒、100ng/ml成头蛋白和1μM Alk 5抑制剂(Axxora；目录号ALX-270-445)。在该分化的第四个步骤结束时，从一些孔收获细胞用于通过RT-PCR分析以测量分化的标志物。

该分化方案的步骤5在具有0.1％Albumax、0.5x胰岛素-转铁蛋白-硒和1μM Alk 5抑制剂的高葡萄糖DMEM中进行七天。每天抽吸各孔中的培养基并用新鲜等分试样(0.5ml)替换。在该分化的第五个步骤结束时，从一些孔收获细胞用于通过RT-PCR分析以测量分化的标志物。对其他培养孔进行胰岛素和胰高血糖素的蛋白质表达水平的高内涵图像分析。

FACS分析：将用于FACS分析的细胞于4℃下在PBS(Invitrogen；目录号14040-133)中的0.5％人γ-球蛋白(Sigma；目录号G-4386)：BDFACS染色缓冲液-BSA(BD；目录号554657)的1∶5溶液中封闭15分钟。然后将细胞在4℃下用CD9 PE(BD；目录号555372)、CD99 PE(Caltag；目录号MHCD9904)和CXCR4 APC(R&D Systems；目录号FAB173A)的抗体染色30分钟。在BD FACS染色缓冲液中的一系列洗涤后，将细胞用7-AAD(BD；目录号559925)针对生活力进行染色并在BDFACSArray上进行。将针对PE和APC两者的小鼠IgG1K同种型对照抗体用于测量阳性细胞百分数。

RT-PCR分析：通过在存在含乙醇的高盐缓冲液的情况下与硅胶膜(Rneasy Mini Kit，Qiagen，CA)结合，随后通过洗涤来除去污染物来对RNA样品进行纯化。用TURBO DNA-free试剂盒(Ambion，INC)使RNA进一步纯化，并随后将高质量的RNA在水中稀释。通过在分光光度计上读取A260和A280读数来评估产率和纯度。用ABI(ABI，CA)大容量cDNA库试剂盒从纯化的RNA制备cDNA拷贝。

除非另外指明，否则所有试剂均购自Applied Biosystems。实时PCR反应用ABI7900序列检测系统来进行。将UNIVERSALPCR MASTER(ABI，CA)用于20ng的逆转录RNA，总反应体积为20μl。每种cDNA样品重复运行两次以校正吸量误差。引物和FAM标记的TAQMAN探针以200nm的浓度使用。使用此前由Applied Biosystems开发的人3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)内源性对照对每一个靶标基因的表达水平进行归一化。引物和探针组在表12中列出。在50℃下初始孵育2分钟然后95℃下孵育10分钟后，将样品进行40次的两阶段循环：变性步骤，95℃15秒，然后退火/延伸步骤，60℃1分钟。数据分析用GENEAMP 7000序列检测系统的软件进行。对于每个引物/探针组，Ct值确定为荧光强度达到扩增指数区中部中的特定值时的循环数。用比较性Ct方法来计算相对基因表达水平。简而言之，对于每种cDNA样品，从所关注基因的Ct值减去内源对照Ct值而得到改变的Ct值(ΔCt)。靶标的归一化量计算为2-ACt，假设扩增为100％的效率。最终的数据是相对于校准样品表示的。

高内涵分析：在培养结束时，将测试平板用PBS(Invitrogen；目录号14190)洗涤一次，用4％多聚甲醛(Alexis Biochemical；目录号ALX-350-011)在室温下固定20分钟，然后用PBS洗涤三次并用0.5％Triton X-100(Sigma；目录号T8760-2)在室温下透化处理20分钟。将细胞再用PBS洗涤三次，然后用4％鸡血清(Invitrogen；目录号16110082)在PBS中于室温下封闭30分钟。将一抗(山羊抗人SOX17；R&D Systems；目录号AF1924)在4％鸡血清中以1∶100稀释，在室温下加至每个孔保持两小时。在用PBS洗涤三次后，将以1∶200稀释于PBS中的Alexa Fluor 488缀合的二抗(鸡抗山羊IgG；Invitrogen；目录号A21467)加至每个孔。为了对细胞核进行复染，在室温下加入5μg/ml Hoechst 33342(Invitrogen；目录号H3570)保持十五分钟。将板用PBS洗涤一次，并保留在100μl/孔PBS中以进行成像。用于分析的其他一抗包括1∶100稀释的小鼠抗人CDX2(Invitrogen；目录号397800)、1∶100稀释的山羊抗人Pdx1(Santa CruzBiotechnology；目录号SC-14664)、1∶200稀释的兔抗人胰岛素(CellSignaling；目录号C27C9)和1∶1500稀释的小鼠抗人胰高血糖素(Sigma-Aldrich；目录号G2654)。用于分析的二抗包括1∶400稀释的Alexa Fluor647鸡抗小鼠IgG(Invitrogen；目录号A-21463)、1∶200稀释的Alexa Fluor488驴抗山羊IgG(Invitrogen；目录号A11055)、1∶1000稀释的Alexa Fluor647鸡抗兔IgG(Invitrogen；目录号A21443)和1∶1000稀释的Alexa Fluor488鸡抗小鼠(Invitrogen；目录号A21200)。

用IN Cell Analyzer 1000细胞分析仪(GE Healthcare)进行成像，对于用Hoechst 33342和Alexa Fluor 488染色的细胞采用51008bs二向分色镜。从每孔的25个视野获得图像。用IN Cell Developer Toolbox 1.7(GE Healthcare)软件从每个孔获得总强度的测量值。基于灰阶水平(基线范围100-300)和核大小确定细胞核的分裂情况。计算每个重复数据集的平均值和标准偏差。总蛋白表达记录为总强度或累积强度，该强度定义为细胞总荧光乘以细胞面积。基于灰阶范围在200至4500之间的接受标准来去除背景。通过将每个孔的总强度除以阳性对照的平均总强度，将总强度数据进行归一化。

结果：从分化各步收获的细胞的代表性分化标志物的结果在图21和表15中示出。在图21A和B中，示出在定形内胚层分化的第一个步骤期间多种处理的CXCR4流式细胞计数结果。图21A示出了通过用多种化合物结合激活素A处理对CXCR4表达的作用。图21B示出了通过用多种化合物结合GDF-8处理对CXCR4的作用。本发明化合物与激活素A相结合没有提高CXCR4表达。然而，在该实例中检测的所有本发明化合物与GDF-8相结合提高了CXCR4表达。

在图21C和21D中，示出了针对在该方案的步骤一期间应用的处理，在分化的步骤一结束时多种分化标志物的归一化RT-PCR值，所述处理使用所选的本发明化合物与激活素A(图21C)的结合或与GDF-8(图21D)的结合。在该分化方案的步骤三结束时(图21E和21F)和在分化方案的步骤四结束时(图21G和21H)以及在分化方案的步骤5结束时(图21I和21J)评估类似的归一化RT-PCR值。相对于单独的GDF-8处理(图21F、21H和21J)，在分化步骤1期间的处理(其组合了本发明的化合物和GDF-8)改善了多种内胚层和胰腺标志物的表达。相对于单独用激活素A或用激活素A和Wnt3a(图21E和21G和21I)处理，将本发明化合物与激活素A组合的处理在表达标志物方面很少或没有改善。表15概括了在各分化步骤结束时另外的基因标志物的比较CT值，其比较了在第步骤一期间将激活素A或GDF-8与或不与本发明化合物组合的处理。在分化的步骤五结束时，进行高内涵分析以测量细胞数(图21K和21M)以及胰岛素和胰高血糖素的蛋白质表达(图21L和21N)。在分化的第一个步骤期间单独用GDF-8或用GDF-8与本发明化合物结合处理，在分化的步骤五结束时引起胰岛素和胰高血糖素表达，从而证明GDF-8能够在定形内胚层形成开始期间替代激活素A，并随后导致胰腺激素细胞。总起来说，这些数据显示各小分子中任一者的添加对结合激活素A的处理的分化标志物具有极微的作用。然而，与GDF8处理结合添加小分子在分化的步骤1结束时对直接的定形内胚层分化以及还在第步骤3、4、和5结束时对下游分化标志物具有显著改善的作用。在一组小分子内观察到变异性，这可能可归因于测定法中使用的化合物的浓度和/或作用的机理。

实例18

使用GDF8和本发明化合物形成的表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞能够在移植进啮齿动物内后释放C肽

确定通过用GDF-8和小分子处理体外产生表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞是否可以在体内产生功能性内分泌细胞是重要的。进行了体内移植研究以将通过用激活素和Wnt3a处理与用GDF-8和小分子化合物处理发生分化的细胞相比较。

细胞的准备：将H1人胚胎干细胞簇在低生长因子MATRIGELTM(Invitrogen；目录号356231)包被的组织培养塑料上培养，平均每四天进行传代。补充有8ng/mL bFGF的MEF调理培养基用于初始接种和扩增。将所有人胚胎干细胞系以小于50的传代数进行维持，并例行评估核型是否正常和支原体污染是否存在。

传代通过这样进行：使细胞培养物在37℃下暴露于1mg/ml分散酶(Invitrogen，目录号：17105-041)的溶液5至7分钟，然后用MEF调理培养基冲洗细胞单层并小心刮擦以回收细胞簇。将细胞簇在MEF调理培养基中低速离心，以除去残余分散酶，然后均匀地再悬浮于补充有8ng/ml bFGF(PeproTech Inc.；目录号100-18B)的MEF调理培养基中，用以使用2.5ml/孔的体积以1∶3的比率接种在低生长因子MATRIGEL(BDBiosciences；目录号356231)包被的6孔板(Nunc；目录号140685)上。日常饲养是通过从每个孔抽吸掉废培养基并用等体积的新鲜培养基替换来进行。在整个培养期间，将板维持在37℃、5％CO2下。

细胞分化：在细胞接种到用低生长因子MATRIGELTM包被的6孔板之后三天开始分化过程。将一分四步的方案用于使H1人胚胎干细胞体外分化为表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。用三天进行步骤1以产生定形内胚层细胞。在步骤1的第一天，通过抽吸掉废培养基并添加等体积的具有2％牛血清白蛋白第V组分、无脂肪酸(FAF BSA)(Proliant Biologicals；目录号SKU 68700)和8ng/ml bFGF的RPMI-1640基础培养基(Invitrogen；目录号22400)开始分化。在一个处理组中，使细胞暴露于100ng/ml激活素A(PeproTech；目录号120-14)与20ng/ml Wnt3a(R&D Systems；目录号1324-WN/CF)。在第二处理组中，使细胞暴露于100ng/ml GDF-8(R&D Systems；目录号788-G8)与2.5mM化合物40。在第三处理组中，使细胞暴露于100ng/ml GDF-8(R&D Systems；目录号788-G8)与2.5mM化合物202。在分化的步骤1的第二天和第三天，所有处理组中的细胞在没有添加Wnt3a或本发明化合物的情况下用含有2％FAF BSA、8ng/ml bFGF和100ng/ml激活素A(处理组1)或100ng/ml GDF-8(处理组2和3)的RPMI-1640饲养。在培养的第三天结束时，收集各处理组的一孔用于FACS分析。

用三天进行该分化方案的步骤2。所有处理组的细胞每天用补充有2％FA BSA和50ng/ml FGF7(PeproTech；目录号100-19)的DMEM:F12(Invitrogen；目录号11330-032)饲养。

用四天进行该分化方案的步骤3。所有处理组的细胞每天用补充有1％B27(Invitrogen；目录号：17504-044)、50ng/ml FGF7、100ng/ml成头蛋白(R&D Systems；目录号3344-NG)、250nM KAAD-环巴胺(Calbiochem；目录号239804)和2mM全反式视黄酸(RA)(Sigma-Aldrich；目录号R2625)的高葡萄糖DMEM(Invitrogen；目录号10569)饲养。

用三天进行该分化方案的步骤4。所有处理组的细胞前两天每天用补充有1％B27、100ng/ml成头蛋白和1mM ALK5抑制剂(Axxora；目录号ALX-270-445)的高葡萄糖DMEM饲养。在第三天，细胞通过使用20ml枪头(Rainin；目录号RT-L10F)和细胞刮棒(Corning；目录号3008)从下层提升，然后转移至50ml管。让细胞通过重力沉淀，在不扰动细胞沉淀物的情况下抽吸上清液。将细胞再悬浮于补充有1％B27、100ng/ml成头蛋白和1mM ALK5抑制剂的高葡萄糖DMEM中，然后在六孔Costar超低吸附微板(Corning Inc.，目录号3471)中过夜培养。次日，收集悬浮培养物中的细胞并计数。将10×106个细胞/小鼠的等分试样用于移植。收集0.5×106个细胞的等分试样用于RT-PCR分析。

图22分图A示出了在各处理组每一者的步骤1结束时产生的定形内胚层细胞的流式细胞计数结果。用激活素A和Wnt3a处理或用GDF-8和本发明化合物处理在步骤1结束时引起表达类似水平CXCR4(大于85％)的细胞，从而表明从各处理组衍生相当的定形内胚层细胞群体。

在该分化方案的步骤4结束时各处理组细胞的RT-PCR分析的结果示于图22分图B中。使用激活素A和Wnt3a或使用GDF-8和化合物40或使用GDF-8和化合物202向胰腺内胚层(PE)分化的细胞表达了相当水平的PE标志物：CDX2、MAFA、NGN3、NKX6.1、PDX1和Ptflα。这些结果表明，利用GDF-8和小分子的分化方案在产生胰腺内胚层前体细胞群体方面是同样有效的。

将根据本发明的方法处理的人胚胎干细胞移植进小鼠：五至六周龄雄性scid-beige小鼠(C.B-Igh-1b/GbmsTac-Prkdcscid-LystbgN7)从TaconicFarms购得。将小鼠圈养在微隔离笼(microisolator cage)中，自由获得无菌食物和水。在手术准备过程中，小鼠通过耳部加标签来辨别，测量其体重，并使用手持血糖测计仪(LifeScan；One Touch)来确定其血糖。在手术当天，用异氟烷和氧气的混合物麻醉小鼠，并且用小型动物剪毛刀刮剃手术部位。在手术前小鼠皮下施予0.1mg kg Buprenex。通过用70％异丙醇、10％聚维酮-碘和70％异丙醇连续洗涤来准备手术部位，并产生穿透皮肤和肌肉层的左侧切口。使左肾暴露于外并用0.9％氯化钠保持润湿。将24G×3/4″静脉留置管用于穿透肾囊，并移除针头。然后在肾囊下推进导管至肾脏的远极。在小鼠的手术前准备期间，将用于移植的细胞在1.5mL离心管中离心，并移除大部分上清液，留下足够的培养基以收集细胞沉淀物。将细胞收集进RaininPos-D容积式移液枪头，并倒置该移液枪以让细胞通过重力沉降。弃去过量的培养基，留下用于移植的压紧细胞制剂。为了移植，将Pos-D移液枪头牢固置于导管的针座中，并将细胞从移液器通过肾囊下的导管分配，用以递送至肾脏的远极。将导管的内腔用少量的培养基冲洗以递送任何其余的细胞，抽回导管。通过低温烧灼而封闭肾囊，并且使肾回复至其原始解剖位置。通过用5-0VICRYL缝合线连续缝合来闭合肌肉，并且用缝合夹闭合皮肤。使小鼠脱离麻醉并让其完全恢复。在手术后给小鼠皮下施予1.0mg.kgMetacam。

在移植之后，每周称重小鼠一次，并且每周测量两次血糖。在移植之后的多个时间间隔，给小鼠腹膜内施予3g/kg葡萄糖，并在注射葡萄糖后60分钟经由眶后窦抽取血液进装有少量肝素的离心管中。离心血液，将血浆置于第二离心管中，在干冰上冷冻，用以在-80℃下保存直至进行人C肽测定。根据制造商的说明书，用Mercodia/ALPCO诊断超敏C肽ELISA来确定人C肽水平。

在图23中示出了移植有来自各处理组每一者的细胞的小鼠的人C肽ELISA结果。对于接受了来自任何处理组的细胞的任何小鼠，在移植后四周没有检测到循环人C肽。在移植后8周，在如下小鼠中发现可检测的C肽：两只接受了用激活素A和Wnt3a处理过的细胞的小鼠中的其中一只；三只接受了用GDF-8和化合物40处理过的细胞的小鼠中的其中一只；以及三只接受了用GDF-8和化合物202处理过的细胞的小鼠中的其中两只。这些结果表明，相当的内分泌前体细胞群体可衍生自使用GDF-8和小分子的分化方案并且细胞进一步在体内成熟为葡萄糖响应性的胰岛素分泌细胞。

实例19

使用GDF-8形成的表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞能够在移植到啮齿动物内后释放C肽

证明在没有激活素A的情况下使用GDF-8分化的细胞也可在啮鼠动物移植模型中体内进一步分化为能够分泌人C肽的内分泌细胞群是重要的。

细胞的准备：将H1人胚胎干细胞簇在低生长因子MATRIGELTM(Invitrogen；目录号356231)包被的组织培养塑料上培养，平均每四天进行传代。补充有8ng/mL bFGF的MEF调理培养基用于初始接种和扩增。将所有人胚胎干细胞系以小于50的传代数进行维持，并例行评估核型是否正常和支原体污染是否存在。

传代通过这样进行：使细胞培养物在37℃下暴露于1mg/ml分散酶(Invitrogen，目录号：17105-041)的溶液5至7分钟，然后用MEF调理培养基冲洗该细胞单层并小心刮擦以回收细胞簇。将细胞簇在MEF调理培养基中低速离心，以除去残余分散酶，然后均匀地再悬浮于补充有8ng/mlbFGF(PeproTech Inc.；目录号100-18B)的MEF调理培养基中，用以使用2.5ml/孔的体积以1∶3的比率接种在低生长因子MATRIGELTM(BDBiosciences；目录号356231)包被的6孔板(Nunc；目录号140685)上。日常饲养是通过从每个孔抽吸掉废培养基并用等体积的新鲜培养基替换来进行。在整个培养期间，将板维持在37℃、5％CO2下。

细胞分化：分化过程在将细胞接种进6孔板之后三天开始。将一分四步的方案用于使H1人胚胎干细胞体外分化为表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。步骤1进行三天以产生表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。在步骤1的第一天，通过抽吸掉废培养基并添加等体积的具有2％牛血清白蛋白第V组分、无脂肪酸(FAF BSA)(Proliant Biologicals；目录号SKU68700)和8ng/ml bFGF的RPMI-1640基础培养基(Invitrogen；目录号22400)开始分化。在一个处理组中，用100ng/ml GDF-8(R&D Systems；目录号788-G8)和20ng/ml Wnt3a(R&D Systems；目录号1324-WN/CF)处理两个重复细胞组。在第二处理组中，用100ng/ml GDF-8和2.5mM化合物40处理两个重复细胞组。在分化步骤1的第二天和第三天，用含有2％FAF BSA、8ng/ml bFGF和100ng/ml GDF-8但没有添加Wnt3a或化合物40的RPMI-1640饲养所有处理组中的细胞。在培养的第三天结束时，收集各处理组的一孔用于FACS分析。

用三天进行该分化方案的步骤2。所有处理组的细胞每天用补充有2％FA BSA和50ng/ml FGF7(PeproTech；目录号100-19)的DMEM:F12(Invitrogen；目录号11330-032)饲养。

用四天进行该分化方案的步骤3。所有处理组的细胞每天用补充有1％B27(Invitrogen；目录号：17504-044)、50ng/ml FGF7、100ng/ml成头蛋白(R&D Systems；目录号3344-NG)、250nM KAAD-环巴胺(Calbiochem；目录号239804)和2μM全反式视黄酸(RA)(Sigma-Aldrich；目录号R2625)的高葡萄糖DMEM(Invitrogen；目录号10569)饲养。

用三天进行该分化方案的步骤4。在前两天期间每天用补充有1％B27、100ng/ml成头蛋白、1mM ALK5抑制剂(Axxora；目录号ALX-270-445)和100ng/ml GDF-8(R&D Systems；目录号788-G8)的高葡萄糖DMEM饲养所有处理组的细胞。在步骤4的第三天，使用20μl枪头(Rainin；目录号RT-L10F)和细胞刮棒(Corning；目录号3008)从6孔板收获细胞，然后将其转移至50μl管。让细胞通过重力沉淀，在不扰动细胞沉淀物的情况下抽吸上清液。将细胞再悬浮于补充有1％B27、100ng/ml成头蛋白和1μM ALK5抑制剂的高葡萄糖DMEM中，然后在六孔Costar超低吸附微板(Corning Inc.，目录号3471)中过夜培养。次日，收集悬浮培养物中的细胞并计数。将10×106个细胞/小鼠的等分试样用于移植。收集0.5×106个细胞的等分试样用于RT-PCR分析。

图24示出了在各处理组每一者的步骤1结束时产生的定形内胚层细胞的流式细胞计数结果。用GDF-8和Wnt3a处理或用GDF-8和化合物40处理的结果在步骤1结束时表达类似水平的CXCR4，从而表明了各处理组引起相当的且强的定形内胚层细胞群体。重复处理组相当一致。在分化方案的步骤4结束时移植前的RT-PCR分析的结果在图24B中示出。使用GDF-8和Wnt3a或GDF-8和化合物40向胰腺内胚层(PE)分化的细胞表达相当水平的胰腺内胚层谱系特征性标志物，例如：CDX2、MafA、Ngn3、NKX6.1、Pdx-1和Ptf1A。这些结果说明，利用GDF-8和Wnt3a或GDF-8和本发明化合物的分化方案在产生胰腺内胚层前体细胞群体方面是有效的。该分化方案在两种独立但相同的处理组中进行。重复处理组的结果相当一致，如通过RT-PCR分析所示。

人胚胎干细胞移植进小鼠：五至六周龄雄性scid-beige小鼠(C.B-Igh-1b/GbmsTac-Prkdcscid-Lystbg N7)从Taconic Farms购得。将小鼠圈养在微隔离笼(microisolator cage)中，自由获得无菌食物和水。在手术准备过程中，小鼠通过耳部加标签来辨别，测量其体重，并使用手持血糖测计仪(LifeScan；One Touch)来确定其血糖。在手术当天，用异氟烷和氧气的混合物麻醉小鼠，并且用小型动物剪毛刀刮剃手术部位。在手术前小鼠皮下施予0.1mg kgBuprenex。通过用70％异丙醇、10％聚维酮-碘和70％异丙醇连续洗涤来准备手术部位，并产生穿透皮肤和肌肉层的左侧切口。使左肾暴露于外并用0.9％氯化钠保持润湿。将24G×3/4″静脉留置管用于穿透肾囊，并移除针头。然后在肾囊下推进导管至肾脏的远极。在小鼠的手术前准备期间，将用于移植的细胞在1.5mL离心管中离心，并移除大部分上清液，留下足够的培养基以收集细胞沉淀物。将细胞收集进Rainin Pos-D容积式移液枪头，并倒置该移液枪以让细胞通过重力沉降。弃去过量的培养基，留下用于移植的压紧细胞制剂。为了移植，将Pos-D移液枪头牢固置于导管的针座中，并将细胞从移液器通过肾囊下的导管分配，用以递送至肾脏的远极。将导管的内腔用少量的培养基冲洗以递送任何其余的细胞，抽回导管。通过低温烧灼而封闭肾囊，并且使肾回复至其原始解剖位置。通过用5-0vicryl缝合线连续缝合来闭合肌肉，并且用缝合夹闭合皮肤。使小鼠脱离麻醉并让其完全恢复。在手术后给小鼠皮下施予1.0mg.kg Metacam。

在移植之后，每周称重小鼠一次，并且每周测量两次血糖。在移植之后的多个时间间隔，给小鼠腹膜内施予3g/kg葡萄糖，并在注射葡萄糖后60分钟经由眶后窦抽取血液进装有少量肝素的离心管中。离心血液，将血浆置于第二离心管中，在干冰上冷冻，用以在-80℃下保存直至进行人C肽测定。根据制造商的说明书，用Mercodia/ALPCO诊断超敏C肽ELISA来确定人C肽水平。移植有来自各处理组每一者的细胞的小鼠的人C肽ELISA结果在图29C和图29D中示出。对于各处理类别在移植后8周可检测到类似水平的人C肽，表明相当的内分泌前体细胞群体可衍生自使用GDF-8和Wnt3a或GDF-8和本发明化合物的分化方案。

实例20

CDK、GSK3和TRK抑制剂使人胚胎干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的潜力的评价

对已知对CDK、GSK3和/或TRK信号转导通路具有特异性的一亚组14种专利小分子进行评价，以评价其使人胚胎干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的潜力。

细胞测定接种：简而言之，将H1人胚胎干细胞簇在低生长因子MatrigelTM(Invitrogen；目录号356231)包被的组织培养塑料上培养。细胞通过以下方式来传代：利用胶原酶(Invitrogen；目录号17104-019)处理并小心刮擦，洗涤以除去残余酶，并以1∶1(表面面积)的比例使用100μl/孔的体积在低生长因子MATRIGELTM(BD Biosciences；目录号356231)包被的96孔黑色板(Packard ViewPlates；PerkinElmer；目录号6005182)上均匀分散接种。让细胞贴附，然后在1至3天时间内恢复对数期生长，每天用补充有8ng/ml bFGF(R&D Systems；目录号233-FB)的MEF调理培养基饲养。在整个测定法期间，将板在加湿箱中维持在37℃、5％CO2下。

化合物和测定法的准备：使用表16所述的化合物进行筛选。另外，包括化合物34作为阳性对照，如前面实例中所证明了的。将化合物制备为96孔板形式的5mM母液供用，其溶于100％DMSO(Sigma；目录号D2650)中并保存于-80℃下。将库化合物在50mM HEPES(Invitrogen；目录号15630-080)、20％DMSO中进一步稀释至0.2mM的中间浓度并保存于4℃下。测试条件一式三份进行，在四天测试期间每隔一天供料。如下开始测定法：从每个孔抽吸掉培养基，然后在PBS(Invitrogen；目录号14190)中洗涤三次以除去残余的生长因子。在测定法的第一天，添加200μl/孔的测试体积到各孔，该测试体积使用补充有0.5％FCS(HyClone；目录号SH30070.03)和100ng/ml GDF-8(R&D Systems，目录号788-G8)加2.5μM化合物的DMEM:F12基础培养基(Invitrogen；目录号11330-032)。平行组的测试样品以相同方式处理，但将GDF-8从培养基省去。在测定法的第三天，添加100μl/孔的测试体积到各孔，其使用补充有2％FCS加100ng/mlGDF-8(R&D Systems，目录号788-G8)的DMEM:F12基础培养基。从在测定法的第一天未用GDF-8处理的测试样品中省去GDF-8。阳性对照样品含有相同的基础培养基，其在整个四天的测定期间补充有FCS和100ng/ml重组人激活素A(PeproTech；目录号120-14)并且在第1天和第2天添加了Wnt3a(20ng/ml)。阴性对照样品含有补充有FCS的DMEM:F12基础培养基。

高内涵分析：在四天的培养结束时，将测试平板用PBS(Invitrogen；目录号14190)洗涤两次，用4％多聚甲醛(Alexis Biochemical；目录号ALX-350-011)在室温下固定20分钟，然后用PBS洗涤三次并用0.5％Triton X-100(Sigma；目录号T8760-2)在室温下透化处理20分钟。将细胞再用PBS洗涤三次，然后用4％鸡血清(Invitrogen；目录号16110082)在PBS中于室温下封闭30分钟。将一抗(山羊抗人SOX17；R&D Systems；目录号AF1924)在4％鸡血清中以1∶100稀释，在室温下加至每个孔保持一小时。将Alexa Fluor 488缀合的二抗(鸡抗山羊IgG；Molecular Probes；目录号AZ1467)在PBS中以1∶200稀释，并在用PBS洗涤三次后加至每个样品孔。为了对细胞核进行复染，在室温下加入4μg/mlHoechst 33342(Invitrogen；目录号H3570)保持十分钟。将板用PBS洗涤一次，并保留在100μl/孔PBS中以进行成像。

用IN Cell Analyzer 1000细胞分析仪(GE Healthcare)进行成像，对于用Hoechst 33342和Alexa Fluor 488染色的细胞采用51008bs二向分色镜。根据阳性对照孔并根据单独用二抗染色的无处理阴性对照孔来优化曝光时间。每孔获取15个视野的图像，以补偿生物鉴定和后续染色程序中的任何细胞损失。用IN Cell Developer Toolbox 1.7(GE Healthcare)软件从每个孔获得总细胞数目和总SOX17强度的测量值。基于灰阶水平(基线范围100-300)和核大小确定细胞核的分裂情况。计算每个重复数据集的平均值和标准偏差。总SOX17蛋白表达记录为总强度或累积强度，该强度定义为细胞总荧光乘以细胞面积。基于灰阶范围在200至3500之间的接受标准来去除背景。收集来自三重复孔的平均数据。计算处理孔相对于阳性对照的百分比。

该筛选的结果在表17中示出。在四天分化过程期间在没有GDF-8的情况下，小分子都未诱导显著的SOX17表达。化合物34用作实验对照并在存在GDF-8的情况下诱导了显著的SOX17表达，其相当于使用激活素A和Wnt3a的阳性对照所观察到的水平。在该实例中测试的其余的本发明化合物显示出弱的至中等的SOX17表达诱导的活性范围。值得注意的是，观察到该化合物子集的分化活性与所有三种酶信号通路的选择相关，使得难以最终确定明确的作用机理。

实例21

对能够介导表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的形成的本发明化合物的类似物的筛选

基于本发明化合物的结构进行了类似物搜索，并发现了118种类似物。初始筛选确定，一些类似物能够在没有激活素A的情况下与其他生长因子相结合来诱导定形内胚层分化。确定这些类似物是否也可以仅与GDF-8相结合来诱导定形内胚层分化是重要的。

细胞测定接种：简而言之，将H1人胚胎干细胞簇在低生长因子MatrigelTM(Invitrogen；目录号356231)包被的组织培养塑料上培养。细胞通过以下方式来传代：利用胶原酶(Invitrogen；目录号17104-019)处理并小心刮擦，洗涤以除去残余酶，并以1∶1(表面面积)的比例使用100μl/孔的体积在低生长因子MATRIGELTM(BD Biosciences；目录号356231)包被的96孔黑色板(Packard ViewPlates；PerkinElmer；目录号6005182)上均匀分散接种。让细胞贴附，然后在1至3天时间内恢复对数期生长，每天用补充有8ng/ml bFGF(R&D Systems；目录号233-FB)的MEF调理培养基饲养。在整个测定法期间，将板在加湿箱中维持在37℃、5％CO2下。

化合物和测定法的准备：使用类似化合物库进行筛选。此库的化合物制备为96孔板形式的5mM母液供用，其溶于100％DMSO(Sigma；目录号D2650)并保存于-80℃下。将库化合物在50mM HEPES(Invitrogen；目录号15630-080)、20％DMSO中进一步稀释至0.2mM的中间浓度并保存于4℃下。测试条件一式三份进行，在四天测试期间每隔一天供料。如下开始测定法：从每个孔抽吸掉培养基，然后在PBS(Invitrogen；目录号14190)中洗涤三次以除去残余的生长因子。在测定法的第一天，添加200ml/孔的测试体积到各孔，该测试体积使用补充有0.5％FCS(HyClone；目录号SH30070.03)和200ng/ml GDF-8(R&D Systems，目录号788-G8)加2.5μM化合物的DMEM:F12基础培养基(Invitrogen；目录号11330-032)。在测定法的第三天，添加100μl/孔的测试体积到各孔，其使用补充有2％FCS加200ng/ml GDF-8(R&D Systems，目录号788-G8)的DMEM:F12基础培养基。阳性对照样品含有相同的基础培养基，在整个四天测定期间补充有FCS和100ng/ml重组人激活素A(PeproTech；目录号120-14)并且在第1天和第2天添加Wnt3a(20ng/ml)。阴性对照样品含有补充有FCS的DMEM:F12基础培养基，在第1天和第2天添加Wnt3a，但省去用激活素A处理。

高内涵分析：在四天的培养结束时，将测试平板用PBS(Invitrogen；目录号14190)洗涤两次，用4％多聚甲醛(Alexis Biochemical；目录号ALX-350-011)在室温下固定20分钟，然后用PBS洗涤三次并用0.5％Triton X-100(Sigma；目录号T8760-2)在室温下透化处理20分钟。将细胞再用PBS洗涤三次，然后用4％鸡血清(Invitrogen；目录号16110082)在PBS中于室温下封闭30分钟。将一抗(山羊抗人SOX17；R&D Systems；目录号AF1924)在4％鸡血清中以1∶100稀释，在室温下加至每个孔保持一小时。将Alexa Fluor 488缀合的二抗(鸡抗山羊IgG；Molecular Probes；目录号AZ1467)在PBS中以1∶200稀释，并在用PBS洗涤三次后加至每个样品孔。为了对细胞核进行复染，在室温下加入4μg/mlHoechst 33342(Invitrogen；目录号H3570)保持十分钟。将板用PBS洗涤一次，并保留在100μl/孔PBS中以进行成像。

用IN Cell Analyzer 1000细胞分析仪(GE Healthcare)进行成像，对于用Hoechst 33342和Alexa Fluor 488染色的细胞采用51008bs二向分色镜。根据阳性对照孔并根据单独用二抗染色的无处理阴性对照孔来优化曝光时间。每孔获取15个视野的图像，以补偿生物鉴定和后续染色程序中的任何细胞损失。用IN Cell Developer Toolbox 1.7(GE Healthcare)软件从每个孔获得总细胞数目和总SOX17强度的测量值。基于灰阶水平(基线范围100-300)和核大小确定细胞核的分裂情况。计算每个重复数据集的平均值和标准偏差。总Sox17蛋白表达记述为总强度或累积强度，该强度定义为细胞总荧光乘以细胞面积。基于灰阶范围在200至3500之间的接受标准来去除背景。通过将每个孔的总强度除以阳性对照的平均总强度，将总强度数据进行归一化。对于每个重复组，对归一化的数据计算平均值和标准偏差。

在该单实验中的四块测定板的筛选结果在表18中示出。就作为采用激活素A和Wnt3a的阳性对照处理的百分比的SOX17表达对化合物进行排序。该测定法鉴别了12种新的类似命中物，如表19所示。

实例22

根据本发明的方法生长在微载体上的人胚胎干细胞可分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞

为了在可放大的条件下分化并产生大量内分泌细胞的目的，显示人胚胎干细胞可使用本发明的方法在微载体珠上生长并分化为定形内胚层是重要的。

用于测定和分化的细胞的准备：将H1 p49C3细胞根据美国专利申请No.61/116,447所述的方法在125ml转瓶中的Cytodex3珠(GE HealthcareLife Sciences，NJ)上例行培养。在七天后，将细胞和小珠以30cm2珠表面积每孔的比率转移至6孔板(供应商；目录号XXX)，并将板置于摇床上。阳性对照处理孔(标为AA/Wnt3a)中小珠上的细胞通过这样进行分化：在具有2％无脂肪酸BSA(MP Biomedicals，Inc；目录号152401)的RPMI-1640(Invitrogen；目录号：22400)中添加100ng/ml激活素A(PeproTech；目录号120-14)和20ng/ml Wnt3a(R&D Systems；目录号1324-WN/CF)分化两天，然后添加100ng/ml激活素A和8ng/ml bFGF(PeproTech Inc.；目录号：100-18B)分化一天，每孔使用2ml体积的该培养基。化合物34以2.5μM的最终浓度在没有任何生长因子处理的情况下添加到阴性对照处理孔(标为仅CMP)中的具有2％无脂肪酸BSA的RPMI-1640(2ml/孔)中三天。第三处理孔(标为CMP+8)接受具有2％无脂肪酸BSA的RPMI-1640(2ml/孔)中的2.5μM的化合物34加50ng/ml GDF-8(R&D Systems，目录号788-G8)三天。第四处理孔(标为CMP+8+D)接受具有2％无脂肪酸BSA的RPMI-1640(2ml/孔)中的2.5μM的化合物34与50ng/ml GDF-8和50ng/ml PDGF-D三天。第五处理孔(标为CMP+8+D+V)接受具有2％无脂肪酸BSA的RPMI-1640(2ml/孔)中的2.5μM的化合物34与50ng/mlGDF-8、50ng/ml PDGF-D和50ng/ml VEGF三天。第六处理孔(标为CMP+8+D+V+M)接受具有2％无脂肪酸BSA的RPMI-1640(2ml/孔)中的2.5μM的化合物34与50ng/ml GDF-8、50ng/ml PDGF-D、50ng/ml VEGF和20ng/ml蝇蕈醇三天。每天更换所有培养基和处理。

在处理和培养结束时，根据美国专利申请No.61/116,447所述的方法从小珠收获细胞。根据上述方法通过流式细胞计量术对所收获的细胞进行计数和分析。

结果在图25中示出。如分图A所示，对所有经历分化的处理组的回收了类似数量的细胞。如分图B所示，单独用化合物34处理的细胞没有分化为CXCR4阳性细胞。在分化期间添加激活素A和Wnt3a的阳性对照处理在68％的所得细胞群中诱导了CXCR4的表达。添加有多种生长因子组合的化合物34平均在50％的细胞中诱导了CXCR4表达。应当注意的是，在使用化合物34结合单种生长因子GDF-8或结合包括GDF-8在内的多种生长因子的处理期间观察到相当水平的CXCR4表达。这证明，化合物34与至少GDF-8相结合可替代激活素A和Wnt3a来促进定形内胚层分化。该实例还显示，该处理过程对在微载体珠上生长并分化的细胞是有效的。

实例23

本发明的化合物与GDF-8一起可增强细胞增殖

先前的实例显示，GDF-8能够替代激活素A来使人胚胎干细胞向表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化。了解GDF-8和激活素A在定形内胚层形成方面的相对效力是重要的。使用当量浓度的各生长因子来进行剂量响应测定法，以比较人胚胎干细胞分化期间的结果。

对在定形内胚层分化期间与GDF-8结合使用的本发明化合物就其诱导细胞增殖的能力进行了评价。将结果与单独使用激活A或GDF-8的处理进行比较。

用于测定法的细胞准备：将人胚胎干细胞(H1人胚胎干细胞系)的母培养物以未分化、多能状态维持在MEF调理培养基中的低生长因子MATRIGELTM(BD Biosciences；目录号356231)包被的平皿上，平均每四天传代。传代通过这样进行：使细胞培养物在37℃下暴露于1mg/ml分散酶(Invitrogen，目录号：17105-041)的溶液5至7分钟，然后用MEF调理培养基冲洗该单层并小心刮擦以回收细胞簇。将细胞簇低速离心以收集细胞沉淀并除去残余的分散酶。将细胞簇以1∶3或1∶4的比例分传以进行例行维持培养，或者以1∶1比例分传以立即进行测试。将所有的人胚胎干细胞系以小于50次传代的传代数目进行维持，并例行评估核型表型是否正常和支原体污染是否存在。

将用于该测定法的细胞簇均匀地再悬浮于补充有8ng/ml bFGF的MEF调理培养基中，并以100ml/孔的体积接种至低生长因子MATRIGELTM包被的96孔Packard VIEWPLATES(PerkinElmer；目录号6005182)上。补充有8ng/mL bFGF的MEF调理培养基用于初始接种和扩增。日常饲养是通过从每个孔抽吸掉废培养基并用等体积的新鲜培养基替换来进行。各测试板中的背景组的孔未用细胞接种，但在整个测定期间用基础培养基条件处理。在整个测定法期间，将板在加湿箱中维持在37℃、5％CO2下。

测定法：如下开始该测定法：从每个孔抽吸掉培养基，并重新添加测试培养基的最后等分试样(100μl)。测试条件在总共三天的测定期间重复进行三次，通过从各孔抽吸培养基并用新鲜测试培养基替换该培养基来饲养。同时平行设定相同的测定用于在24、48和72小时结束时进行评价。

在测定法的第一天，所有装有细胞的孔均接受等分量(80μl)的RPMI-1640培养基(Invitrogen；目录号：22400)，所述RPMI-1640培养基补充有2.5％牛血清白蛋白第V组分、无脂肪酸(FAF)BSA，在最终测定中为2％)(Prohant Inc.，目录号：SKU 68700)。制备5x浓度的多种对照样品和测试样品以用于添加至合适的孔(20μl/孔)。对照条件包括具有如所示最终生长因子浓度的下列各项：1)基础培养基与2％FAF BSA；2)100ng/ml激活素A(PeproTech；目录号120-14)与8ng/ml bFGF(PeproTech；目录号100-18B)；3)100ng/ml激活素A与8ng/ml bFGF和20ng/ml Wnt3a(R&DSystems；目录号1324-WN/CF)；4)100ng/ml GDF-8(R&D Systems，目录号788-G8)与8ng/ml bFGF；5)GDF-8与8ng/ml bFGF和20ng/mlWnt3a。在整个测定法期间用MEF调理培养基处理另外一组对照孔中的细胞。在一些使用GDF-8的对照样品中，用本发明的化合物替换Wnt3a。对于实验测试样品，将八种不同的化合物进行两倍系列稀释，以产生三种不同剂量浓度，然后与100ng/ml GDF-8和8ng/ml bFGF组合。这些小分子包括专利化合物即化合物181、化合物180、化合物19、化合物202、化合物40、化合物34、化合物56和市售的GSK3抑制剂BIO(EMD Chemicals，Inc.；目录号361550)。在测定法的第二天和第三天，对所有用于对照样品和实验样品的孔进行抽吸并再次用相同的处理条件来饲养，不同的是从一些对照孔除去Wnt3a。

MTS测定法：在24、48或72小时培养结束时，将一组测定板遵照制造商的说明书进行MTS测定(Promega；目录号G3581)。简而言之，将20μl MTS添加至各孔，并将测定板在37℃、5％CO2下孵育四小时，然后获取OD490读数。从统计测量值减去背景(即，没有细胞的处理孔)，以确定各三次重复的处理组的平均值和平均值的标准误差。

MTS测定法是对将四唑鎓化合物酶促还原为甲臜产物的细胞代谢活性的测量。在单一时点，MTS测定法可用作细胞活力的比较指标。在连续时点平行评价的MTS测定可提供另外的关于细胞代谢活性增加的信息，所述活性继而可与各处理条件的细胞增殖相关联。图26分图A示出了在三天测定期间所有对照处理的OD490读数。用调理培养基处理的细胞显示三天内OD490的改变极小，从而表明该处理组中的细胞数保持稳定。相比之下，在没有生长因子的基础培养基中培养的细胞(无处理)显示出与细胞数随时间推移而损失相关联的OD490的持续下降。在分化过程期间使用和不使用Wnt3a的激活素A处理显示出OD490的递增增加，表明细胞群体随时间推移而显著扩增。相对于激活素A处理，在没有Wnt3a情况下GDF-8处理引起OD490降低；这在第一天是显著的，并在整个培养的全部三天得以维持。将Wnt3a添加至GDF-8处理组导致到培养的第三天OD490恢复和增加。

图26分图B至图26分图I示出了用小分子抑制剂结合GDF-8处理的MTS测定法结果。使用本发明化合物和GDF-8的处理获得的OD490读数等于或超过使用激活素A的处理的结果。在所有情况下，相对于单独用GDF-8处理，最佳浓度的各小分子结合GDF-8导致在三天测定期间引起的OD490读数提供。这表明，本发明化合物对在定形内胚层分化期间诱导细胞群增殖和扩增是重要的。

实例24

根据本发明的方法生长在微载体上的人胚胎干细胞可分化为内分泌祖细胞

为了在工业条件下分化和产生大量内分泌细胞的目的，显示人胚胎干细胞可以使用没有激活素A的方案在微载体珠上生长并分化为内分泌祖细胞是重要的。

用于测定法和分化的细胞的准备：将H1 p45细胞在置于以约每10秒钟1转的摇床(ari Mix，Thermo Scientific，目录号M79735)上的6孔超低附着板(Costar；目录号3471)中的Cytodex3珠(GE Healthcare；目录号17-0485-01)上培养。每天更换MEF调理培养基持续六天。然后将培养基换为下列处理以开始内胚层分化。阳性对照处理孔(标为AA+Wnt)中小珠上的细胞通过这样进行分化：在具有2％无脂肪酸BSA(Proliant Biomedicals，Inc；SKU号68700)的RPMI-1640(Invitrogen；目录号：22400)中添加100ng/ml激活素A(PeproTech；目录号120-14)、8ng/ml bFGF(PeproTechInc.；目录号：100-18B)和20ng/ml Wnt3a(R&D Systems；目录号1324-WN/CF)分化一天，然后添加100ng/ml激活素A和8ng/ml bFGF(PeproTech Inc.；目录号：100-18B)分化两天，每孔使用2ml体积的该培养基。第二处理孔(标为GDF-8+MCX)接受一天的在具有2％无脂肪酸BSA的RPMI-1640培养基(2ml/孔)中的2.5μM化合物202加200ng/mlGDF-8(R&D Systems，目录号788-G8)和8ng/ml bFGF，然后接受两天的200ng/ml GDF-8和8ng/ml bFGF。第三处理孔(标为GDF-8+Wnt)接受一天的在具有2％无脂肪酸BSA的RPMI-1640培养基(2ml/孔)中的200ng/mlGDF-8与20ng/ml Wnt3a和8ng/ml bFGF，然后接受两天的200ng/ml GDF-8和8ng/ml bFGF。每天更换所有培养基和处理。

在处理和培养结束时，收获细胞并计数，以确定细胞回收率和进行流式细胞检测分析。在全部三种处理方案(图27A)之后观察到高水平的CXCR4和CD99。样品间的细胞数不同(图27B)。在用GDF-8处理的样品中在定形内胚层和第四阶段观察到比其他处理组更少的细胞数。这表明本发明化合物可以在分化期间增加细胞的增殖。

在阶段3结束时，细胞中表达了内胚层基因PDX1、HNF4α和CDX2(图27C、D)。在分化的阶段一期间用GDF-8和本发明化合物处理细胞导致Pdx1表达比对照分化处理更好。在阶段4结束时，内胚层基因得以进一步上调(图27E、F)。这些结果可得出结论，GDF-8加化合物202可替代激活素A和Wnt3a用于定形内胚层分化，从而形成胰腺内胚层。

藉此将整篇文档中引用的出版物全文以引用方式并入本文。尽管上文已结合实例和优选实施例描述了本发明的各个方面，但应当理解本发明的范围不受上述具体实施方式的限定，而受以下在专利法原则下正确解释的权利要求书的限定。

表11 归一化的SOX17强度激活素A GDF8 ng/ml 平均值标准偏差平均值标准偏差 1600 100.00 9.20 100.00 9.00 800 100.00 6.60 84.90 6.30 400 100.00 3.30 72.20 7.50 200 100.00 1.90 51.30 5.30 100 90.70 8.70 32.70 5.10 50 85.20 4.70 17.60 4.80 25 73.10 2.80 5.10 3.60 12.50 50.90 6.20 0.90 0.80 6.25 18.40 4.80 0.70 1.40 3.13 3.00 1.90 0.10 0.20 1.56 0.10 0.00 0.00 0.20 0.00 0.00 0.20 0.30 0.30

表16 化合物编号主要选择性化合物6 GSK选择性化合物7 GSK选择性化合物8 GSK选择性化合物9 CDK选择性化合物57 Trk选择性化合物41 GSK选择性化合物42 CDK选择性化合物10 CDK选择性化合物34 阳性对照化合物11 CDK选择性化合物43 Trk选择性化合物44 GSK选择性化合物12 CDK选择性化合物45 Trk选择性