一种连续发酵生产L-乳酸的方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102174600 A (43)申请公布日 2011.09.07 CN 102174600 A *CN102174600A* (21)申请号 201010624057.0 (22)申请日 2010.12.31 C12P 7/56(2006.01) C12R 1/225(2006.01) (71)申请人 安徽丰原发酵技术工程研究有限公 司 地址 233030 安徽省蚌埠市胜利西路北侧 (72)发明人 李荣杰 崔刚 杨丽 (74)专利代理机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 代理人 王加岭 张庆敏 (54) 发明名称 一种连续发酵生产 L- 乳酸的方法 (57。

2、) 摘要 本发明提供了一种连续发酵生产 L- 乳酸的 方法。该方法以农作物废弃物糖化液为碳源通过 乳酸菌 (Lactobacillus) 连续发酵生产 L- 乳酸， 一次接种增殖， 菌体多次重复利用， 减少了菌种制 备的工作量， 简化了发酵工艺， 降低了劳动强度 ； 另外， 菌种经过连续发酵驯化， L- 乳酸发酵周期 由5055小时缩短至2430小时， L-乳酸的发 酵强度显著提高， 生产效率提高了 50以上。本 发明过程简单， 连续性强， 易应用于工业生产， 可 显著降低 L- 乳酸的生产成本。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 。

3、1 页 说明书 4 页 CN 102174604 A1/1 页 2 1. 一种连续发酵生产 L- 乳酸的方法， 其特征在于， 包括如下步骤 ： 1) 将农作物废弃物粉碎后， 采用稀碱液、 稀酸液、 纤维素酶依次处理， 制得含糖质量百 分比为 10 20的糖化液 ； 2) 将乳酸菌 (Lactobacillus) 接种到发酵培养基中， 接种量 5 10， 发酵温度为 30 50， 200rpm 进行厌氧搅拌发酵， 当乳酸含量不再增加时发酵结束， 停止搅拌， 放出 80 85体积的发酵液， 补入新发酵培养基继续发酵， 按上述步骤连续发酵 5 10 批次 作为第一代 ； 其中， 以步骤 1) 制得的。

4、糖化液为碳源， 第一代连续发酵培养基的质量百分比 配置如下 ： 总糖 10、 酵母膏 0.2 0.4、 牛肉膏 0.3 0.5、 磷酸二氢钾 0.03 0.05、 磷酸氢二钾 0.03 0.05、 氯化钠 0.02 0.03、 硫酸镁 0.04 0.06、 碳酸钙 3 5 ； 3) 以上一代的发酵液按 5 10的接种量接种到新鲜的发酵培养基中， 按步骤 2) 的 方法连续发酵 5 10 批次 ； 连续发酵驯化 3 4 代 ； 其中， 以步骤 1) 制得的糖化液为碳 源， 第二代连续发酵培养基的质量百分比配置如下 ： 总糖 15、 酵母膏 0.2 0.4、 牛 肉膏 0.3 0.5、 磷酸二氢钾。

5、 0.03 0.05、 磷酸氢二钾 0.03 0.05、 氯化钠 0.020.03、 硫酸镁0.040.06、 碳酸钙35； 以步骤1)制得的糖化液为碳 源， 第三或四代连续发酵培养基的质量百分比配置如下 ： 总糖 20、 酵母膏 0.2 0.4、 牛肉膏 0.3 0.5、 磷酸二氢钾 0.03 0.05、 磷酸氢二钾 0.03 0.05、 氯化钠 0.02 0.03、 硫酸镁 0.04 0.06、 碳酸钙 3 5。 2. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 所述农作物废弃物为秸秆或玉米芯。 3.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 其中步骤1)糖化液的制备方法为， 按固液 比 。

6、1 4 6(w/w) 向粉碎的农作物废弃物加入 2 (w/v) 的稀碱液并置于反应器中， 封口 后在 125条件下加热处理 50 分钟， 所得浆液于 2000rpm 离心 ； 所得固相经水洗后加入容 器中， 按固液比 1 5 8(w/w) 加入 2 (v/v) 的稀酸液， 调节温度到 50处理 1 小时， 再 按照 20 单位 /g 纤维素加入纤维素酶， 搅拌转速 100rpm， 酶解时间控制在 60 70 小时， 将 料液离心过滤， 液相为酶解糖液。 4. 根据权利要求 3 所述的方法， 其特征在于， 所述稀碱液为氢氧化钠溶液、 氢氧化钾溶 液或氨水中的一种或几种。 5. 根据权利要求 3 。

7、所述的方法， 其特征在于， 所述稀酸液为盐酸、 硫酸、 醋酸中的一种 或几种。 6. 根据权利要求 1 5 任一项所述的方法， 其特征在于， 所述乳酸菌为 Lactobacillus 1.2131。 7. 根据权利要求 1 5 任一项所述的方法， 其特征在于， 所述发酵温度为 35 45。 权 利 要 求 书 CN 102174600 A CN 102174604 A1/4 页 3 一种连续发酵生产 L- 乳酸的方法 技术领域 0001 本发明涉及发酵技术领域， 具体涉及一种连续发酵生产 L- 乳酸的方法。 背景技术 0002 乳酸是一种重要的有机酸， 学名 - 羟基丙酸， 在分子结构中有一个。

8、不对称碳原 子， 因此乳酸存在两种异构体， 即L-(+)乳酸和D-(-)乳酸。 作为一种重要的生物化工原料， L- 乳酸被广泛应用于食品、 医药、 现代农业、 日用化工、 有机化工等领域， 覆盖大量产品。 0003 乳酸可以通过化学合成或碳水化合物发酵得到， 但是基于发酵法能够专一性地得 到 L- 乳酸或 D- 乳酸， 因此发酵法被广泛用于 L- 乳酸的生产。乳酸杆菌发酵生产乳酸具有 光学纯度高、 发酵强度显著提高等特点， 因此， 利用乳酸杆菌发酵生产乳酸成为大规模生产 L- 乳酸的趋势。 0004 目前用于 L- 乳酸生产的原料主要有淀粉、 糖蜜、 乳清水等。为了降低 L- 乳酸的制 备成本。

9、， 提高乳酸生产质量， 国内外对乳酸生产的研究， 主要集中在低价原料的开发利用、 提高发酵强度、 优化乳酸分离提取工艺这三个方面。 0005 农作物废弃物如作物秸秆、 玉米芯等可作为低价原料的开发对象。我国是玉米生 产大国， 也是玉米纤维资源浪费大国， 仅玉米芯每年就浪费掉 1000 万吨， 同时也引发了许 多环境问题。 发明内容 0006 本发明的目的在于提供一种连续发酵生产 L- 乳酸的方法， 用以解决现有乳酸生 产发酵成本高的问题。 0007 为实现上述目的， 本发明以农作物废弃物的糖化液为碳源， 利用乳酸菌 (Lactobacillus) 连续发酵生产 L- 乳酸。具体地， 该方法包括。

10、如下步骤 ： 0008 1) 将农作物废弃物粉碎后， 采用稀碱液、 稀酸液、 纤维素酶依次处理， 制得含糖质 量百分比为 10 20的糖化液 ； 0009 2) 将乳酸菌接种到发酵培养基中， 接种量 5 10， 发酵温度为 30 50， 200rpm 进行厌氧搅拌发酵 ； 当乳酸含量不再增加时发酵结束， 停止搅拌， 放出 80 85 体积的发酵液， 补入新发酵培养基继续发酵， 连续循环发酵 5 10 批次作为一代 ； 其中， 以 步骤 1) 制得的糖化液为碳源， 第一代连续发酵培养基的质量百分比配置如下 ： 总糖 10、 酵母膏 0.2 0.4、 牛肉膏 0.3 0.5、 磷酸二氢钾 0.03。

11、 0.05、 磷酸氢二钾 0.03 0.05、 氯化钠 0.02 0.03、 硫酸镁 0.04 0.06、 碳酸钙 3 5 ； 0010 3) 以上一代的发酵液按 5 10的接种量接种到新鲜的发酵培养基中， 按步骤 2) 的方法连续发酵 5 10 批次 ； 连续发酵驯化 3 4 代 ； 其中， 以步骤 1) 制得的糖化液为 碳源， 第二代连续发酵培养基的质量百分比配置如下 ： 总糖 15、 酵母膏 0.2 0.4、 牛 肉膏 0.3 0.5、 磷酸二氢钾 0.03 0.05、 磷酸氢二钾 0.03 0.05、 氯化钠 0.020.03、 硫酸镁0.040.06、 碳酸钙35； 以步骤1)制得的。

12、糖化液为碳 说 明 书 CN 102174600 A CN 102174604 A2/4 页 4 源， 第三或四代连续发酵培养基的质量百分比配置如下 ： 总糖 20、 酵母膏 0.2 0.4、 牛肉膏 0.3 0.5、 磷酸二氢钾 0.03 0.05、 磷酸氢二钾 0.03 0.05、 氯化钠 0.02 0.03、 硫酸镁 0.04 0.06、 碳酸钙 3 5。 0011 如无特别说明， 本发明培养基中未注明的其它成分为水。 0012 所述农作物废弃物包括但不限于作物秸秆、 玉米芯等。 0013 所述步骤1)制备糖化液的方法为， 于反应器中按固液比146(w/w)向粉碎的 农作物废弃物中加入 。

13、2 (w/v) 的稀碱液， 封口后在 125条件下加热处理 50 分钟， 所得浆 液在 2000rpm 离心机内离心 ； 所得固相经水洗后加入容器中， 按固液比 1 5 8(w/w) 加 入 2 (v/v) 的稀酸液， 调节温度到 50处理 1h， 再按照 20 单位 /g 纤维素加入纤维素酶， 搅拌转速 100rpm， 酶解时间控制在 60 70 小时。 0014 所述稀碱液可以是氢氧化钠溶液、 氢氧化钾溶液或氨水中的一种或几种。 0015 所述稀酸液可以是盐酸、 硫酸、 醋酸中的一种或几种。 0016 上述优选的发酵条件是 ： 按8的接种量接入乳酸菌种子液， 在3545、 200rpm 厌。

14、氧条件下发酵， 发酵至乳酸含量不再增加， 结束发酵。 0017 其中， 乳酸菌种子液可按照如下方法制备 ： 0018 平板培养 ： 将乳酸菌种接种到活化培养基中， 30培养 40 小时 ； 0019 摇瓶种子培养 ： 将平板培养的乳酸菌种接种到种子液体培养基中， 38厌氧培养 20 小时， 摇床转速 200rpm， 检测 OD600为 4.0。 0020 其中， 以上述步骤 1) 制得的糖化液为碳源， 平板培养使用的活化培养基的质量百 分比配制为 ： 总糖 1、 酵母膏 0.5、 蛋白胨 0.5、 琼脂 2 ； 0021 其中， 以上述步骤 1) 制得的糖化液为碳源， 摇瓶种子培养使用的液体培。

15、养基的 质量百分比配制为 ： 总糖 3、 酵母膏 0.5、 蛋白胨 0.5、 玉米浆 0.5、 磷酸二氢钾 0.05、 硫酸镁 0.06、 硫酸锰 0.003。 0022 本发明方法具有如下优点 ： 0023 (1) 以大量的农作物废弃物为主要原料制备 L- 乳酸， 显著降低 L- 乳酸的生产成 本， 其产业前景非常广阔。 0024 (2) 采用乳酸菌 (Lactobacillus 1.2131) 一次接种增殖， 菌体多次重复利用生产 L- 乳酸， 减少菌种制备， 简化发酵工艺， 降低劳动强度。 0025 (3) 菌种经过连续发酵驯化， L- 乳酸发酵周期由 50 55 小时缩短至 24 26。

16、 小 时， L- 乳酸的发酵强度显著提高， 生产效率提高了 50以上。 0026 (4) 本发明不仅实现了秸秆糖化液连续发酵生产乳酸的目的， 而且在发酵过程中 达到了驯化菌种的目的， 过程简单， 连续性强， 易于工业放大应用于生产。 具体实施方式 0027 以下实施例进一步说明本发明的内容， 但不应理解为对本发明的限制。在不背离 本发明精神和实质的情况下， 对本发明方法、 步骤或条件所作的修改或替换， 均属于本发明 的范围。若未特别指明， 实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。 0028 实施例 1 农作物废弃物糖化液的制备 0029 将玉米芯粉碎， 加入到反应釜中， 然后按。

17、固液比 1 5(w/w) 的比例加入 2 (w/ 说 明 书 CN 102174600 A CN 102174604 A3/4 页 5 v) 的 NaOH， 封好口后， 在 125条件下加热处理 50 分钟， 得到的浆液在 2000rpm 离心机内 离心， 离心后的黑液经膜处理以回收其中的碱 ； 所得固相经水洗后加入容器中， 按固液比 1 6(w/w) 加入 2 (v/v) 的稀 HCl， 调节温度到 50处理 1h， 再按照 20 单位 /g 纤维素加 入纤维素酶， 搅拌转速 100rpm， 酶解时间控制在 65 小时， 酶解终点后， 将料液离心过滤， 液 相为酶解糖液， 利用 DNS 法测。

18、酶解液的总糖浓度， 利用高效液相色谱法测酶解液中的葡萄 糖及木糖浓度。结果总糖浓度达 10 20 (w/v)。 0030 实施例 2 第一代 L- 乳酸连续发酵 0031 以乳酸菌 (Lactobacillus 1.2131)( 购自中科院微生物所 ) 为例， 来说明本发明 的发酵过程。 0032 对于保藏的乳酸菌， 首先经过如下过程制备种子液 ： 0033 平板培养 ： 将乳酸菌种接种活化培养基中， 30培养 40 小时 ； 0034 摇瓶种子培养 ： 将平板培养的乳酸菌种接种到种子液体培养基中， 38厌氧培养 20 小时， 摇床转速 200rpm， 检测 OD600为 4.0。 0035 。

19、其中， 以实施例 1 制得的糖化液为碳源， 平板培养使用的活化培养基的质量百分 比配制为 ： 总糖 1、 酵母膏 0.5、 蛋白胨 0.5、 琼脂 2 ； 0036 其中， 以实施例 1 制得的糖化液为碳源， 摇瓶种子培养使用的液体培养基的质量 百分比配制为 ： 总糖 3、 酵母膏 0.5、 蛋白胨 0.5、 玉米浆 0.5、 磷酸二氢钾 0.05、 硫酸镁 0.06、 硫酸锰 0.003。 0037 通过上述培养得到发酵种子液， 检测种子液 OD600为 4.0 即可。 0038 以实施例 1 制得的糖化液为碳源， 第一代连续发酵培养基的质量百分比配置为 ： 总糖 10、 酵母膏 0.3、 。

20、牛肉膏 0.4、 磷酸二氢钾 0.04、 磷酸氢二钾 0.04、 氯化钠 0.02、 硫酸镁 0.05、 碳酸钙 4。 0039 L- 乳酸连续发酵 ： 将发酵种子液中的乳酸菌 (Lactobacillus1.2131) 接种至上述 发酵培养基中， 接种量 8， 在 40、 200rpm 进行厌氧搅拌发酵 ； 发酵至乳酸含量不再增加， 结束发酵， 停止搅拌， 放出 5/6 体积的发酵液， 补入上述配方新发酵培养基继续发酵 ； 连续 循环发酵 10 批次， 发酵周期为 50 55 小时， 平均 53 小时。 0040 实施例 3 第二代 L- 乳酸连续发酵 0041 使用实施例 2 中发酵 10。

21、 批次后的乳酸菌接种至发酵培养基中， 其中， 以实施例 1 制得的糖化液为碳源， 第二代连续发酵培养基的质量百分比配置为 ： 总糖 15、 酵母膏 0.2 0.4、 牛肉膏 0.3 0.5、 磷酸二氢钾 0.03 0.05、 磷酸氢二钾 0.03 0.05、 氯化钠 0.02 0.03、 硫酸镁 0.04 0.06、 碳酸钙 3 5， 在 40、 200rpm 进行厌氧搅拌， 连续发酵 ； 发酵至乳酸含量不再增加， 结束发酵， 停止搅拌， 放出 5/6 体积的发酵液， 补入新发酵培养基继续发酵 ； 连续循环发酵10批次， 发酵周期为4045小 时， 发酵周期缩短为平均 42 小时。 0042 。

22、实施例 4 第三代 L- 乳酸连续发酵 0043 使用实施例 3 中发酵 10 批次后的乳酸菌接种至发酵培养基中， 其中， 以实施例 1 制得的糖化液为碳源， 第三代连续发酵培养基的质量百分比配置为 ： 总糖 20、 酵母膏 0.2 0.4、 牛肉膏 0.3 0.5、 磷酸二氢钾 0.03 0.05、 磷酸氢二钾 0.03 0.05、 氯化钠 0.02 0.03、 硫酸镁 0.04 0.06、 碳酸钙 3 5， 在 40、 说 明 书 CN 102174600 A CN 102174604 A4/4 页 6 200rpm 进行厌氧搅拌， 连续发酵 ； 发酵至乳酸含量不再增加， 结束发酵， 停止。

23、搅拌， 放出 5/6 体积的发酵液， 补入新发酵培养基继续发酵 ； 再连续循环发酵 10 批次， 发酵周期为 26 32 小时， 发酵周期缩短为平均 28 小时。 0044 实施例 5 第四代 L- 乳酸连续发酵 0045 使用实施例 4 中发酵 10 批次后的乳酸菌接种至实施例 4 所述发酵培养基中， 在 40、 200rpm 进行厌氧搅拌， 连续发酵 ； 发酵至乳酸含量不再增加， 结束发酵， 停止搅拌， 放 出 5/6 体积的发酵液， 补入新发酵培养基继续循环发酵 20 批次， 发酵周期为 24 30 小时 ； 发酵周期缩短为平均 25 小时。 0046 上述四代连续发酵培养的结果表明， 在经过三代连续发酵培养驯化后， 菌种就能 基本保持其发酵特性， 菌种性能比较稳定， 可作为进一步连续发酵生产的菌种。 0047 虽然， 上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述， 但在 本发明基础上， 可以对之作一些修改或改进， 这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此， 在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进， 均属于本发明要求保护的范围。 说 明 书 CN 102174600 A 。