技术领域
本发明涉及一株重组鸡alpha干扰素温控表达载体的构建。属于兽用生物制品领域。
背景技术
鸡的病毒性疾病是危害养鸡业最为严重的疾病之一。目前，我国预防和控制鸡病毒性疾病主要依靠疫苗免疫，由于疫苗免疫的血清型单一，而病毒毒株变异速度快，从而常导致疫苗免疫失败。鸡alpha干扰素(chIFN-α)作为一种多功能细胞因子，具有广泛的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等生理功能，其不仅对鸡的病毒性疾病如新城疫、传染性法氏囊炎、传染性喉气管炎和传染性支气管炎等具有良好的治疗效果，而且能够显著提高疫苗的免疫效力。此外，干扰素相比于抗生素具有无毒副作用、无药物残留和不产生耐药性等优点，因此chIFN-α产品的研发对鸡病毒性疾病的预防和治疗具有重要的临床意义。
目前chIFN-α产品的研发方法主要包括诱生剂诱导免疫细胞提取干扰素蛋白法和基因工程技术表达干扰素蛋白两种方法。诱生剂诱导免疫细胞提取干扰素蛋白法生产的干扰素产品面临两个问题：一是大量生产必须保证有足够数量的外周血白细胞，二是以病毒作为诱生剂存在潜在病毒污染的情况。此外，这种方法提取的干扰素产量有限、产物成分复杂、价格昂贵，从而限制了其在临床上的应用。以基因工程技术为依托生产的基因重组鸡干扰素产品因产物成分单一、操作简单、产量高和适应于大规模生产等特点而得到了广泛的应用。
基因重组chIFN-α的表达系统根据表达宿主的不同分为原核表达系统、酵母表达系统、哺乳细胞表达系统和昆虫表达系统。其中原核表达系统相比于其他的表达系统具有遗传背景清楚、培养操作简单、转化效率高、生长繁殖快、成本低廉等优点成为重组基因工程chIFN-α大规模工业生产的优选表达系统。而大肠杆菌因具有操作简单和能在廉价的培养基中迅速生长的特征，成为原核表达系统首选的表达菌株。常用于基因重组蛋白表达的大肠杆菌菌株包括DH5α、BL21和JM系列；常用的大肠杆菌表达载体有pBV220、pBV321、pET28a和pET32a等。其中pBV220表达载体属于温度敏感系统表达载体，该载体的启动子为PL和PR强启动子，该启动子受λ噬菌体CI基因负调控，当温度达到42℃时宿主菌表达目的蛋白。pET28a和pET32a表达载体的启动子为lac强启动子，该启动子受大肠杆菌lac阻遏蛋白负调控，需要在异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下表达目的蛋白。与IPTG诱导宿主菌表达目的蛋白不同，温控表达载体只需要调节温度即可实现目的蛋白的大量表达，因此其大大节省了大规模工业生产的成本。
发明内容
本发明的目的是基于基因重组chIFN-α蛋白研发的重要临床意义和社会价值，选择pBV220载体为表达载体，以DH5α大肠杆菌为宿主菌构建chIFN-α-pBV220重组菌株并在42℃条件下诱导该菌株表达chIFN-α蛋白。
本发明技术方案
1.一株重组鸡alpha干扰素温控表达载体，其特征在于该重组温控表达载体为chIFNα-pBV220重组温控表达载体，该重组温控表达载体中连接有重组chIFN-α基因(序列1)，并转入DH5α大肠杆菌，该株菌被命名为重组大肠杆菌chIFN-α-pBV220株，简称重组大肠杆菌chIFN-α株，保藏编号为CGMCC No.13431。
2.本发明所述一株重组鸡alpha干扰素温控表达载体的构建，其特征在于该载体的构建是：
(1)以SPF鸡外周血淋巴细胞cDNA为模板扩增出chIFN-α目的基因片段；
(2)回收并纯化目的基因片段经测序，测序结果确认表明该PCR产物为chIFN-α目的基因；
(3)将经双酶切的pBV220温控表达载体与步骤(2)中的目的基因片段连接获得重组chIFNα-pBV220载体；
(4)将重组chIFNα-pBV220温控表达载体转入DH5α大肠杆菌后涂布含氨苄抗生素的琼脂平板，37℃培养过夜后挑取阳性克隆子经测序确认，获得构建重组chIFNα-pBV220温控表达载体，并转入DH5α大肠杆菌，该株菌被命名为重组大肠杆菌chIFN-α-pBV220株，简称重组大肠杆菌chIFN-α株，并已于2016年12月07日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13431。
本发明具体实施方式
1.根据NCBI核酸数据库中搜索编码chIFN-α蛋白的581bp核苷酸序列(GenBank:AM049251.1)在此基础上本发明人设计：在基因序列1的3’端终止密码子前添加组氨酸(His)标签以便于蛋白纯化，同时在目的片段两侧添加EcoR I和Sal I限制性内切酶位点用于获得线性化pBV220表达载体，然后通过Primer Premier 5分析软件分别设计反转录PCR中的特异性引物(序列1和2)和目的基因的上下游引物(序列3和4)，见表1。
表1反转录PCR引物序列和目的基因片段引物序列
2.以SPF鸡外周血淋巴细胞全RNA为目的基因片段模板。经对提取的鸡外周血淋巴细胞全基因组RNA用序列1和序列2进行反转录反应，并以序列3和序列4的上下游引物扩增出chIFN-α目的基因片段，结果见图2；回收并纯化目的基因片段送去测序，测序结果表明该PCR产物为chIFN-α目的基因，其序列为序列5。
3.双酶切pBV220温控表达载体(该载体属于温度敏感系统表达载体，pBV220质粒购自优宝生物)并将其与目的基因片段连接，连接产物热转化DH5α大肠杆菌后涂布含氨苄抗生素的琼脂平板，37℃培养过夜后挑取阳性克隆子送去测序。测序结果显示重组多克隆载体上目的基因片段核苷酸序列与NCBI上chIFN-α基因的核苷酸序列的匹配度为96％，表明本研究成功构建重组chIFNα-pBV220温控表达载体，并转化DH5α大肠杆菌。该株菌被命名为重组大肠杆菌chIFN-α-pBV220株(简称重组大肠杆菌chIFN-α株)，并已于2016年12月07日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13431。
4.通过调节温度实现目的蛋白的诱导表达，即将重组大肠杆菌chIFN-α-pBV220株菌迅速升温至42℃条件下诱导5h，实现目的蛋白的诱导表达；最后以细胞病变抑制法检测重组chIFN-α蛋白的生物学活性。
细胞病变抑制试验表明该菌株诱导表达的chIFN-α蛋白能够有效抑制水泡性口炎病毒(VSV病毒，2013年3月购自北京北纳创联生物技术公司)在人羊毛膜细胞(Wish细胞，2013年3月购自上海极威生物科技有限公司)上增殖，说明其具有良好的生物活性。根据Reed-Muench法计算该菌株诱导的chIFN-α蛋白生物学效价为2～5×105IU/ml。
附图说明
图1 chIFN-α目的基因PCR扩增产物经1.2％DNA琼脂糖凝胶检测结果图中Marker为DL2000DNA marker。
图2重组chIFN-α蛋白诱导表达结果图中M为Blue Plus Protein Marker(14-100KD)；1为pBV220空载体诱导表达样品；2为chIFN-α诱导表达蛋白样品；3为chIFN-α未诱导表达蛋白样品。
本发明涉及的生物材料资源信息
本发明人应用生物技术构建的pBV220温控表达载体构建的重组大肠杆菌chIFN-α-pBV220株菌作为生产菌株，并通过调节培养温度成功诱导表达具有生物活性的chIFN-α蛋白。该重组大肠杆菌chIFN-α-pBV220株已于2016年12月07日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13431。人羊毛膜细胞(Wish细胞，2013年3月购自上海极威生物科技有限公司，上海市崇明县上海泰和经济发展区长兴镇潘园公路1800号2号楼9703室；水泡性口炎病毒(VSV病毒，购自北京市朝阳区北三环东路北京北纳创联生物技术研究院)。
本发明的积极意义
本发明涉及一株重组鸡alpha干扰素温控表达载体的构建。本发明选择pBV220温控表达载体用于构建chIFN-α-pBV220重组菌株，该重组菌株通过调节培养温度成功诱导表达具有生物活性的chIFN-α蛋白。该重组菌株的构建使其表达的产品不仅能够提高大规模工业生产的效益也为鸡病毒性疾病的治疗和预防提供新药物的目的成为现实。
实施例
以下实施例为进一步说明本发明的技术方案，不对本发明要求保护的技术方案构成限制。
实施例1
——重组大肠杆菌chIFN-α-pBV220菌株构建
1.引物合成
根据NCBI核酸数据库中搜索编码chIFN-α蛋白的581bp核苷酸序列(GenBank:AM049251.1)在此基础上本发明人设计：在基因序列1的3’端终止密码子前添加组氨酸(His)标签以便于蛋白纯化，同时在目的片段两侧添加EcoR I和Sal I限制性内切酶位点用于获得线性化pBV220表达载体(pBV220载体购自优宝生物)，然后通过Primer Premier 5分析软件分别设计反转录PCR中的特异性引物(序列1和2)和目的基因的上下游引物(序列3和4)。
2.鸡外周血淋巴细胞分离
无菌采集SPF鸡外周血5ml置于抗凝剂中，按照鸡外周血淋巴细胞分离液试剂盒(北京索莱宝科技有限公司货号P8740)的使用说明书分离鸡外周血淋巴细胞。分离的淋巴细胞立即进行全基因组RNA提取。
3.全基因组RNA提取
按照TaKaRa RNAiso Plus Kit(Code No.9108Q)使用说明书提取鸡外周血淋巴细胞的全基因组RNA。
4.chIFN-α目的基因扩增
(1)使用TaKaRa PrimeScript TM RT-PCR Kit(Code No.RR014A)对提取的鸡外周血淋巴细胞全基因组RNA进行反转录反应。
以上反转录反应中使用的引物为：
上游引物chIFNα-RT-PCRf：5’-ACCAGGCTCC TGCCCAGCAC-3’20 (序列1)
下游引物chIFNα-RT-PCRr：5’-GAAGAATAAA TAGGCGTTTG-3’20 (序列2)
(2)取1.0μl RT-PCR反应产物按照TaKaRa Tks Gflex DNA Polymerase(Code No.R060A)操作说明书所列方法应用设计的引物4和5进行PCR反应，反应体系和反应条件分别见表2和表3。PCR反应结束后，取5μl反应产物进行1.2％DNA琼脂糖凝胶电泳。按照TaKaRa Mini BEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0(Code No.9762)使用说明书回收目的片段并测序。
上游引物chIFNα-PCRf：5’-AAATTAAGGA GAATTCATGG CTGTGCCTGC AAGCCC-3’36 (序列3)
下游引物chIFNα-PCRr：5’-TTGGCTGCAG GTCGACCTAA TGGTGATGGT GATGATGAGT GCGAGTGATA AATGTGA-3’57(序列4)
5.重组chIFN-α-pBV220质粒DH5α大肠杆菌菌株构建
用EcoRΙ和SalΙ限制性内切酶在37℃条件下双酶切pBV220质粒6h，反应体系见表4。双酶切后按照In-Fusion HD Cloning Kit(Clontech Code No.639648)使用说明书将回收的chIFN-α目的基因片段(即重组chIFN-α基因基因，其基因序列为序列1)和已线性化的pBV220质粒在50℃条件下连接15min，反应体系见表5。连接后取1μl连接产物热转化商品化的DH5α大肠杆菌并涂布含氨苄抗生素的营养琼脂平板，在37℃条件下培养过夜。挑取阳性克隆子测序后保种，该株菌被命名为重组大肠杆菌chIFN-α-pBV220株(简称重组大肠杆菌chIFN-α株)，并已于2016年12月07日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13431。
表2 chIFN-αPCR扩增反应体系
表3 chIFN-αPCR扩增反应条件
表4 pBV220质粒双酶切反应体系
表5目的基因片段与载体酶连接反应体系
序列5重组chIFN-α基因序列
注：加粗标记为组氨酸标签核苷酸序列
实施例2
——重组chIFN-α蛋白诱导表达
分别取重组chIFN-α-pBV220菌株和pBV220空载体菌株划线于含氨苄抗生素的营养琼脂平板上，37℃条件下培养过夜。调取单菌落接种于5ml含氨苄抗生素的LB培养基内，37℃条件下振荡培养过夜。取过夜培养的重组chIFN-α-pBV220大肠杆菌菌液和pBV220空载体大肠杆菌菌液按1/100的比例分别转接5ml含氨苄抗生素的LB培养基中，30℃条件下培养至OD600nm值为0.6～1.0后，立即将复壮的重组chIFN-α-pBV220菌株和pBV220空载体菌株迅速升温至42℃条件下诱导5h，同时设置未经诱导的重组chIFN-α-pBV220菌株作为阴性对照。诱导后的菌液和未诱导的重组菌液分别于常温4000r/min的条件下，离心10min。弃上清，沉淀用PBS缓冲溶液清洗两遍，然后取2ml PBS缓冲溶液重悬菌体，然后在700Hz，15s工作时间/15s间隔时间的条件下超声波破碎5min。取20μl 5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(上海歌凡生物科技有限公司货号：WB001))与80μl菌体破碎液混合后制样进行12％SDS-PAGE凝胶电泳，最后经考马斯亮蓝染色检测结果。
如果构建的重组大肠杆菌chIFN-α-pBV220株能够诱导表达鸡干扰素蛋白，在42℃诱导条件下重组菌株在19KD处能够表达目的蛋白，而空载体菌株由于没有目的基因片段，所以不能表达目的蛋白。同时未经42℃诱导表达的重组菌株在19KD处也无目的蛋白的表达。
chIFN-α蛋白诱导表达pBV220为温度敏感型表达载体，当培养温度为42℃时，能够诱导宿主菌表达目的蛋白。基于此，我们对重组chIFN-α-pBV220DH5α大肠杆菌进行温控诱导表达检测，考马斯亮蓝染色结果显示在42℃诱导5h条件下，该重组菌株能够在19KD处大量表达chIFN-α蛋白，而同样诱导条件的pBV220空载体菌株和未诱导的重组菌株在19KD处均无目的蛋白表达，结果见图2。
实施例3
——重组chIFN-α蛋白生物活性鉴定
Wish细胞消化后，以3.0×105个/ml细胞量铺96孔细胞培养板，100μl/孔。铺板后，置于37℃，5％二氧化碳培养箱培养24h。粗提取的重组chIFN-α蛋白作100倍稀释，以100倍稀释液为起始浓度作4倍系列稀释，共12个稀释度，每个稀释度做6个重复。取培养24h的Wish细胞，弃培养基，分别按100μl/孔量加干扰素样品和标准品到相应的细胞孔，然后置于37℃，5％二氧化碳培养箱继续培养24h。培养24h后，按100μl/孔量加入100TCID50的VSV稀释液到细胞孔中，然后置于37℃，5％二氧化碳培养箱培养。每组同时设置病毒对照组和正常细胞对照组。当病毒对照孔75％的细胞出现病变时判定各实验组结果，结果判定方法见表5。根据Reed-Muench法计算粗提取的重组chIFN-α蛋白的生物学活性。计算公式为干扰素效价＝干扰素半数细胞保护力稀释度×log4的值对log10的反对数。
表5细胞病变判断标准
重组chIFN-α大肠杆菌菌株能够在42℃条件下表达chIFN-α蛋白，但表达的目的蛋白是否具有生物活性即是否具有临床应用价值，还需要进一步的试验进行验证。因此，本研究采用经典细胞病变抑制法对重组chIFN-α-pBV220菌株表达的目的蛋白进行生物学活性检测。研究结果表明，该重组菌株表达的chIFN-α蛋白能够显著抑制VSV病毒对Wish细胞的侵染(Wish细胞购自购自上海极威生物科技有限公司)，结果见表6-8。
根据表6中的数据，按Reed-Muench法计算干扰素生物学活性。通过计算得出干扰素半数细胞保护力稀释度数值为4-3.6，表明粗提取的鸡alpha干扰素样品100倍稀释液再稀释到4-5.6时，就能保护半数细胞免受损伤。干扰素效价＝100×(5.6log4对log10的反对数)。通过查找对数及反对数表，得出该样品的生物学效价＝100×2352.5＝235250IU/ml。计算公式和具体的计算过程如下：距离比＝(高于50％感染百分数-50％)/(高于50％感染百分数-低于50％感染百分数)＝(100％-50％)/(100％-16.7％)＝50％/83.3％＝0.6。干扰素半数细胞保护力稀释度＝能够抑制50％细胞出现病变的干扰素最高稀释度的对数+距离比＝5+0.6＝5.6。
表6重组chIFN-α蛋白抑制VSV感染wish细胞显微镜下观察结果
根据表7中的数据，按Reed-Muench法计算干扰素生物学活性。通过计算得出干扰素半数细胞保护力稀释度数值为4-5.5，表明粗提取的鸡alpha干扰素样品100倍稀释液再稀释到4-5.5时，就能保护半数细胞免受损伤。干扰素效价＝100×(5.5log4对log10的反对数)。通过查找对数及反对数表，得出该样品的生物学效价＝100x 2048＝204800IU/ml。计算公式和具体的计算过程如下：距离比＝(高于50％感染百分数-50％)/(高于50％感染百分数-低于50％感染百分数)＝(77.8％-50％)/(77.8％-25.0％)＝27.8％/52.8％＝0.5。干扰素半数细胞保护力稀释度＝能够抑制50％细胞出现病变的干扰素最高稀释度的对数+距离比＝5+0.5＝5.5。
表7重组chIFN-α蛋白抑制VSV感染wish细胞显微镜下观察结果
根据表8中的数据，按Reed-Muench法计算干扰素生物学活性。通过计算得出干扰素半数细胞保护力稀释度数值为4-5.8，表明粗提取的鸡alpha干扰素样品100倍稀释液再稀释到4-5.8时，就能保护半数细胞免受损伤。干扰素效价＝100×(5.8log4对log10的反对数)。通过查找对数及反对数表，得出该样品的生物学效价＝100x 3104＝310400IU/ml。计算公式和具体的计算过程如下：距离比＝(高于50％感染百分数-50％)/(高于50％感染百分数-低于50％感染百分数)＝(88.9％-50％)/(88.9％-42.9％)＝38.9％/46.0％＝0.8。干扰素半数细胞保护力稀释度＝能够抑制50％细胞出现病变的干扰素最高稀释度的对数+距离比＝5+0.8＝5.8。
表8重组chIFN-α蛋白抑制VSV感染wish细胞显微镜下观察结果
附件：
一、鸡外周血淋巴细胞分离液试剂盒(北京索莱宝科技有限公司货号P8740)
操作步骤：
1.取新鲜抗凝全血(EDTA、枸橼酸钠或肝素抗凝均可)或者去纤维蛋白血液，用等体积的全血及组织稀释液或者PBS稀释全血。
2.在离心管中加入适量分离液(当稀释后血液体积小于3mL时，加入3mL分离液；大于等于3mL，加入等体积分离液。但二者的总体积不能超过离心管的三分之二，否则会影响分离效果)，将稀释后的血液平铺到分离液液面上方，注意保持两液面界面清晰。(可以使用巴氏德吸管吸取血液，然后将血液小心的平铺于分离液上，因为两者的密度差异，将形成明显的分层界面。如果样品较多加样时间较长，在离心之前出现红细胞成团下沉属正常现象。)
3.室温，水平转子500～1000g，离心20～30min(血液的体积越大所需的离心力越大，离心时间越长，最佳的分离条件需摸索，离心转速最大不超过1200g)。
4.离心后将出现明显的分层：最上层是稀释的血浆层，中间是透明的分离液层，血浆与分离液之间的白膜层即为淋巴细胞层，离心管底部是红细胞与粒细胞。
5.小心的吸取白膜层细胞到15mL洁净的离心管中，10mL PBS或细胞洗涤液洗涤白膜层细胞。250g，离心10min。
6.弃上清，5mL的PBS或细胞清洗液重悬细胞，250g，离心10min。
7.重复步骤6
8.弃上清，细胞重悬备用。
二、TaKaRa RNAiso Plus Kit(Code No.9108Q)使用说明书(提取鸡外周血淋巴细胞的全基因组RNA)
实验操作
1.RNAiso Plus的使用量情况如下：
2.
*1:从骨及软骨提取的RNA时，可选择High-Salt Solution for Precipitation(Plant)(Code No.9193)和RNAiso Plus配套使用
*2:从含有大量多糖的植物样本提取时，可选择for RNA Purification(Code No.9192)和RNAiso Plus配套使用
*3:从酵母中提取RNA时，可选择Yeast Processing Reagent(for total RNA preparation)(Code No.9089)和RNAiso Plus配套使用
2.实验样品的研磨和匀浆。
A.贴壁培养细胞
①倒出培养液，用1×PBS清洗一次。
②每10cm2生长的培养细胞中加入1-2ml的RNAiso Plus，轻微晃动，确保使裂解液均匀分布于细胞表面。
NOTE：对于贴壁牢固的培养细胞可用细胞刮勺剥离细胞。
③将内含细胞的裂解液转移至离心管中，用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀。
④室温(15-30℃)静置5min，然后从核蛋白中分离RNA。
B.悬浮培养细胞
①将悬浮培养细胞连同培养液一起倒入离心管中，8,000g 4℃离心2min，弃上清，注意不要破坏细胞沉淀。
②向每5×106个细胞中加入1ml的RNAiso Plus。
③用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀。④室温(15-30℃)静置5min，然后从核蛋白中分离RNA。
C.动物组织、植物材料样品
①将超低温冻结的RNA提取样品称量后迅速转移至用液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状(如果没有研磨彻底会影响RNA的收率和质量)。可以向研钵中加入与样品匀浆量匹配的适量的RNAiso Plus。对于新鲜的组织样品，立即加入RNAiso Plus，充分匀浆。
②将匀浆液转移至离心管中，室温(15-30℃)静置5min。
③12,000g 4℃离心5min。
④小心吸取上清液，移入新的离心管中(切勿吸取沉淀)。
3.Total RNA的提取。
①向上述步骤2的匀浆裂解液中加入氯仿(RNAiso Plus的1/5体积量)，盖紧离心管盖，混合至溶液乳化呈乳白色。
②室温静置5min。
③12,000g 4℃离心15min。从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，即：无色的上清液(含RNA)、中间的白色蛋白层(大部分为DNA)及带有颜色的下层有机相。
④吸取上清液转移至另一新的离心管中(切勿吸出白色中间层)。
⑤向上清中加入0.5-1倍RNAiso Plus体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，室温下静置10min。
⑥12,000g 4℃离心10min。一般在离心后，试管底部会出现RNA沉淀。
4.RNA沉淀的清洗。小心弃去上清,切勿触及沉淀，残留少量异丙醇没有关系。加入与RNAiso Plus等量的75％乙醇，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，7,500×g 4℃离心5min后小心弃去上清，切勿触及沉淀。
5.RNA的溶解。打开离心管盖，室温干燥沉淀几min。沉淀干燥后，加入适量的RNase-free水溶解沉淀。NOTE：不可以离心或加热干燥，否则RNA将会很难溶解。
三、TaKaRa PrimeScript TM RT-PCR Kit(Code No.RR014A)操作说明书(对提取的鸡外周血淋巴细胞全基因组RNA进行反转录)
实验操作
1.Template RNA变性及反转录反应
①配制下列反应混合液。
＊1合成cDNA的引物可结合实际情况从Oligo dT Primer、Random 6mers、Specific Primer中任选一种(对于Control RNA，使用R-1Primer)，请参照“反转录引物的选择”。
＊2Template RNA最多可加至8μl，当使用Total RNA时，最多可加至5μg(推荐使用量：100pg～1μg)。
②在PCR仪上进行变性、退火反应。
65℃5min.
立即放置冰上2min。
NOTE：变性、退火操作有利于模板RNA的变性以及反转录引物和模板的特异性退火，可提高反转录反应效率。
③在上述反应管中配制下列反转录反应液。
④在PCR仪上按下列条件进行反转录反应：
(30℃10min.)*3，42℃(～50℃)15～30min.，95℃5min.*4，4℃
＊3反转录反应引物为Random 6mers时进行，此操作可使Random 6mers在42℃(～50℃)和模板RNA充分退火、延伸，增加反转录效率。
＊4进行长片段DNA扩增时，为了保证1st strand cDNA完整，请进行70℃、15min的失活反应。
2.PCR反应。
①按下列组成配制PCR反应液。
＊5Positive Control RNA使用F-1Primer。
＊6Positive Control RNA使用R-1Primer。
NOTE：PrimeScript RTase对具有复杂二级结构的模板同样具有良好的延伸性能，通常可在42℃下进行反应。使用特异性下游引物进行反转录时，有时会因错配而产生非特异性扩增。此时可将温度升到50℃，可能会减少非特异性扩增。
②按照下面的反应条件进行反应。
一般反应条件。
(A)三步法PCR的反应条件：94℃30sec.，55～65℃30sec.，72℃1min./kb，共30cycles。
(B)两步法PCR的反应条件：98℃10sec.，68℃1min./kb，共30cycles。
Positive Control RNA*7的反应条件：94℃30sec.，60℃30sec.，72℃1min.共30cycles。
＊7在进行PCR扩增时使用Control Primer F-1和R-1引物，都可以得到462bp的PCR扩增产物。
●PCR反应条件
■退火温度Control RNA的退火温度设定为60℃，检测样品的适宜退火温度可以在55～65℃间进行研讨。有时也可将退火温度范围扩大到45～65℃进行研讨。
■延伸时间延伸时间根据目的片段的长度而改变，通常情况下TaKaRaExTaqHS在72℃时的设定标1kb/min.。
■循环圈数cDNA少时，可进行40～50cycles。
■使用本制品扩增得到的PCR产物3’端附有一个“A”碱基，因此可直接克隆于T-Vector中。也可以在末端平滑化和磷酸化后克隆到平滑末端载体，可使用Mighty Cloning Reagent Set(Blunt End)(Code No.6027)实现平滑末端的载体克隆。
四、TaKaRa Tks Gflex DNA Polymerase(Code No.R060A)操作说明书(进行PCR反应)。
操作流程
按照下列组分配制PCR反应液
注：酶等各种试剂在配制前请于冰上放置。
＊1：Mg2+1mM，dNTP各200μM
＊2：扩增10kb以上的长片段时，以终浓度0.2μM进行反应。
PCR反应条件
[3step PCR]：94℃1min.＊1,98℃10sec.,55or 60℃＊2 15sec.,68℃＊3 30sec./kb＊4
或[2step PCR]：94℃1min.＊1，98℃10sec.，68℃30sec./kb＊4
共30cycles。
＊1：扩增富含GC序列或长片段时，推荐进行94℃1min.预变性反应。
＊2：引物的Tm值(按照下面公式※计算)为55℃以上时→退火温度设定为60℃；
Tm值为55℃以下时→退火温度设定为55℃。
※Tm值的计算方法：Tm值(℃)＝[(nA+nT)×2]+[(nC+nG)×4]－5
＊3：进行3step PCR反应时，也将延伸温度设定为68℃。
＊4：对粗提样品进行扩增时，延伸时间设定为1min./kb。
◆PCR反应条件的选择
·扩增10kb以下DNA片段时，请先尝试3step PCR。
·对富含GC序列模板或扩增10kb以上DNA片段时，推荐使用2step PCR。
·无扩增产物或出现Smear、非特异性扩增产物时，请参考Troubleshooting内容进行调整。
五、TaKaRa Mini BEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0(Code No.9762)使用说明书(回收目的片段并测序)
操作方法
1.使用TAE缓冲液或TBE缓冲液制作琼脂糖凝胶，然后对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳。
2.在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。此时应注意尽量切除不含目的DNA部分的凝胶，尽量减小凝胶体积，提高DNA回收率。胶块超过300mg时，请使用多个Column进行回收，否则严重影响收率。注)切胶时请注意不要将DNA长时间暴露于紫外灯下，以防止DNA损伤。
3.切碎胶块。胶块切碎后可以加快操作步骤6的胶块溶解时间，提高DNA回收率。
4.称量胶块重量，计算胶块体积。计算胶块体积时，以1mg＝1μl进行计算。
5.向胶块中加入胶块溶解液Buffer GM，Buffer GM的加量如下表：
6.均匀混合后室温15-25℃溶解胶块(胶浓度较大或比较难溶时可以在37℃加热)。此时应间断振荡混合，使胶块充分溶解(约5～10min)。注)胶块一定要充分溶解，否则将会严重影响DNA的回收率。高浓度凝胶可以适当延长溶胶时间。
7.当凝胶完全溶解后，观察溶胶液的颜色，如果溶胶液颜色由黄色变为橙色或粉色，向上述胶块溶解液中加入3M醋酸钠溶液(pH5.2)10μl，均匀混合至溶液恢复黄色。当分离小于400bp的DNA片段时，应在此溶液中再加入终浓度为20％的异丙醇。
8.将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。
9.将上述操作步骤7的溶液转移至Spin Column中，12,000r/min离心1min，弃滤液。注)如将滤液再加入Spin Column中离心一次，以提高DNA的回收率。
10.将700μl的Buffer WB加入Spin Column中，室温12,000r/min离心30秒钟，弃滤液。注)请确认Buffer WB中已经加入了指定体积的100％乙醇。
11.重复操作步骤10。
12.将Spin Column安置于Collection Tube上，室温12,000r/min离心1min。
13.将Spin Column安置于新的1.5ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入30μl灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置1min。注)将灭菌蒸馏水或Elution Buffer加热至60℃使用时有利于提高洗脱效率。
14.室温12,000r/min离心1min洗脱DNA。
如果实验室备有适合于Spin Column接口的负压装置，可从上述操作步骤7以后进 行以下操作。
8.将试剂盒中的Spin Column插到负压装置的插口上。
9.将上述操作步骤7的溶液转移到Spin Column中，开启调节负压装置，缓慢吸走Spin Column中的溶液(流速控制在1滴/秒)。
10.向Spin Column中加入700μl的Buffer WB，吸尽Spin Column中溶液。注)请确认Buffer WB中已经加入了指定体积的100％乙醇。
11.重复操作步骤10，然后从负压装置上取下Spin Column，将其安置于Collection Tube上。12.室温12,000
r/min离心1min。
13.将Spin Column安置于新的1.5ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入30μl灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置1min。注)将灭菌蒸馏水或Elution Buffer加热至60℃使用时有利于提高洗脱效率。
14.12,000r/min离心1min洗脱DNA。
六、In-Fusion HD Cloning Kit(Clontech Code No.639648)使用说明书
1.按照以下的反应体系设计本次实验的连接反应体系：
注：如果加入体系中的载体和目的基因片段总体积大于7μl，反应的总体积要扩大一倍即20μl，其中5×In-Fusion HD Enzyme Premix的使用体积为4μl。
2.按照步骤(1)的反应体系将所有反应物加完后，混匀。
3.50℃条件下反应15min，然后将反应产物置于冰上。
4.取反应产物转化感受态细胞，如果不能立即转化则需将反应产物置于-20℃保存。
序列表
<110> 大连三仪动物药品有限公司
<120> 一株重组鸡alpha干扰素温控表达载体的构建
<130>
<160> 5
<170> Patentin version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 对人工序列的描述：反转录PCR中的特异性上游引物chIFNα-RT-PCRf
<400> 1
5’-ACCAGGCTCC TGCCCAGCAC-3’ 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 对人工序列的描述：反转录PCR中的特异性下游引物chIFNα-RT-PCRr
<400> 2
5’-GAAGAATAAA TAGGCGTTTG-3’ 20
<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 对人工序列的描述：扩增目的基因的上游引物chIFNα-PCRr
<400> 3
5’-AAATTAAGGA GAATTCATGG CTGTGCCTGC AAGCCC-3’ 36
<210> 4
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 对人工序列的描述：扩增目的基因的下游引物chIFNα-PCRr
<400> 4
5’-TTGGCTGCAG GTCGACCTAA TGGTGATGGT GATGATGAGT GCGAGTGATA AATGTGA-3’ 57
<210> 5
<211> 600
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 对人工序列的描述：重组chIFNα-基因核苷酸序列
<400> 5
ATGGCTGTGC CTGCAAGCCC ACAGCACCCA CGGGGGTACG GCATCCTGCT GCTCACGCTC 060
CTTCTGAAAG CTCTCGCCAC CACCGCCTCC GCCTGCAACC ACCTTCGCCC CCAGGATGCC 120
ACCTTCTCTC ACGACAGCCT CCAGCTCCTC CGGGACATGG CTCCCACACT ACCCCAGCTG 180
TGCCCACAGC ACAACGCGTC TTGCTCCTTC AACGACACCA TCCTGGACAC CAGCAACACC 240
CGGCAAGCCG ACAAAACCAC CCACGACATC CTTCAGCACC TCTTCAAAAT CCTCAGCAGC 300
CCCAGCACTC CAGCCCACTG GAACGACAGC CAACGCCAAA GCCTCCTCAA CCGGATCCAC 360
CGCTACACCC AGCACCTCGA GCAATGCTTG GACAGCAGCG ACACGCGCTC CCGGACGCGA 420
TGGCCTCGCA ACCTTCACCT CACCATCAAA AAACACTTCA GCTGCCTCCA CACCTTCCTC 480
CAAGACAACG ATTACAGCGC CTGCGCCTGG GAACACGTCC GCCTGCAAGC TCGTGCCTGG 540
TTCCTGCACA TCCACAACCT CACATTTATC ACTCGCACTC ATCATCACCA TCACCATTAG 600