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1、(10)授权公告号 CN 102168108 B (45)授权公告日 2013.04.24 CN 102168108 B *CN102168108B* (21)申请号 201010594470.7 (22)申请日 2010.12.17 CCTCC NO ： M 2010256 2010.09.29 C12N 1/00(2006.01) C12P 1/02(2006.01) A01N 63/04(2006.01) A01G 1/04(2006.01) (73)专利权人 广东省微生物研究所 地址 510070 广东省广州市先烈中路 100 号 (72)发明人 李冬利 李义勇 陈玉婵 章卫民 王磊 。
2、(74)专利代理机构 广州科粤专利商标代理有限 公司 44001 代理人 余炳和 CN 1075067 A,1993.08.11, 全文 . CN 1197843 A,1998.11.04, 全文 . CN 1961894 A,2007.05.16, 全文 . CN 1259570 A,2000.07.12, 全文 . (54) 发明名称 一种深红虫草及利用其制备卵孢菌素的方法 和其用途 (57) 摘要 本发明公开了一种深红虫草及利用其制备卵 孢菌素的方法和其用途。深红虫草 (Cordyceps cardinalis)C033，于 2010 年 9 月 29 日 保 藏 于中国典型培养物保藏中。
3、心 (CCTCC)， 地址 ： 中 国 . 武汉 . 武汉大学， 保藏编号为 ： CCTCC NO ： M 2010256。 从该虫草菌的发酵培养物中能制备出卵 孢菌素。 该制备方法具有培养条件温和、 培养基配 置简单易行、 发酵时间短、 提取步骤简单、 使用有 机溶剂少、 产物得率高等优点， 能够比较方便解决 研究或应用卵孢菌素所需的原料问题。该虫草菌 还能够作为生物防治剂的活性成份， 为研究和开 发新的生物防治剂提供了候选菌种。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 朱镜羲 权利要求书 1 页 说明书 6 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)。
4、发明专利 权利要求书1页 说明书6页 (10)授权公告号 CN 102168108 B CN 102168108 B *CN102168108B* 1/1 页 2 1. 深红虫草 （Cordyceps cardinalis） C033， 保藏编号为 ： CCTCC NO ： M 2010256。 2. 一种制备卵孢菌素的方法， 其特征在于， 卵孢菌素是从权利要求 1 所述的深红虫草 （Cordyceps cardinalis） C033 的发酵培养物中分离制备得到的， 包括以下步骤 ： （1） 制备深红虫草 （Cordyceps cardinalis） C033 的发酵培养物 ； （2） 将发。
5、酵培养物的发酵液和菌丝体分离， 取发酵液， 向发酵液中加入不与水混溶的有 机溶剂萃取， 获得萃取液 ； （3） 向萃取液中加入碱性水溶液进行反萃取， 得到反萃取液 ； （4） 向反萃取液中加入酸性溶液至析出沉淀， 分离出沉淀， 得到卵孢菌素粗品 ； （5） 用碱性水溶液溶解粗品， 再加入酸性溶液至析出沉淀， 分离出沉淀 ； （6） 重复步骤 （5） 数次， 以去除杂质， 收集沉淀， 用蒸馏水洗涤， 干燥后即得卵孢菌素纯 品 ； 所述的步骤 （1） 制备深红虫草 （Cordyceps cardinalis） C033 的发酵培养物包括以下 步骤 ： 挑取深红虫草 （Cordyceps cardi。
6、nalis） C033 的菌丝接种于种子培养基中， 在 26、 120r/min 条件下培养 3 天， 获得种子液， 再将种子液以 10% 的接种量接种到发酵培养基中， 在 26、 120r/min 条件下培养 7 天， 获得深红虫草 （Cordyceps cardinalis） C033 的发酵培 养物， 所述的种子培养基和发酵培养基配方相同， 其配方按总质量分数 100% 计， 包含葡萄 糖 5%， 蛋白胨 1%， KNO30.2%， MgSO40.2%， CaCl20.01%， (NH4)3PO43H2O 0.02%， 余量为水。 3. 根据权利要求 2 所述的制备卵孢菌素的方法， 其特。
7、征在于， 所述的不与水混溶的有 机溶剂为氯仿或乙酸乙酯或其混合物。 4. 根据权利要求 2 所述的制备卵孢菌素的方法， 其特征在于， 所述的步骤 （3） 和步骤 （5） 的碱性水溶液为 1mol/L 的氢氧化钠溶液。 5. 根据权利要求 2 所述的制备卵孢菌素的方法， 其特征在于， 所述的步骤 （4） 和步骤 （5） 的酸性溶液为浓盐酸。 6.权利要求1所述的深红虫草 （Cordyceps cardinalis） C033作为生物防治剂的应用。 7. 一种生物防治剂， 其特征在于， 包含权利要求 1 所述的深红虫草 （Cordyceps cardinalis） C033 作为活性成份。 权 利。
8、 要 求 书 CN 102168108 B 1/6 页 3 一种深红虫草及利用其制备卵孢菌素的方法和其用途 技术领域 ： 0001 本发明涉及生物医药技术领域， 具体而言， 涉及一株虫草属菌株 - 深红虫草 (Cordycepscardinalis)C033 及利用该菌株发酵制备真菌毒素卵孢菌素 (oosporein) 的方 法。本发明还涉及上述深红虫草 C033 作为生物防治剂的应用和作为生物防治剂的活性成 份。 背景技术 ： 0002 生物防治是指利用有益生物及其代谢产物和基因产品等控制有害生物的方法。 生 物防治具有许多优于化学防治的特点， 如对人畜安全， 不污染环境， 不会 ( 或较少。
9、 ) 产生抗 性， 以及由于仅杀伤或抑制防治对象， 因此， 能参与生态环境的调控， 保持生态平衡， 有利于 农业可持续发展， 提高经济效益、 社会效益和生态效益， 发展前景广阔。1971 年建立了生物 防治国际组织 (International Organization for Biological Control， IOBC)， 并在世界 各大区设立地区分部。 此后世界生物防治发展极为迅速， 在宏观决策上， 发达国家已将生物 防治技术作为缓解当今世界所面临的五大危机的战略决策之一。 0003 真菌杀虫剂、 真菌杀菌剂等新型生物农药在病虫害防治中也显示出良好的应用前 景。国际生防组织 (IOB。
10、C) 使用黄绿绿僵菌防治沙漠蝗虫， 美国引进舞毒蛾噬虫霉防治舞毒 蛾， 巴西使用金龟子绿僵菌防治甘薯沫蝉等， 均取得了显著效果。哈茨木霉 T39 已在以色 列、 希腊等国家登记， 主要用于防治灰霉病。 我国开展真菌生物农药制剂的研究开发已有30 多年的历史， 其中主要以研究球孢白僵菌 (Beaurevia bassiana) 为主。木霉菌剂也已开发 成功， 主要用于防治各种作物的霜霉病， 具有较为理想的效果和应用前景。 0004 本发明涉及的化合物卵孢菌素结构式如下式 (I) 所示 ： 0005 0006 式 (I) 0007 卵孢菌素是很多土壤真菌和虫生真菌都能产生的一种真菌毒素， 文献报道。
11、它 具有广泛的生物活性， 如抗细菌 The antibacterial activity of some naturally occurring2， 5-dihydroxy-1， 4-benzoquinones， Canadian Journal of Microbiology， 1984， 30， 1068-1072 ； Antimicrobial and respiration inhibitory activities of oosporein， Agricultural and BiologicalChemistry， 1984， 48， 1065-1067、 抗 植 物 病 原 真 。
12、菌 晚 疫 病 菌 Phytophthora infestansAntifungalActivity of Oosporein from an Antagonistic Fungus against Phytophthora infestans， Zeitschrift 说 明 书 CN 102168108 B 2/6 页 4 frNaturforschung， Section C， 2004， 59， 302-304、 抑制 I 型单纯疱疹病毒 DNA 聚合酶 Inhibition ofherpes simplex virus type 1 DNA polymerase by the nat。
13、ural product oosporein， The Journal ofAntibiotics， 1992， 45， 286-288、 抑制单胺氧化酶 (MAO) 等 一种白僵菌中 MAO 抑制剂的分离纯化和结构鉴定， 菌物学报， 2006， 25， 273-277， 还有文 献报道其为两种真菌杀虫剂产品之活性组分布氏白僵菌 Beauveria brongniartii 的唯 一主要次级代谢产物， 且这些农药对人类和动物无毒 Monitoring the distribution of secondary metabolites produced by the entomogenousfu。
14、ngus Beauveria brongniartii with particular reference to oosporein， Mycological Research， 2000， 104， 1227-1233。 0008 鉴于该化合物具有广泛的生物活性， 将其作为生物农药进行开发具有广阔的应用 前景， 因此其原料来源和产量具有深入研究的价值。 发明内容 ： 0009 本发明的第一个目的是提供一种深红虫草 (Cordyceps cardinalis)C033， 该菌于 2010 年 9 月 29 日保藏于中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)， 地址 ： 中国 . 武汉 . 武汉大学。
15、， 保藏编号为 ： CCTCC NO ： M 2010256。 0010 本发明的深红虫草 (Cordyceps cardinalis)C033 分离自湖南衡阳的鳞翅目幼虫 上。 0011 根据虫草的形态特征， 并参照文献 “The genus Cordyceps and its allies， Science Report of theTokyo Bunrika Daigaku(Sect B)， 1941， 84， 53-260 ； North American entomogenous species ofCordyceps，Mycologia， 1958， 50， 169-222 ； P。
16、hylogenetic classification of Cordyceps and theclavicipitaceous fungi， Studies in Mycology， 2007， 57， 5-59”中 虫 草 的 分 类 系 统 以 及 文 献 “Cordyceps cardinalis sp.nov.， a new species of Cordyceps with an east Asian-eastern NorthAmerican distribution， Mycologia， 2004， 96， 658-666” ， 该虫草鉴定为深红虫草 (Cordycepscar。
17、dinalis)。其形态特征如下 ： 0012 子座 7 根， 丛生， 肉质， 从寄主头部发出， 有的子座柄部连生， 长 2-2.5 厘米， 粗 1-2 毫米， 圆柱形， 橙红色， 近基部白色。可孕部膨大， 棒形至圆柱形， 长 0.5-1.2 厘米， 粗 1.5-2.5 毫米， 无不孕顶端， 与柄部分界不明显， 顶端钝圆。子囊壳半埋生至近表生， 密 集， 长卵形， 橙褐色， 355-473142-197 微米， 长宽比为 2.4 1-2.5 1。子囊圆柱形， 155-3883-6 微米， 内含 8 个子囊孢子 ； 子囊帽半球形至近球形， 透明， 33 微米。子囊孢 子线形， 具多个隔膜， 不断。
18、裂成次生子囊孢子。 0013 菌株 C033 的分离方法如下 ： 0014 将新鲜的采自湖南衡阳的鳞翅目幼虫上的虫草样品用自来水将标本表面的泥土 和杂质冲洗干净， 然后用体积分数为 70的酒精水溶液对虫草的虫体部位进行表面消毒， 从中间折断虫体， 露出致密的白色菌丝组织 ( 菌核 )， 用消过毒的微型医用手术刀和镊子挑 取菌核菌丝组织块置于 PDA 斜面试管中， 在 25条件下培养， 待组织块上长出菌丝后， 挑取 顶端菌丝置于 PDA 培养基上进行培养， 选择培养特征一致的菌株继续转接纯化， 最终获得 纯培养菌株 C033， 置于 4冰箱内保存备用。 说 明 书 CN 102168108 B 。
19、3/6 页 5 0015 菌株 C033 的形态特征如下 ： 0016 在 PDA 培养基上生长较慢， 气生菌丝不发达， 稀疏绒状， 贴生， 初期白色， 后变灰白 色至灰黄色， 菌落背面开始为红色， 后呈红黑色。瓶梗生于分生孢子梗中间或顶端， 单生或 2-4 个轮生， 透明， 瓶形， 基部膨大， 向上渐尖， 7.8-13.71.9-3.9 微米。分生孢子椭圆形至 短柱形， 两端钝圆， 无色， 2.9-6.82.0-2.9 微米。 0017 该菌株的形态特征与文献 “Cordyceps cardinalis sp.nov.， a new species of Cordyceps with ane。
20、ast Asian-eastern North American distribution， Mycologia， 2004， 96， 658-666”描述的基本一致。因此， 将该虫草菌株鉴定为深红虫草 (Cordyceps cardinalis)， 属于我国新纪录种， 命名为深红虫草 (Cordyceps cardinalis)C033， 于 2010 年 9 月 29 日保藏于中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)， 地址 ： 中国 . 武汉 . 武汉大学， 保藏 编号为 ： CCTCC NO ： M 2010256。 0018 由于到目前为止， 国内外均未有文献报道深红虫草(Cordyc。
21、eps cardinalis)能够 产生卵孢菌素。 0019 因此本发明的第二个目的是提供从本发明的深红虫草 (Cordyceps cardinalis) C033 的发酵培养物中制备真菌毒素卵孢菌素的方法。 0020 所述的从本发明的深红虫草 (Cordyceps cardinalis)C033 的发酵培养物中制备 真菌毒素卵孢菌素的方法， 优选通过以下步骤制备 ： 0021 (1) 制备深红虫草 (Cordyceps cardinalis)C033 的发酵培养物 ； 0022 (2) 将发酵培养物的发酵液和菌丝体分离， 取发酵液， 向发酵液中加入不与水混溶 的有机溶剂萃取， 获得萃取液 ；。
22、 0023 (3) 向萃取液中加入碱性水溶液进行反萃取， 得到反萃取液 ； 0024 (4) 向反萃取液中加入酸性溶液至析出沉淀， 分离出沉淀， 得到卵孢菌素粗品 ； 0025 (5) 用碱性水溶液溶解粗品， 再加入酸性溶液至析出沉淀， 分离出沉淀 ； 0026 (6) 重复步骤 (5) 数次， 以去除杂质， 收集沉淀， 用蒸馏水洗涤， 干燥后即得卵孢菌 素纯品。 0027 所述的不与水混溶的有机溶剂优选为氯仿或乙酸乙酯或其混合物。 0028 所述的步骤 (3) 和步骤 (5) 的碱性水溶液优选为 1mol/L 的氢氧化钠溶液。 0029 所述的步骤 (4) 和步骤 (5) 的酸性溶液优选为浓。
23、盐酸。 0030 所述的步骤 (1) 制备深红虫草 (Cordyceps cardinalis)C033 的发酵培养物优 选通过以下方法制备的 ： 挑取深红虫草 (Cordyceps cardinalis)C033 的菌丝接种于种 子培养基中， 在 26、 120r/min 条件下培养 3 天， 获得种子液， 再将种子液以 10的接种 量接种到发酵培养基中， 在 26、 120r/min 条件下培养 7 天， 获得深红虫草 (Cordyceps cardinalis)C033 的发酵培养物， 所述的种子培养基和发酵培养基配方相同， 其配方按总 质量分数 100计， 包含葡萄糖 5， 蛋白胨 1。
24、， KNO3 0.2， MgSO4 0.2， CaCl2 0.01， (NH4)3PO43H2O 0.02， 余量为水。 0031 本发明的第三个目的是提供本发明的深红虫草 (Cordyceps cardinalis)C033 作 为生物防治剂的应用。 0032 本发明的第四个目的是提供一种生物防治剂， 该生物防治剂含有深红虫草 (Cordycepscardinalis)C033 作为活性成份。 说 明 书 CN 102168108 B 4/6 页 6 0033 本发明的深红虫草(Cordyceps cardinalis)C033为我国新纪录种， 首次发现其主 要代谢产物为卵孢菌素。因此本发明。
25、提供了从深红虫草 (Cordyceps cardinalis)C033 的 发酵培养物中制备卵孢菌素的方法。 该方法具有培养条件温和、 培养基配置简单易行、 发酵 时间短、 提取步骤简单、 使用有机溶剂少、 产物得率高等优点， 能够比较方便解决研究或应 用卵孢菌素所需的原料间题。 0034 由于本发明的深红虫草 (Cordyceps cardinalis)C033 能够产生卵孢菌素， 而卵 孢菌素是一种真菌毒素， 具有广泛的生物活性， 如抗细菌、 抗植物病原真菌晚疫病菌、 抑制 I 型单纯疱疹病毒 DNA 聚合酶、 抑制单胺氧化酶， 还有文献报道其为两种真菌杀虫剂产品之 活性组分布氏白僵菌Be。
26、auveria brongniartii的唯一主要次级代谢产物， 且这些农药对人 类和动物无毒。因此本发明的深红虫草 (Cordyceps cardinalis)C033 能作为生物防治剂 的活性成份， 为研究和开发新的生物防治剂提供了候选菌种。 0035 本发明的深红虫草 (Cordyceps cardinalis)C033， 于 2010 年 9 月 29 日保藏于中 国典型培养物保藏中心 (CCTCC)， 地址 ： 中国 . 武汉 . 武汉大学， 保藏编号为 ： CCTCC NO ： M 2010256。 具体实施方式 ： 0036 下面通过具体实施例来对本发明做进一步的阐述， 但是本发。
27、明并不受限于下面的 实施例。 0037 实施例 1 ： 深红虫草 (Cordyceps cardinalis)C033 的分离纯化和鉴定 0038 本发明的深红虫草 (Cordyceps cardinalis)C033 分离自湖南衡阳的鳞翅目幼虫 上。 0039 根据虫草的形态特征， 并参照文献 “The genus Cordyceps and its allies， Science Report of theTokyo Bunrika Daigaku(Sect B)， 1941， 84， 53-260 ； North American entomogenous species ofCordy。
28、ceps，Mycologia， 1958， 50， 169-222 ； Phylogenetic classification of Cordyceps and theclavicipitaceous fungi， Studies in Mycology， 2007， 57， 5-59”中 虫 草 的 分 类 系 统 以 及 文 献 “Cordyceps cardinalis sp.nov.， a new species of Cordyceps with an east Asian-eastern NorthAmerican distribution， Mycologia， 2004， 96。
29、， 658-666” ， 该虫草鉴定为深红虫草 (Cordycepscardinalis)。其形态特征如下 ： 0040 子座 7 根， 丛生， 肉质， 从寄主头部发出， 有的子座柄部连生， 长 2-2.5 厘米， 粗 1-2 毫米， 圆柱形， 橙红色， 近基部白色。可孕部膨大， 棒形至圆柱形， 长 0.5-1.2 厘米， 粗 1.5-2.5 毫米， 无不孕顶端， 与柄部分界不明显， 顶端钝圆。子囊壳半埋生至近表生， 密 集， 长卵形， 橙褐色， 355-473142-197 微米， 长宽比为 2.4 1-2.5 1。子囊圆柱形， 155-3883-6 微米， 内含 8 个子囊孢子 ； 子囊帽。
30、半球形至近球形， 透明， 33 微米。子囊孢 子线形， 具多个隔膜， 不断裂成次生子囊孢子。 0041 菌株 C033 的分离方法如下 ： 0042 将新鲜的采自湖南衡阳的鳞翅目幼虫上的虫草样品用自来水将标本表面的泥土 和杂质冲洗干净， 然后用体积分数为 70的酒精水溶液对虫草的虫体部位进行表面消毒， 从中间折断虫体， 露出致密的白色菌丝组织 ( 菌核 )， 用消过毒的微型医用手术刀和镊子挑 说 明 书 CN 102168108 B 5/6 页 7 取菌核菌丝组织块置于 PDA 斜面试管中， 在 25条件下培养， 待组织块上长出菌丝后， 挑取 顶端菌丝置于 PDA 培养基上进行培养， 选择培养。
31、特征一致的菌株继续转接纯化， 最终获得 纯培养菌株 C033， 置于 4冰箱内保存备用。 0043 菌株 C033 的形态特征如下 ： 0044 在 PDA 培养基上生长较慢， 气生菌丝不发达， 稀疏绒状， 贴生， 初期白色， 后变灰白 色至灰黄色， 菌落背面开始为红色， 后呈红黑色。瓶梗生于分生孢子梗中间或顶端， 单生或 2-4 个轮生， 透明， 瓶形， 基部膨大， 向上渐尖， 7.8-13.71.9-3.9 微米。分生孢子椭圆形至 短柱形， 两端钝圆， 无色， 2.9-6.82.0-2.9 微米。 0045 该菌株的形态特征与文献 “Cordyceps cardinalis sp.nov.。
32、， a new species of Cordyceps with aneast Asian-eastern North American distribution， Mycologia， 2004， 96， 658-666”描述的基本一致。因此， 将该虫草菌株鉴定为深红虫草 (Cordyceps cardinalis)， 属于我国新纪录种， 命名为深红虫草 (Cordyceps cardinalis)C033， 于 2010 年 9 月 29 日保藏于中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)， 地址 ： 中国 . 武汉 . 武汉大学， 保藏 编号为 ： CCTCC NO ： M 2010256。
33、。 0046 实施例 2 ： 化合物卵孢菌素的制备 0047 (1) 深红虫草 (Cordyceps cardinalis)C033 的液体发酵。 0048 挑取深红虫草 (Cordyceps cardinalis)C033 的菌丝接种于种子培养基中， 在 26、 120r/min条件下培养3天， 获得种子液， 再将种子液以10的接种量接种到发酵培养 基中， 在 26、 120r/min 条件下培养 7 天， 获得深红虫草 (Cordyceps cardinalis)C033 的 发酵培养物。 0049 所述的种子培养基和发酵培养基相同， 都是 C8 培养基， 其配方如下 ： 按总质量 分数 。
34、100计， 包含葡萄糖 5， 蛋白胨 1， KNO3 0.2， MgSO4 0.2， CaCl2 0.01， (NH4)3PO43H2O0.02， 余量为水。121高压灭菌 20min， 冷却待用。 0050 (2) 卵孢菌素纯品的制备 0051 深红虫草 (Cordyceps cardinalis)C033 的发酵培养物经 5000r/min 离心 15min， 去除菌丝体， 收集上清液， 用上清液体积的 1/3 体积的乙酸乙酯萃取四次， 合并萃取液， 再 以萃取液体积的 1/100 体积的 1mol/L 氢氧化钠溶液进行反萃取。分离出水相， 向其中缓慢 滴加浓盐酸， 并不断搅拌均匀， 至刚。
35、有沉淀析出， 静置。然后 5000r/min 离心 15min， 弃上清 液得卵孢菌素粗品。用 1mol/L 氢氧化钠溶液溶解粗品， 然后再滴加浓盐酸使之析出， 静置， 去除上清液。如此重复三次， 去除杂质。收集去除杂质后的沉淀， 用蒸馏水洗涤， 再置于干 燥皿中， 干燥即得红褐色粉末状物质， 即为卵孢菌素纯品。计算得率为 120mg/L。 0052 (3) 结构鉴定 0053 上一步骤分离得到的红褐色粉末状物质， 经质谱和核磁共振波谱分析， 其结构鉴 定如下式 (I) 所示 ： 0054 说 明 书 CN 102168108 B 6/6 页 8 0055 式 (I) 0056 该化合物具有以。
36、下理化和波谱特性 ： 0057 红褐色粉末， 熔点 245 248； 红外光谱 ： 3311， 1624， 1331， 1299， 1242， 1074em-1； 低 分 辨 EI-MS 显 示 m/z ： 306(34)M+， 250(46)， 222(100)， 194(21)， 167(25)， 138(27)， 83(86)等几个主要峰， 高分辨EI-MS显示m/z ： 306.0372M+， calcd for C14H10O8， 306.0370， 以上质谱数据与文献 “Mass spectral confirmation of oosporein in poultry ratio。
37、ns， Journal of VeterinaryDiagnostic Investigation， 1989， 7， 271-272”中 卵 孢 菌 素 的 基 本 一 致。1H-NMR(500MHz， CD3OD) ： 1.91(6H， s) ； 13C-NMR(125MHz， CD 3OD) ： 7.5(2C)， 108.0(2C)， 114.1(2C)。以上核磁数据与文献报道 “Antifungal Activity of Oosporein from an Antagonistic Fungus against Phytophthorainfestans， Zeitschrift fr Naturforschung， Section C， 2004， 59， 302-304” 中卵孢菌素的记载值一致， 证实得到的产 物红褐色粉末状物质是卵孢菌素。 说 明 书 CN 102168108 B 。