用于检测骨髓异常增生综合征MDS基因突变的引物、试剂盒及方法.pdf

《用于检测骨髓异常增生综合征MDS基因突变的引物、试剂盒及方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《用于检测骨髓异常增生综合征MDS基因突变的引物、试剂盒及方法.pdf（20页完整版）》请在专利查询网上搜索。

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610834589.4 (22)申请日 2016.09.20 (71)申请人 上海荻硕贝肯医学检验所有限公司 地址 201318 上海市浦东新区紫萍路908弄 21号 (72)发明人 郑仲征杜金伟徐玉尚郁晓晨 杨兰安雪茹余凯潘捷 杜可明王宁娟胡莹 (74)专利代理机构 北京迎硕知识产权代理事务 所(普通合伙) 11512 代理人 张群峰吕良 (51)Int.Cl. C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 用于检测骨髓异。

2、常增生综合征MDS基因突变 的引物、 试剂盒及方法 (57)摘要 本发明属于基因工程技术领域， 公开了一种 用于检测骨髓异常增生综合征(MDS)基因突变的 引物组合、 含有该引物组合的试剂盒以及检测 MDS基因突变的方法。 本发明针对常见的四种MDS 基因， 设计了能够高效特异性扩增这四种基因的 引物序列， 具有高度的特异性。 本发明设计的所 有引物的退火温度均为58， 可以使用同一个 PCR程序一次完成扩增反应。 本发明所呈现的测 序峰图背景清晰、 信号值高， 大大降低了对突变 的分析难度， 并且本发明设计的引物、 试剂盒以 及检测方法成本经济， 特异性强。 权利要求书1页 说明书16页 附。

3、图2页 CN 106566875 A 2017.04.19 CN 106566875 A 1.一种用于检测骨髓异常增生综合征(MDS)基因突变的引物组合， 其由SEQ ID NO.1- 30所示的引物组成， 所述MDS基因为SF3B1、 ASXL1、 SRSF2和DNMT3A。 2.根据权利要求1所述的引物组合， 其进一步由第1-4组引物组成， 其中第1组由SEQ ID NO.1-6所示的引物组成， 第2组由SEQ ID NO.7-24所示的引物组成， 第3组由SEQ ID NO.25- 28所示的引物组成， 第4组由SEQ ID NO.29-30所示的引物组成。 3.根据权利要求1或2所述的。

4、引物组合， 其中每条引物的浓度均为5 M。 4.一种用于检测MDS基因突变的试剂盒， 其包含权利要求1-3中任一项所述的引物组 合， 所述MDS基因为SF3B1、 ASXL1、 SRSF2和DNMT3A。 5.根据权利要求4所述的试剂盒， 其中每条引物的浓度均为5 M。 6.权利要求1-3中任一项所述的引物组合在制备检测MDS基因突变的试剂盒中的应用， 所述MDS基因为SF3B1、 ASXL1、 SRSF2和DNMT3A。 7.权利要求1-3中任一项所述的引物组合， 或者权利要求4或5中所述的试剂盒在检测 MDS基因突变中的应用， 所述MDS基因为SF3B1、 ASXL1、 SRSF2和DNM。

5、T3A。 8.一种检测MDS基因突变的方法， 其包含以下步骤： (1)获取待测样品DNA； (2)采用权利要求1-3中任一项所述的引物组合， 或采用权利要求4或5中所述的试剂 盒， 以步骤(1)中获取的DNA为模板， 进行PCR扩增； (3)对PCR扩增产物进行Sanger测序； (4)得到测序峰图后， 进行结果判读， 获得待测样品中MDS基因突变的种类； 所述MDS基因为SF3B1、 ASXL1、 SRSF2和DNMT3A。 9.根据权利要求8所述的方法， 其中步骤(2)中每条引物的浓度均为5 M。 10.根据权利要求8或9所述的方法， 其中步骤(3)中还包括测序反应后进行纯化以及进 行变性。

6、处理的步骤。 权利要求书 1/1 页 2 CN 106566875 A 2 用于检测骨髓异常增生综合征MDS基因突变的引物、 试剂盒及 方法 技术领域 0001 本发明涉及基因工程技术领域， 具体涉及用于检测骨髓异常增生综合征MDS基因 突变的引物、 试剂盒及方法。 背景技术 0002 骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome， MDS)是一组以骨髓病态造血、 无效造血和高风险白血病转化为特征的造血干细胞克隆性疾病。 临床以病态发育的血细胞 形态学、 细胞遗传学异常， 外加在多数病例中有原始细胞数不同程度的增多和血细胞减少 症的存在为主要特征。 目前MDS的治疗主要。

7、解决两大问题： 骨髓衰竭及并发症和AML转化。 0003 随着MDS中越来越多的基因异常被发现以及分子生物学技术的不断发展， 其发病 机制中多种分子标志物也逐渐被揭示。 其中， 多种基因被发现与MDS向急性髓系白血病转化 密切相关。 近年来， 有研究显示RNA剪接因子3B第一亚单位(splicing factor 3B subunit 1， SF3B1)基因突变与MDS患者环状铁幼粒细胞的出现密切相关。 另外， 富含丝氨酸/精氨酸 剪接因子2(serine/arginine-rich splicing factor， SRSF2)也被报道与MDS发病密切相 关， 该基因突变提示患者可能预后不良。

8、， 并较未突变者有更高的向AML转化的几率。 与DNA甲 基化密切相关的DNMT3A的突变多预示着较差的总生存率， 并可能更快地向AML转化。 此外， 调节组蛋白合成的ASXL1的框移突变被证实为MDS预后不良的分子标志。 0004 对MDS进行多基因检测可能有助于其诊断及进行进一步危险分层， 最终实现更为 精确的个体化治疗。 由于与MDS发病相关的基因突变较多， 因而检测方法不一， 主要包括直 接测序、 实时荧光定量PCR、 高分辨率溶解曲线等。 相较于其他检测方法， 直接测序能够对需 要检测样本的相关基因序列进行精确测序， 从而分析相关基因是否发生突变， 具有简便、 准 确且适合批量操作的。

9、特点。 目前有不少关于直接测序检测MDS相关基因突变的报道， 然而往 往由于引物特异性不是很好， 造成测序峰图有较高背景峰， 从而对突变的判断造成一定困 难。 因此， 目前亟需一种快速、 灵敏、 成本经济的对MDS常见4种基因(SF3B1、 ASXL1、 SRSF2、 DNMT3A)突变进行检测的方法。 发明内容 0005 本发明针对现有技术中存在的上述缺陷， 根据GenBank最新公布的基因序列， 重新 设计了检测MDS常见4种基因突变的引物， 并在此基础上设计了对这4种基因突变进行检测 的方法。 本发明的方法快速、 简便、 准确、 灵敏、 直观， 且实验成本低。 0006 为此， 本发明一。

10、方面提供了一种用于检测骨髓异常增生综合征(MDS)基因突变的 引物组合， 其由SEQ ID NO.1-30所示的引物组成， 所述MDS基因为SF3B1、 ASXL1、 SRSF2和 DNMT3A。 0007 在本发明优选的实施方案中， 该引物组合进一步由第1-4组引物组成， 其中第1组 由SEQ ID NO.1-6所示的引物组成， 第2组由SEQ ID NO.7-24所示的引物组成， 第3组由SEQ 说明书 1/16 页 3 CN 106566875 A 3 ID NO.25-28所示的引物组成， 第4组由SEQ ID NO.29-30所示的引物组成。 0008 在本发明进一步优选的实施方案中。

11、， 每条引物的浓度均为5 M。 0009 本发明另一方面提供了一种用于检测MDS基因突变的试剂盒， 其包含本发明所述 的引物组合， 所述MDS基因为SF3B1、 ASXL1、 SRSF2和DNMT3A。 0010 在本发明优选的实施方案中， 每条引物的浓度均为5 M。 0011 本发明另一方面提供了本发明所述的引物组合在制备检测MDS基因突变的试剂盒 中的应用， 所述MDS基因为SF3B1、 ASXL1、 SRSF2和DNMT3A。 0012 本发明再一方面提供了本发明所述的引物组合， 或者本发明所述的试剂盒在检测 MDS基因突变中的应用， 所述MDS基因为SF3B1、 ASXL1、 SRSF。

12、2和DNMT3A。 0013 本发明最后一方面提供了一种检测MDS基因突变的方法， 其包含以下步骤： 0014 1、 获取待测样品DNA。 0015 2、 采用本发明所述的引物组合， 或采用本发明所述的试剂盒， 以步骤1中获取的 DNA为模板， 进行PCR扩增。 0016 3、 对PCR扩增产物进行Sanger测序。 0017 4、 得到测序峰图后， 进行结果判读， 获得待测样品中MDS基因突变的种类。 0018 所述MDS基因为SF3B1、 ASXL1、 SRSF2和DNMT3A。 0019 在本发明优选的实施方案中， 步骤2中每条引物的浓度均为5 M。 0020 在本发明进一步优选的实施方。

13、案中， 步骤3中还包括测序反应后进行纯化以及进 行变性处理的步骤。 0021 由上述描述可知， 与现有技术相比， 本发明具备如下优点。 0022 1、 本发明根据GenBank最新公布的基因序列， 针对常见的四种MDS基因SF3B1、 ASXL1、 SRSF2和DNMT3A， 采用不同的引物设计， 设计了能够高效特异性地扩增这四种MDS基 因的引物序列， 具有高度的特异性。 0023 2、 本发明设计的所有引物的退火温度均为58， 可以使用同一个PCR程序一次完 成扩增反应。 PCR反应可以将四种基因的所需检测区域全部扩增出来， 然后进行测序， 并将 测得的序列与标准序列比对， 检测是否存在基。

14、因突变。 除了对比已确认的突变外， 还能发现 新的突变。 0024 3、 本发明采用Sanger测序法， 可检测MDS相关的四种基因突变， 而且本发明设计的 引物所扩增的产物覆盖所有待检测突变位点， 在很大程度上节省了检测时间及成本， 而且 结果更准确。 0025 综上所述， 本发明所呈现的测序峰图背景清晰、 信号值高， 大大降低了对突变的分 析难度， 并且本发明设计的引物、 试剂盒以及检测方法成本经济， 特异性强。 附图说明 0026 图1： ASXL1基因突变的测序峰图。 0027 图2： DNMT3A基因野生型与突变型的对比图。 具体实施方式 0028 下面通过实施例对本发明作进一步的详。

15、细说明， 旨在用于说明本发明而非限定本 说明书 2/16 页 4 CN 106566875 A 4 发明。 应当指出， 对于本领域技术人员而言， 在不脱离本发明原理的前提下， 还可以对本发 明进行若干改进和修饰， 这些改进和修饰也同样落入本发明的保护范围之内。 0029 实施例1： 设计用于检测MDS常见4种基因突变的PCR引物 0030 本实施例中， 根据GenBank最新公布的基因序列， 利用Primer Premier 5.0引物设 计软件设计PCR引物， 由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。 为了减少测序峰图底峰， 最大限度地保障了测序引物的纯度， 通过引物反应条件的优化和比较， 。

16、筛选出了特异性好 的引物。 按照上述引物设计原则， 本发明针对MDS常见4种基因突变所设计的具体引物情况 参见表1。 0031 表1： 四种基因的扩增及测序引物序列 0032 说明书 3/16 页 5 CN 106566875 A 5 0033 0034 实施例2： 制备用于检测MDS常见4种基因突变的试剂盒 0035 将合成的引物， PCR扩增反应液和测序体系进行分装后包装， 组成本发明试剂盒。 0036 其中， PCR扩增反应液包括， 10PCR Buffer、 2 .5mMdNTPs、 LA Taq DNA Polymerase、 ddH2O等。 0037 测序体系包括， PCR产物消化。

17、反应液： 虾碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatas ( S h r i m p) ) 和 外 切 酶 (E x o n u c l e a s e I ) 按 1 : 1 进 行 混 合 ； 测 序 反 应 液 ： Terminator V3.1cycle Sequencing Kit、 5Bigdye buffer； 测 序纯化液： EDTA(125mM)； 85无水乙醇； 75无水乙醇； HI-DI(高度去离子甲酰胺)。 0038 实施例3： 对样本中MDS基因突变进行检测 0039 按照以下具体步骤对样本中的MDS基因突变进行检测： 0040 1、 按照QIAamp DNA 。

18、Blood Mini kit试剂盒的方法提取样本DNA。 0041 2、 以上述DNA为模板， 和所述的PCR扩增引物进行PCR扩增反应， 得到PCR扩增产物。 0042 将所得的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖浓度为1.5)， 电压为140V， 时间为35min， 电泳结束后使用凝胶成像系统观察。 其中， PCR扩增体系参见表2。 0043 表2： PCR扩增体系 说明书 4/16 页 6 CN 106566875 A 6 0044 0045 PCR反应条件参见表3。 0046 表3： PCR反应条件 0047 0048 3、 Sanger测序 0049 每个PCR反应体系(25 L。

19、)加入1 L消化酶， 依靠Alkaline Phosphatase水解残余的 dNTP， Exonuclease I水解单链核酸从而去除双链DNA以外的杂质。 其消化反应条件参见表 4。 0050 表4： 消化反应条件 0051 温度时间 3760min 8015min 4 0052 得到PCR消化产物后， 进行Sanger测序反应， 其反应体系参见表5。 0053 表5： Sanger测序反应体系 说明书 5/16 页 7 CN 106566875 A 7 0054 0055 Sanger测序反应条件参见表6。 0056 表6： Sanger测序反应条件 0057 0058 4、 测序反应后。

20、纯化 0059 纯化操作前， 需预冷离心机至4。 此步骤是将测序反应体系中除目标单链核酸片 段之外的杂质尽可能地去除， 以减少之后3730毛细管电泳时杂质对峰图质量的影响。 0060 每5 L反应体系加入0.125mol/L EDTA-Na2溶液2 L， 85无水乙醇30 L， 盖上硅胶 垫， 充分振荡35分钟， 3000g， 4， 离心30分钟。 EDTA作为金属离子螯合剂， 能与测序PCR反 应体系里的离子结合从而去除离子。 0061 离心结束后， 倒离心至185g时立即停止。 每孔加入50 L 70无水乙醇， DNA片段在 70乙醇中溶解度低， 能通过离心沉淀下来。 盖上硅胶垫， 充分振。

21、荡3分钟， 3000g， 4， 离心 15分钟， 离心结束后再次倒离心。 然后将离心后产物放置避光通风处20分钟。 0062 5、 变性处理 0063 20分钟后， 在生物安全柜中操作， 每孔加入8 L HI-DI甲酰胺进行变性处理， 程序 参见表7。 0064 表7变性反应程序 说明书 6/16 页 8 CN 106566875 A 8 0065 温度时间 953min 4 0066 变性结束并冷却离心后， 上ABI3730测序仪测序。 0067 6、 结果分析 0068 得到测序峰图后， 经严格改名后加载入软件Variant ReporterTM software v1.1， 自动与Gen。

22、bank中相关基因野生型序列比对， 并同时有阴性对照进行控制， 根据实际突变情 况， 分析编码氨基酸的改变。 0069 图1为样本FG95中发现ASXL1突变的测序峰图， 此突变发生在非编码区域(Chr20: 32437360： AG)。 0070 图2为样本FG95中发现DNMT3A突变的测序峰图， 对比野生型(ZP)， 此突变为错义突 变(R827C)， 现有COSMIC数据库未见报道， 临床意义暂不明确。 0071 通过测序报告可发现本发明所呈现的峰图背景清晰、 信号值高， 大大降低了对突 变的分析难度， 且本发明设计的引物、 试剂与方法的检测成本经济， 特异性强。 说明书 7/16 页。

23、 9 CN 106566875 A 9 0072 说明书 8/16 页 10 CN 106566875 A 10 0073 说明书 9/16 页 11 CN 106566875 A 11 0074 说明书 10/16 页 12 CN 106566875 A 12 0075 说明书 11/16 页 13 CN 106566875 A 13 0076 说明书 12/16 页 14 CN 106566875 A 14 0077 说明书 13/16 页 15 CN 106566875 A 15 0078 说明书 14/16 页 16 CN 106566875 A 16 0079 说明书 15/16 页 17 CN 106566875 A 17 0080 说明书 16/16 页 18 CN 106566875 A 18 图1 说明书附图 1/2 页 19 CN 106566875 A 19 图2 说明书附图 2/2 页 20 CN 106566875 A 20 。