冠突散囊菌快速分离方法.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 102120963 B (45)授权公告日 2013.01.02 CN 102120963 B *CN102120963B* (21)申请号 201010598201.8 (22)申请日 2010.12.21 C12N 1/14(2006.01) (73)专利权人 湖南城市学院 地址 413000 湖南省益阳市赫山区益阳大道 238 号 (72)发明人 赵运林 刘石泉 (74)专利代理机构 长沙正奇专利事务所有限责 任公司 43113 代理人 魏国先 CN 101491281 ,2009.07.29, 全文 . 曹聪等 . 不同原料及生长因子对冠突散囊菌 固体培养特性。

2、的影响 . 安徽农业科学 .2010, 第 9178 页第 2.1-2.2 节， 第 9179 页第 3.3 节 . 姚茂军等 . 冠突散囊菌的分离及其液态发酵 特性 .食品与发酵工业 .2007, 第 28-29 页 . 黄怀生等 . 茯砖茶中冠突散囊菌的代谢 产物研究 I 冠突散囊菌的液体培养 .茶叶通 讯 .2010, 第 15 页第 2.1 节 - 第 16 页第 3.3 节 . (54) 发明名称 冠突散囊菌快速分离方法 (57) 摘要 一种冠突散囊菌快速分离方法， 其特征在于 ： 其具体步骤为 ： 1) 成品茯砖茶的处理 ； 2) 冠突散 囊菌发酵液的制备 ； 3) 冠突散囊菌快速。

3、分离培养 基的制备 ； 4)冠突散囊菌的培养、 纯化 ； 5)冠突散 囊菌的保存。本发明实现了在短期内从成品茯砖 茶中快速分离冠突散囊菌即金花菌， 而且无杂菌， 满足不同品牌茯砖茶中金花菌的分离需要， 而且 可操作性强。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 滕文静 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 一种冠突散囊菌快速分离方法， 其特征在于 ： 其具体步骤为 ： 1） 成品茯砖茶的处理 ； 2） 冠突散囊菌发酵液的制备 ； 3） 冠突散囊菌。

4、快速分离培养基的制备 ； 4） 冠突散囊菌的培养、 纯化 ； 5） 冠突散囊菌的保存 ； 所述的成品茯砖茶的处理是用植物微型粉碎机将样品粉碎， 200 目过筛、 65干燥 2 小 时后称取 1g 样品， 定容 10mL， 配成浓度为 10-1、 10-2、 10-3、 10-4、 10-5各 10mL， 取 10-3、 10-4、 10-5三个梯度准备涂布改良 PDA 平板 ； 所述的冠突散囊菌发酵液的制备方法为 ： 接种实验 室已经分离纯化的冠突散囊菌于 PDA 液体培养基中， 28培养至 OD 值 0.6-0.8, 用 0.2m 过滤膜进行过滤灭菌， 即为制备好的发酵液 ； 所述的冠突散囊。

5、菌快速分离培养基的制备 是 ： 制备改良 PDA 平板， 改良 PDA 固体培养基平板的制备方法是 ： 将马铃薯洗净去皮， 称取 200g， 切成小块放入烧杯中， 加适量蒸馏水， 煮沸 1 小时， 稍冷后用双层纱布过滤， 在滤液中 加100ml制备好的茶汁， 然后加入15g琼脂， 加热熔化， 最后加入蔗糖20g， 混匀， 用量筒定容 至 1000ml， 趁热分装在三角瓶中， 在 1.1kg/cm2， 121中保持 20 分钟灭菌， 灭菌结束后冷却 至 50左右， 按照培养基量和冠状散囊菌发酵液体积比 10:1 添加制备好的冠状散囊菌发 酵液， 趁热倒平板， 即为冠状散囊菌快速分离培养基平板， 。

6、所述茶汁的制备方法按照 1g 茯 砖茶样本比 30ml 蒸馏水的比例称取 20g 茯砖茶， 加入 600ml 蒸馏水， 100水浴 2 小时， 待 稍冷却后用量筒定容至 600ml 即为制备好的茶汁。 2、 根据权利要求 1 所述的冠突散囊菌快速分离方法， 其特征在于 ： 所述的冠突散囊菌 的培养、 纯化为 ： 取浓度 10-3、 10-4、 10-5三个梯度各 0.5mL 涂布于改良 PDA 平板超净台上 吹干， 28培养2-3天， 挑取金黄色优势菌落， 画线接种至同样的改良PDA平板上， 同样条件 继续培养直至纯化 ； 结果判定 ： 当冠突散囊菌落呈现金黄色， 菌落形态相同、 大小一致， 。

7、无 其它杂菌生长即表示冠突散囊菌已经纯化分离。 权 利 要 求 书 CN 102120963 B 2 1/4 页 3 冠突散囊菌快速分离方法 技术领域 0001 本发明涉及农产品加工技术领域， 具体涉及茯砖茶优势菌冠突散囊菌快速分离方 法， 冠突散囊菌俗称金花。 背景技术 0002 一直以来， 茯砖茶是作为边疆少数名族日常生活中不可或缺的必备品， 在边疆享 有 “宁可三日无粮， 不可一日无茶” 的美誉， 其奥妙与茯砖茶的品质风味是不可分割的。 发花 是形成茯砖茶独特品质风味的关键工艺， 其目的是通过对外界条件 （如温、 湿度等） 的控制 促使茯砖茶中的优势菌种 冠突散囊菌生长繁殖， 从而使茯砖。

8、茶具备独特的品质风味。 该菌俗称金花， 历来边疆少数民族通过判断金花质量和数量来衡量茯砖茶的品质优劣。 0003 茯砖茶因具有独特的金花菌以及品质风味而闻名， 边疆少数名族更是将金花视为 衡量茯砖茶品质的标志， 金花菌慢慢便成为人们研究的焦点， 快速分离成品茯砖茶中金花 菌是研究的基础。因此， 目前亟待研制一种能在短期内从成品茯砖茶中快速分离金花菌的 方法， 基本无杂菌， 满足不同品牌茯砖茶金花菌分离需要、 操作性强。 发明内容 0004 本发明所要解决的技术问题是 ： 解决上述现有技术存在的问题， 而提供一种用于 茯砖茶优势菌冠突散囊菌快速分离方法， 实现在短期内从成品茯砖茶中快速分离冠突散。

9、囊 菌即金花菌， 而且无杂菌， 满足不同品牌茯砖茶中金花菌的分离需要， 而且可操作性强。 0005 本发明采用的技术方案是 ： 这种冠突散囊菌快速分离方法， 其具体步骤为 ： 0006 1） 成品茯砖茶的处理 ； 0007 2） 冠突散囊菌发酵液的制备 ； 0008 3） 冠突散囊菌快速分离培养基的制备 ； 0009 4） 冠突散囊菌的培养、 纯化 ； 0010 5） 冠突散囊菌的保存。 0011 上述技术方案中， 所述的成品茯砖茶的处理是用植物微型粉碎机将样品粉碎， 200 目过筛、 65干燥2小时后称取1g样品， 定容10mL， 配成浓度为10-1、 10-2、 10-3、 10-4、 1。

10、0-5各 10mL， 取 10-3、 10-4、 10-5三个梯度准备涂布改良 PDA 平板 ； 0012 上述技术方案中， 所述的冠突散囊菌发酵液的制备方法为 ： 接种实验室已经分离 纯化的冠突散囊菌于 PDA 液体培养基中， 28培养至 OD 值 0.6-0.8, 用 0.2m 过滤膜进行 过滤灭菌， 即为制备好的发酵液 ； 0013 上述技术方案中， 所述的冠突散囊菌快速分离培养基的制备是 ： 为改良 PDA 固体 培养基， 改良方法为按照常规方法配制 PDA 固体培养基， 灭菌结束后冷却至 50左右， 按照 培养基量和冠突散囊菌发酵液体积比 10:1 添加制备好的发酵液， 趁热到平板 。

11、； 0014 上述技术方案中， 所述的冠突散囊菌的培养、 纯化为 ： 取浓度 10-3、 10-4、 10-5三个 梯度各 0.5mL 涂布于改良 PDA 平板超净台上吹干， 28培养 2-3 天， 挑取金黄色优势菌落， 说 明 书 CN 102120963 B 3 2/4 页 4 画线接种至同样的改良 PDA 平板上， 同样条件继续培养直至纯化。结果判定 ： 当冠突散囊 菌落呈现金黄色， 菌落形态相同、 大小一致， 无其它杂菌生长即表示冠突散囊菌已经纯化分 离。 0015 上述技术方案中， 所述的冠突散囊菌的保存为 ： 用改良 PDA 斜面管保存于 4冰箱 中或用改良 PDA 液体培养基制成。

12、孢子悬液加 50% 灭菌甘油于 -70冰箱保存。 0016 上述技术方案中， 所述的 PDA 指 Potato Dextrose Agar 的简称， 中文含义为 ： 马 铃薯葡萄糖琼脂培养基。 0017 PDA 液体培养基指将马铃薯洗净去皮， 称取 200g， 切成小块放入烧杯中， 加适量 蒸馏水， 煮沸 1 小时， 稍冷后用双层纱布过滤， 最后加入蔗糖 20 g， 混匀， 用量筒定容至 1000mL， 趁热分装在三角瓶中， 在 1.1 kg/ cm (121 ) 中保持 20 分钟灭菌。 0018 PDA 平板指培养基灭菌结束后冷却至 50左右， 在超净工作台上将培养基倒入事 先已经灭菌并干。

13、燥的培养皿中， 待冷却即为制得的 PDA 培养基平板。 0019 本发明的冠突散囊菌快速分离培养基的制备分为两步 ： 0020 第一步， 制备改良 PDA 固体培养基， 改良 PDA 固体培养基指将马铃薯洗净去皮， 称 取 200g， 切成小块放入烧杯中， 加适量蒸馏水， 煮沸 1 小时， 稍冷后用双层纱布过滤， 在滤液 中加100mL制备好的茶汁， 然后加入15 g琼脂， 加热熔化， 最后加入蔗糖20 g， 混匀， 用量筒 定容至 1000mL， 趁热分装在三角瓶中， 在 1.1 kg/ cm (121 ) 中保持 20 分钟灭菌。灭菌 结束后冷却至 50左右， 在超净工作台上将 10% 茶。

14、汁的 PDA 琼脂固体培养基倒入事先已经 灭菌并干燥的培养皿中， 待冷却即为制得的 10% 茶汁的 PDA 琼脂固体培养基平板。 0021 改良 PDA 固体培养基在冠状散囊菌快速分离技术中指 10% 茶汁的 PDA 培养基按照 上述第一步方法制备， 灭菌结束后冷却至 50左右 ； 第二步 ： 按照培养基量和冠状散囊菌 发酵液体积比 10:1 添加制备好的冠状散囊菌发酵液， 趁热到平板， 即为冠状散囊菌快速分 离培养基平板。 0022 画线接种指用灭菌的接种针在超净台中将已经生长好的菌落挑取， 在新的固体培 养基平皿画线分离相应微生物。 0023 金花菌落指金花菌在 10%PDA 培养基平板上。

15、生长到一定时候形成的一个菌落集合 体， 菌落是指聚集在一起的微生物团。 0024 茶汁的制备方法制按照 1g 茯砖茶样本比 30mL 蒸馏水的比例称取 20g 茯砖茶， 加 入 600mL 蒸馏水， 100水浴 2 小时， 待稍冷却后用量筒定容至 600mL 即为制备好的茶汁。 0025 冠状散囊菌的发酵液的制备 ： 接种实验室已经分离纯化的冠状散囊菌于添加 10% 茶汁的PDA液体培养基中， 28培养至OD值0.6-0.8， 用0.2m过滤膜进行过滤灭菌， 即为 制备好的冠状散囊菌发酵液， OD 值即吸光值。 0026 本发明能在短期 4 5 天内从成品茯砖茶中快速分离冠突散囊菌， 而且基本。

16、无其 他杂菌生长， 满足从不同品牌茯砖茶中金花菌的分离需要， 可操作性强， 为金花菌的研究奠 定了基础。 附图说明 0027 图 1 为 PDA 培养基 3 天分离、 纯化成品湘益牌茯砖茶样本中冠突散囊菌验证结果 照片。 说 明 书 CN 102120963 B 4 3/4 页 5 0028 图 2 为改良 PDA 培养基 3 天分离、 纯化成品湘益牌茯砖茶样本中冠突散囊菌验证 结果察照片。 0029 图 3 为改良 PDA 培养基分离、 纯化成品湖南益阳茶厂茯砖茶样本中冠突散囊菌的 验证结果照片， 图中只显示了浓度为 10-4梯度照片。 0030 图 4 为改良 PDA 培养基分离、 纯化成。

17、品湖南安化利源隆茶厂茯砖茶样本中冠突散 囊菌的验证结果照片， 图中只显示了浓度为 10-4梯度照片。 0031 图 5 为改良 PDA 培养基分离、 纯化成品永泰福茶厂茯砖茶样本中冠突散囊菌的验 证结果照片， 图中只显示了浓度为 10-4梯度照片。 0032 图 6 为改良 PDA 培养基分离、 纯化成品湖南安化华茗茶厂茯砖茶样本中冠突散囊 菌的验证结果照片， 图中只显示了浓度为 10-4梯度照片。 0033 图 7 为改良 PDA 培养基分离、 纯化成品湖南久杨茶叶有限公司茯砖茶样本中冠突 散囊菌的验证结果照片， 图中只显示了浓度为 10-4梯度照片。 0034 图 8 为改良 PDA 培养。

18、基分离、 纯化成品白沙溪茶叶有限公司茯砖茶样本中冠突散 囊菌的验证结果照片， 图中只显示了浓度为 10-4梯度照片。 具体实施方式 0035 1、 成品茯砖茶的处理 ： 0036 用植物微型粉碎机将样品粉碎， 200 目过筛、 65干燥 2 小时后称取 1g 样品， 定容 10mL， 配成浓度为 10-1、 10-2、 10-3、 10-4、 10-5各 10mL， 取 10-3、 10-4、 10-5三个梯度准备涂布 改良 PDA 平板。 0037 2、 冠突散囊菌发酵液的制备 ： 0038 用接种环挑取实验室已经分离纯化的冠突散囊菌接种于 PDA 液体培养基中， 28 培养至 OD 值 0。

19、.6-0.8, 用 0.2m 过滤膜进行过滤灭菌， 即为制备好的发酵液。 0039 3、 冠突散囊菌快速分离培养基的制备 ： 0040 冠突散囊菌快速分离培养基为改良 PDA 固体培养基， 改良方法为按照常规方法配 制 PDA 固体培养基， 灭菌结束后冷却至 50左右， 按照培养基量和冠突散囊菌发酵液体积 比 10:1 添加制备好的发酵液， 趁热到平板。 0041 4、 冠突散囊菌的培养、 纯化 ： 0042 取 10-3、 10-4、 10-5三个梯度各 0.5mL 涂布改良 PDA 平板超净台上吹干， 28培养 2-3 天， 挑取金黄色优势菌落， 画线接种至同样的改良 PDA 平板上， 同。

20、样条件继续培养直至 纯化。 0043 5、 冠突散囊菌的保存 ： 0044 用改良 PDA 斜面管保存于 4冰箱中或用改良 PDA 液体培养基制成孢子悬液加 50% 灭菌甘油于 -70冰箱保存。 0045 实施例 1 ： PDA 培养基与改良 PDA 培养基分离、 纯化成品湘益牌茯砖样本中冠突散 囊菌的验证 0046 将成品湘益牌茯砖样本按照具体实施方式 1-4 步实验， 结果证明能有效分离冠突 散囊菌。 0047 分离纯化的金花菌落见附图 1 和附图 2。 说 明 书 CN 102120963 B 5 4/4 页 6 0048 实施例 2 ： 改良 PDA 培养基分离、 纯化成品湖南益阳茶厂。

21、、 湖南安化利源隆茶厂、 湖 南安化华茗茶厂、 永泰福茶厂、 湖南久杨茶叶有限公司、 白沙溪茶叶有限公司生产的茯砖样 本中冠突散囊菌的验证 0049 将湖南益阳茶厂、 湖南安化利源隆茶厂、 湖南安化华茗茶厂、 永泰福茶厂、 湖南久 杨茶叶有限公司、 白沙溪茶叶有限公司生产的茯砖样本按照具体实施方式 1-4 步实验， 结 果证明能有效分离冠突散囊菌。 0050 分离纯化的金花菌落见附图 2 和附图 3、 4、 5、 6、 7、 8。 说 明 书 CN 102120963 B 6 1/1 页 7 图 1图 2 图 3图 4 图 5 图 6图 7图 8 说 明 书 附 图 CN 102120963 B 7 。