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1、(10)申请公布号 CN 102174466 A (43)申请公布日 2011.09.07 CN 102174466 A *CN102174466A* (21)申请号 201110008808.0 (22)申请日 2011.01.14 C12N 5/071(2010.01) C12N 5/10(2006.01) C12N 7/01(2006.01) C12N 15/867(2006.01) (71)申请人 安徽农业大学 地址 230036 安徽省合肥市长江西路 130 号 (72)发明人 曹鸿国 章孝荣 刘亚 张运海 陶勇 方富贵 殷慧群 孙雪萍 薛奕杰 张卫琴 黄伟玲 陈涛 李运生 任春环 。
2、张子军 丁建平 刘洪瑜 刘旭光 王力生 (54) 发明名称 一种猪体细胞诱变方法 (57) 摘要 本发明公开了一种猪体细胞诱变方法， 利用 携带增强型绿色荧光蛋白标记的慢病毒多次感染 作用胎猪成纤维细胞， 在干细胞培养液的生长环 境条件下胎猪成纤维细胞逐步改变原有的纤维状 生长形态， 形成鸟巢状细胞集落， 分离培养传代 的细胞集落边缘界限清晰， 生长状态稳定， 核型正 常， 碱性磷酸酶表达为阳性， 免疫细胞化学检测显 示 Oct4、 Nanog、 SSEA-1 蛋白表达为阳性， 体内分 化形成含有三个胚层的畸胎瘤， 结果证实慢病毒 作用下发生诱变的猪体细胞具有干细胞特征。 (51)Int.Cl。
3、. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 CN 102174470 A1/1 页 2 1. 一种猪体细胞诱变方法， 其特征在于， 步骤如下 ： 1) 取妊娠约 60 天左右的猪胎儿， 采用组织块培养法添加胎猪成纤维细胞培养液建立 胎猪成纤维细胞系 ； 2)磷酸钙介导pLentiLox 3.7慢病毒表达载体及其包装组分pMDLg、 pRSV REV和pVSVg 在293T细胞中组建成慢病毒颗粒， 12-16小时后更换新鲜293T细胞培养液， 病毒包装48小 时后收集含慢病毒的 293T 细胞培养液， 经超滤浓缩后添加到胎猪成纤维细胞培养板。
4、内 ； 3) 在胎猪成纤维细胞培养板内添加含终浓度为 10g/ml Polybrene 的胎猪成纤维细 胞培养液， 此后， 每天收集含慢病毒的 293T 细胞培养液， 添加到胎猪成纤维细胞培养板中 感染胎猪成纤维细胞 2-4 次 ； 4) 将胎猪成纤维细胞培养板内的培养液更换为含胎牛血清的高糖 DMEM 培养液的猪诱 变细胞培养液， 再连续收集含慢病毒的 293T 细胞培养液 2-4 天， 并让所收集的慢病毒感染 胎猪成纤维细胞 2-4 次 ； 5) 当胎猪成纤维细胞中的细胞形态出现集落变化后， 将细胞集落经 Dispase II 消化 后接种到经丝裂霉素处理的 12.5 天小鼠胎儿成纤维细胞。
5、饲养层上， 在饱和湿度培养箱中 培养 ； 经 4 次感染后 1 周在小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上形成鸟巢状猪干细胞集落。 2. 根据权利要求 1 所述的猪体细胞诱变方法， 其特征在于， 步骤 1) 所述的猪胎儿为杜 洛克 - 长白 - 大约克三元杂交猪胎儿。 3. 根据权利要求 1 所述的猪体细胞诱变方法， 其特征在于， 步骤 2) 所述的胎猪成纤维 细胞培养液为含有 10胎牛血清的高糖 DMEM 培养液。 4. 根据权利要求 1 所述的猪体细胞诱变方法， 其特征在于， 步骤 4) 所述的猪诱变细胞 培养液由高糖 DMEM、 2mM 谷氨酰胺、 2mM 丙酮酸钠、 1非必须氨基酸、 0.1mM 。
6、- 巯基乙醇、 1000U/ml LIF、 4ng/ml bFGF、 15 FBS 和 1青链霉素组成。 权 利 要 求 书 CN 102174466 A CN 102174470 A1/4 页 3 一种猪体细胞诱变方法 技术领域 0001 本发明涉及细胞诱变技术领域， 尤其涉及一种猪体细胞的诱变方法。 背景技术 0002 慢病毒载体作为一类重组逆转录病毒载体在转基因生产中具有方便、 快捷、 高效 和稳定转染等优点， 目前已成为一种重要的基因转移工具被广泛应用于基因导入细胞分 子生物学研究领域。慢病毒是逆转录病毒家族的成员， 病毒能够利用自身组分将外源基 因整合入宿主细胞基因组中， 从而使外源。
7、基因随着宿主细胞的分裂增殖和传代而稳定表 达。2006 年人类第一次利用逆转录病毒介导小鼠皮肤成纤维细胞表达 Oct4、 Sox2、 Klf4 和 c-Myc， 表达这些外源基因的小鼠成纤维细胞呈现小鼠胚胎干细胞 (Embryonic stem cell， ES)的形态和特征。 来源于外源限定基因诱导的多能性干细胞具有同ES细胞相似或相同的 特性， 拥有二倍体生殖系嵌合遗传和四倍体互补产生后代的能力， 这种细胞常被称为诱导 多能性干细胞 (Induced pluripotent stem cell， iPS 细胞 )。来自人体的成纤维细胞通 过逆转录病毒载体介导表达 Oct4、 Nanog、 。
8、Sox2 和 Lin 28 或 Oct4、 Sox2、 Klf4 和 c-Myc 四 种基因， 表达外源基因的人成纤维细胞呈现出人 ES 细胞的特征。在家畜方面， Esteban 等 2009年分别通过使用逆转录病毒或慢病毒载体介导限定因子诱导出猪的iPS细胞。 由于猪 在解剖学和生理学等方面同人类极为相似， 因此， 猪是研究人类器官移植和细胞转基因治 疗等安全性和应用效率的理想动物模型和试验材料。在我们的相关试验中发现， 慢病毒感 染猪成纤维细胞后能够引起细胞在形态和生长性能等方面呈现特征性变化， 并呈现出一些 干细胞所具有的特征， 这些现象的发现将会为探讨细胞的生长、 发育和重构等方面提供。
9、理 想的材料和手段。然而， 到目前关于利用慢病毒诱导猪体细胞为干细胞的诱导技术国内外 尚未有文献报道。 发明内容 0003 本发明要解决的技术问题是提供一种利用慢病毒对猪体细胞进行诱变的方法。 0004 为了解决上述技术问题， 本发明采用的技术方案是提供一种猪体细胞诱变方法， 步骤如下 ： 0005 1) 取妊娠约 60 天左右的猪胎儿， 采用组织块培养法添加胎猪成纤维细胞培养液 建立胎猪成纤维细胞系 ； 0006 2) 磷酸钙介导 pLentiLox 3.7 慢病毒表达载体及其包装组分 pMDLg、 pRSVREV 和 pVSVg 在 293T 细胞中组建成慢病毒颗粒， 12-16 小时后更。
10、换新鲜 293T 细胞培养液， 病毒包 装 48 小时后收集含慢病毒的 293T 细胞培养液， 经超滤浓缩后添加到胎猪成纤维细胞培养 板内 ； 0007 3) 在胎猪成纤维细胞培养板内添加含终浓度为 10g/ml Polybrene 的胎猪成纤 维细胞培养液， 此后， 每天收集含慢病毒的 293T 细胞培养液， 添加到胎猪成纤维细胞培养 板中感染胎猪成纤维细胞 2-4 次 ； 说 明 书 CN 102174466 A CN 102174470 A2/4 页 4 0008 4) 将胎猪成纤维细胞培养板内的培养液更换为含胎牛血清的高糖 DMEM 培养液的 猪诱变细胞培养液， 再连续收集含慢病毒的 。
11、293T 细胞培养液 2-4 天， 并让所收集的慢病毒 感染胎猪成纤维细胞 2-4 次 ； 0009 5) 当胎猪成纤维细胞中的细胞形态出现集落变化后， 将细胞集落经 Dispase II 消化后接种到经丝裂霉素处理的 12.5 天小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上， 在饱和湿度培养 箱中培养 ； 经 4 次感染后 1 周在小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上形成鸟巢状猪干细胞集落。 0010 上述步骤 1) 所述的猪胎儿为杜洛克 - 长白 - 大约克三元杂交猪胎儿。 0011 上述步骤2)所述的胎猪成纤维细胞培养液为含有10胎牛血清的高糖DMEM培养 液。 0012 上述步骤 4) 所述的猪诱变细胞培养液由高。
12、糖 DMEM、 2mM 谷氨酰胺、 2mM 丙酮酸钠、 1非必须氨基酸、 0.1mM - 巯基乙醇、 1000U/ml LIF、 4ng/ml bFGF、 15 FBS 和 1青链 霉素组成。 0013 本发明的有益效果是 ： 0014 1) 利用慢病毒对猪体细胞进行诱导， 操作简单方便， 诱导周期短， 对慢病毒感染的 胎猪成纤维细胞进行培养传代， 能够分离培养出类似胚胎干细胞的鸟巢状细胞克隆， 细胞 集落生长状态稳定， 常规的冻存复苏不影响细胞的生长和形态， 并且诱变的细胞核型正常， 高效强表达碱性磷酸酶及 Oct4、 Nanog、 SSEA-1 干细胞特有的蛋白， 在免疫缺陷鼠体内能够 分。
13、化形成含有三个胚层的畸胎瘤， 结果证实慢病毒能够诱导胎猪成纤维细胞形成多能性干 细胞 ； 首次成功利用慢病毒诱导产生猪多能性干细胞 ； 0015 2) 采用慢病毒对猪体细胞的诱导和维持干细胞特征的培养液两者的有效结合建 立了稳定的诱导干细胞， 对未来从猪自然胚胎中分离培养建立真正的胚胎干细胞系具有重 要的参考价值。 0016 转基因动物的研究和生产是生命科学研究的热点领域。 转基因动物生产在生物制 药、 建立诊断和治疗人类疾病的动物模型、 生产用于人体器官移植的动物器官、 动物抗病育 种和改良动物生产性能等方面具有着重要的应用前景和发展潜力。 目前转基因动物的生产 存在着目的基因表达率低、 表。
14、达不稳定， 转基因动物生产效率低等诸多问题。 ES细胞是一种 来源于囊胚内细胞团的多能性干细胞群体， 具有较强的再生能力和可塑性， 在体外培养环 境条件下， 能够高效地进行外源基因导入、 基因敲除和基因改造等遗传修饰操作。 ES细胞同 二倍体胚胎嵌合、 四倍体胚胎互补及核移植技术等相结合可以有效地解决动物转基因效率 低和基因表达不稳定等方面的问题。最近研究发现， 来源于外源限定基因诱导的多能性干 细胞具有同 ES 细胞相似或相同的特性， 具有二倍体生殖系嵌合遗传和四倍体互补产生后 代的能力， 这种细胞被称作为 iPS 细胞。iPS 细胞的诞生解决了传统生产家畜 ES 需要破坏 大量优质胚胎的问。
15、题。本发明显示未携带外源限定因子 Oct4、 Sox2、 Klf4 和 c-Myc 的慢病 毒也能够诱导形成干细胞， 此项慢病毒诱变方法具有操作简单方便， 诱导周期短， 并且诱导 形成的多能性干细胞性能稳定。目前这种慢病毒诱导方法在国内外尚未见有文献报道， 因 此本发明对于促进诱导多能性干细胞相关的研究和应用具有深远意义。 具体实施方式 0017 1 材料和试剂 ： 说 明 书 CN 102174466 A CN 102174470 A3/4 页 5 0018 胎猪成纤维细胞的分离和培养 ： 采用组织块培养法建立胎猪成纤维细胞系， 胎猪 成纤维细胞培养液为含有 10胎牛血清 (Hyclone)。
16、 的高糖 DMEM(Hyclone)。 0019 胎鼠成纤维细胞 (Mouse embryo fibroblasts， MEFs) 系的建立 ： 取妊娠 12.5 天 ICR 品系胎鼠， 去除头、 四肢和内脏后采用胰酶消化法分离培养小鼠胚胎成纤维细胞。胎鼠 成纤维细胞培养液为含有 10新生牛血清 ( 四季青 ) 的高糖 DMEM(Hyclone)。 0020 小鼠胎儿成纤维细胞饲养层的制备 ： 选择铺满皿底的 2-4 代的小鼠胚胎成纤维细 胞， 经 10g/ml 的丝裂霉素 C(Sigma) 处理 2.5 小时， 常规胰酶消化接种到铺过 0.1明胶 的培养皿内， 接种细胞密度为 2105个 /。
17、ml。所用培养液同胎鼠成纤维细胞培养液。 0021 猪诱变细胞培养液 ： 高糖 DMEM(Hyclone)+2mM 谷氨酰胺 (Gibco)+2mM 丙酮酸钠 (Gibco)+1非必须氨基酸 (Gibco)+0.1mM - 巯基乙醇 (Sigma)+1000U/ml LIF(ESGRO， Chemicon International)+4ng/ml bFGF(Sigma)+15 FBS(Hyclone)+1 青 链 霉 素 (Gibco)。 0022 293T 细胞培养液同胎猪成纤维细胞培养液。 0023 所有细胞均在 37.5， 5 CO2， 饱和湿度下 CO2培养箱中培养。 0024 2 。
18、猪体细胞诱变方法 ： 0025 1) 从妊娠约 60 天左右杜洛克 - 长白 - 大约克三元杂交猪胎儿皮肤通过组织块培 养法添加含10胎牛血清(Hyclone)的高糖DMEM(Hyclone)的胎猪成纤维细胞培养液分离 培养建立胎猪成纤维细胞系 ； 0026 2) 磷酸钙介导 pLentiLox 3.7 慢病毒表达载体及其包装组分 pMDLg、 pRSVREV 和 pVSVg 在 293T 细胞中组建成慢病毒颗粒， 12-16 小时后更换新鲜 293T 细胞培养液， 病毒 包装 48 小时后收集病毒液， 经超滤浓缩后添加到胎猪成纤维细胞培养板内， 细胞密度为 1.0104/cm2； 0027 。
19、3) 在胎猪成纤维细胞培养板内添加含终浓度为 10g/ml Polybrene(Sigma) 的 胎猪成纤维细胞培养液， 此后， 每天收集含慢病毒的 293T 细胞培养液， 添加到胎猪成纤维 细胞培养板中感染胎猪成纤维细胞 2 次 ； 0028 4) 将胎猪成纤维细胞培养板内的培养液更换为含 15胎牛血清 (Hyclone) 的高 糖DMEM(Hyclone)培养液的猪诱变细胞培养液， 同时再连续收集含慢病毒的293T细胞培养 液 2 天， 并让所收集的慢病毒继续感染胎猪成纤维细胞 2 次 ； 0029 5) 当胎猪成纤维细胞中的细胞形态出现集落变化后， 将细胞集落经 1mg/ml Dispa。
20、se II(Roche) 消化后接种到经丝裂霉素处理的 12.5 天的小鼠胎儿成纤维细胞饲养 层上， 37.5、 5 CO2饱和湿度下培养 ； 经 4 次感染后 1 周在小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上 形成鸟巢状猪干细胞集落。 0030 3 猪诱变细胞的鉴定 ： 0031 核型分析 ： 0.1g/ml 秋水仙素 (Sigma) 处理发生诱变的猪细胞集落 2.5 小时， 胰 酶消化并重悬于 0.075mol/L KCL， 37孵育 25 分钟， 固定液 ( 甲醇冰醋酸 3 1) 固 定 10 分钟， 离心固定重复 3 次 ； 收获细胞， 滴片， Gimsa 染色， 空气干燥， 封片。显微镜下观 察及。
21、应用相关软件分析染色体配对。 0032 免疫荧光检测 ： 细胞经 4多聚甲醛固定， 1牛血清白蛋白 (BSA) 室温封闭 30 分钟， 添加一抗为兔抗 Oct 4(Abcam)、 山羊抗 Nanog(R&D)、 鼠抗 SSEA-1(Chemicon)、 鼠抗 说 明 书 CN 102174466 A CN 102174470 A4/4 页 6 SSEA-3(R&D)、 鼠抗 SSEA-4(R&D)、 鼠抗 TRA-1-60(Chemicon)、 鼠抗 TRA-1-81(Chemicon)， 按 1 200 稀释后 4孵育过夜。PBS 洗 3 次， CY3 红色荧光标记的二抗按 1 200 稀释。
22、后室 温避光孵育 1 小时， PBS 洗 3 次， 用 1g/mL 的 DAPI(Roche) 进行细胞核染色 1 分钟后荧光 镜下观察结果。 0033 碱性磷酸酶染色 ： 用 4多聚甲醛固定细胞， 添加碱性磷酸酶染液进行染色， 以胞 浆着色为红棕色或咖啡色颗粒为阳性。 0034 体内分化检测 ： 胰酶消化发生诱变的猪细胞集落， 无血清高糖 DMEM 培养液重悬细 胞后注射到免疫缺陷鼠 (BALB/C) 背侧皮下， 肿瘤组织块形成后颈部脱臼处死裸鼠， 取肿瘤 组织块 4多聚甲醛固定后进行苏木精伊红 (HE) 染色。 0035 4 结果 ： 0036 胎猪成纤维细胞经过慢病毒感染 1 轮后， 荧。
23、光显微镜下可见大部分的细胞强表达 绿色荧光蛋白， 细胞形态仍为纤维状。对铺满培养皿的细胞进行常规消化传代， 再经过 2-4 次的慢病毒感染， 在纤维状的胎猪成纤维细胞中有部分细胞开始改变原有的纤维状形态， 细胞逐渐收缩变圆并增殖形成细胞集落。用 DispaseII 消化离心收集的圆球形细胞接种到 饲养层细胞上， 2天后在饲养层细胞上逐渐形成边界明显的集落状细胞克隆。 细胞克隆经过 传代培养后细胞集落边界清晰， 且传代后的细胞生长速度较快， 在14传代的情况下细胞 克隆大约每隔 3-4 天传代 1 次， 常规的细胞冻存复苏不影响细胞的生长状态。高倍显微镜 下细胞集落中单个细胞表现为细胞核较大， 。
24、核质比例较高， 伴随着细胞传代的增加， 绿色荧 光蛋白在细胞克隆中稳定和强表达， 相同条件下未经慢病毒感染的胎猪成纤维细胞未出现 细胞集落的形态变化。多聚甲醛固定的细胞集落经碱性磷酸酶染液作用后， 细胞集落碱性 磷酸酶染色呈强阳性， 主要表现为细胞集落呈棕红色或紫红色， 相同条件下小鼠胎儿成纤 维细胞饲养层呈阴性。对培养传至第 4 代的细胞集落进行核型分析检测， 细胞的染色体数 为38， 核型正常。 使用Oct4和Nanog等干细胞相关抗体对慢病毒作用形成的细胞集落进行 检测分析发现， 细胞集落 Oct4、 Nanog 和 SSEA-1 蛋白表达为阳性。细胞集落注射入 BALB/C 免疫缺陷鼠腹部背侧皮下 6 周后能够形成明显的肿瘤团块， 对肿瘤组织进行 HE 染色显示， 在肿瘤组织内分布有类似神经、 消化管腔、 软骨、 肌肉等来自外胚层、 中胚层、 内胚层相关三 个胚层来源的细胞或组织。 说 明 书 CN 102174466 A 。