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1、(10)申请公布号 CN 102140134 A (43)申请公布日 2011.08.03 CN 102140134 A *CN102140134A* (21)申请号 201110025364.1 (22)申请日 2011.01.24 C07K 14/415(2006.01) C12N 15/29(2006.01) C12N 15/63(2006.01) C12N 5/10(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (71)申请人 北京工商大学 地址 100048 北京市阜成路 11 号北京工商 大学化工学院 (72)发明人 王昌涛 李秀婷 王静 孙啸涛 王成涛 李小鹏 (54。
2、) 发明名称 玉米脱水应答元件结合蛋白 ZmDBP2 及其编 码基因 (57) 摘要 本发明公开了一种脱水应答元件结合蛋白及 其编码基因。本发明的脱水应答元件结合蛋白是 具有序列表中 SEQ ID ： 2 氨基酸残基序列的蛋 白质， 或者是将 SEQ ID ： 2 的氨基酸残基序列 经过一个或几个氨基酸残基的取代、 缺失或添加 且具有与 SEQ ID ： 2 的氨基酸残基序列相同活 性的由 SEQ ID ： 2 衍生的蛋白质。实验证明本 发明的ZmDBP2在干旱、 高盐、 低温和ABA的诱导下 表达， 并且可以特异的调控含有 DRE/CRT 顺式元 件 ( 核心序列 ： CCGAC) 的基因的。
3、转录表达。本发 明的 ZmDBP2 为人为控制抗逆和耐逆相关基因的 表达提供了基础， 将在培育抗逆性和耐逆性增强 的植物育种中发挥重要的作用。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 9 页 序列表 3 页 附图 3 页 CN 102140139 A1/1 页 2 1. 一种脱水应答元件结合蛋白， 是具有序列表中 SEQ ID ： 2 氨基酸残基序列的蛋白 质， 或者是将 SEQ ID ： 2 的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、 缺失或 添加且具有与 SEQ ID ： 2 的氨基酸残基序列相同活性的由 SEQ。
4、 ID ： 2 衍生的蛋白质。 2. 根据权利要求 1 所述的蛋白质， 其特征在于 ： 所述蛋白质具有序列表中 SEQ ID ： 2 的氨基酸残基序列。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述的蛋白质， 其特征在于 ： 所述 SEQ ID ： 2 的自氨基端第 166 位 -2235 位氨基酸残基序列为保守的 AP2/EREBP 结构域。 4. 一种脱水应答元件结合蛋白编码基因， 是下列核苷酸序列之一 ： 1) 序列表中 SEQ ID ： 1 的 DNA 序列 ； 2) 编码序列表中 SEQ ID ： 2 蛋白质序列的多核苷酸 ； 3)与序列表中SEQ ID ： 1限定的DNA序列具有90以上同。
5、源性， 且编码相同功能蛋 白质的 DNA 序列。 5. 根据权利要求 4 所述的基因， 其特征在于 ： 所述基因具有序列表中序列 1 的 DNA 序 列。 6. 根据权利要求 5 所述的基因， 其特征在于 ： 所述基因的开放阅读框架为自 5端第 115 位 -1186 位碱基。 7. 含有权利要求 4、 5 或 6 所述基因的表达载体。 8. 含有权利要求 4、 5 或 6 所述基因的细胞系。 9. 扩增权利要求 4、 5 或 6 所述基因中的任一片段的引物对。 权 利 要 求 书 CN 102140134 A CN 102140139 A1/9 页 3 玉米脱水应答元件结合蛋白 ZmDBP2。
6、 及其编码基因 技术领域 0001 本发明涉及植物中一种与胁迫相关的转录因子及其编码基因， 特别涉及一种脱水 应答元件结合蛋白及其编码基因。 背景技术 0002 干旱、 高盐及高温等逆境胁迫是影响玉米生长、 发育的障碍因子。因此， 了解玉米 对逆境条件的应答与信号传导机制， 提高玉米品种的抗逆性， 成为玉米遗传研究及玉米品 种改良的重要任务之一。 0003 在逆境胁迫下植物体内会产生一系列应答反应， 伴随着许多生理生化及发育上的 变化。明确植物对逆境的反应机制， 将为抗逆基因工程研究和应用提供科学论据。目前， 植 物抗逆性研究已逐渐深入到细胞、 分子水平， 并与遗传学和遗传工程研究相结合， 探。
7、索用生 物技术来改进植物生长特性， 其目的是提高植物对逆境的适应能力。 0004 在干旱、 高盐和高温等环境胁迫的逆境条件下， 植物能够在分子、 细胞和整体水平 上做出相应的调整， 以最大程度上减少环境所造成的伤害并得以生存。许多基因受胁迫诱 导表达， 这些基因的产物不仅能够直接参与植物的胁迫应答， 而且能够调节其它相关基因 的表达或参与信号传导途径， 从而使植物避免或减少伤害， 增强对胁迫环境的抗性。 与胁迫 相关的基因产物可以分为两大类 ： 第一类基因编码的产物包括离子通道蛋白、 水通道蛋白、 渗透调节因子(蔗糖、 脯氨酸和甜菜碱等)合成酶等直接参与植物胁迫应答的基因产物 ； 第 二类基因。
8、编码的产物包括参与胁迫相关的信号传递和基因表达调节的蛋白因子， 如蛋白激 酶、 转录因子等。其中， 转录因子在植物胁迫应答的基因表达调控中起着重要作用。 0005 转录因子也称为反式作用因子， 是能够与真核基因启动子区域中顺式作用元件发 生特异性作用的 DNA 结合蛋白， 通过它们之间以及与其它相关蛋白之间的相互作用， 激活 或抑制转录。转录因子的 DNA 结合区决定了它与顺式作用元件结合的特异性， 而转录调控 区决定了它对基因表达起激活或是抑制作用。此外， 其自身活性还受到核定位及寡聚化等 作用的影响。 0006 目 前 已 知 在 植 物 中 与 胁 迫 相 关 的 转 录 因 子 主 要。
9、 有 ： 具 有 AP2 结 构 域 的 AP2(APETALA2)/EREBP( 乙烯应答元件结合蛋白， ethylene responsive element binding protein) 转录因子家族、 含有碱性区域和亮氨酸拉链的 bZIP(basic region/leucine zipper motif transcription factors)类转录因子、 含有保守的WRKY氨基酸序列的WRKY 转录因子家族、 含有碱性螺旋 - 环 - 螺旋 (bHLH) 和亮氨酸拉链的 MYC 家族和具有色氨酸簇 (Trp cluster) 的 MYB 家族。这五个转录因子家族， 除 WR。
10、KY 家族不参与植物的水胁迫反应 外， 其它四个家族均参与调节植物对干旱、 高盐等的逆境胁迫反应。其中， AP2/EREBP 类转 录因子在高等植物中广泛存在， 它是植物所特有的一类转录因子， 近年来， 在拟南芥、 烟草、 玉米、 水稻、 大豆和油菜中均有报道， 这表明 AP2/EREBP 类转录因子在高等植物中普遍存在 并具有重要作用。 0007 DREB( 脱水应答元件结合蛋白， DRE-binding protein) 类转录因子是 AP2 家族中 说 明 书 CN 102140134 A CN 102140139 A2/9 页 4 EREBP-like 亚家族中 的一个成员。DREB 。
11、和 EREBP 类转录因子它们在氨基酸序列上没有显 著的相同性， 但都含有一段非常保守的由58个左右氨基酸组成的DNA结合区域(EREBP/AP2 结构域 )。蛋白质三维分析表明， 该区域含有 3 个 - 折叠， 对识别各类顺式作用元件起关 键作用。 其中位于第二个-折叠中的第14、 19位的两个氨基酸残基的差异， 决定这类转录 因子与不同顺式作用元件的特异结合。DREB 类转录因子第 14 位氨基酸是缬氨酸 (V14)， 第 19 位氨基酸是谷氨酸 (E19)， 其中第 19 位的氨基酸并不保守， 例如水稻的 OsDREB1 转录因 子的第 19 位氨基酸就是缬氨酸 (Dubouzet JG。
12、， Sakuma Y， Ito Y， Kasuga M， Dubouzet EG， Miura S， SekiM， Shinozaki K， Yamaguchi-Shinozaki K， 2003)。在 DREB 相关蛋白中决定 DNA 结合的特异性方面， V14 的作用明显要比 E19 重要 (Sakuma Y， Liu Q， Dubouzet JG， Abe H， Shinozaki K and Yamaguchi-ShinozakiK， 2002) ； 而ERF类转录因子第14位氨基酸是甘 氨酸， 第 19 位是天冬氨酸， 因而 DREB 特异结合 DRE/CRT 顺式元件， ERF 特。
13、异结合 GCC- 盒。 AP2/EREBP结构域的C-端区还包含1个由18个氨基酸残基组成的核心序列， 该序列形成双 亲性的 - 螺旋， 该 - 螺旋可能参与同其它转录因子及 DNA 间的相互作用。 0008 目前， 在许多植物中都发现这种含有 EREBP/AP2 结构域的转录因子， 并分别与抗 病、 抗逆等信号传递有关 ( 刘强， 赵南明， Yamaguchi-Shinozaki K， Shinozaki K， 2000)。刘 强等认为， 一个 DREB 基因可以调控多个与植物干旱、 高盐及低温耐性有关的功能基因的表 达 ( 刘强， 赵南明， Yamaguchi-Shinozaki K， S。
14、hinozaki K， 2000)。Kasuga 等的研究证实， 导入到拟南芥的 DREB1A 基因可以同时促进与逆境胁迫耐性有关的基因 rd29、 rd17、 kin1、 cor6.6、 cor15a 以及 erd10 的表达， 转基因植株的抗逆性大大增强 (KasugaM， Liu Q， Miura S， Yamaguchi-Shinozaki K， Shinozaki K.， 1999)。同样， 低温耐性转录因子 CBF1 的转基因 植株的耐低温能力有显著提高 (Jaglo-Ottosen KR， Gilmour SJ， Zarka DG， Schabenberger O， Thomas。
15、how MF.， 1998)。 由于植物的逆境耐性是由多基因调控的复杂性状， 依靠导入单个 功能性蛋白基因很难实现植物抗逆性的综合提高。因此， 利用一个关键性转录因子促进多 个功能基因的表达， 从而增强植物的抗逆性， 已经成为植物抗逆基因工程的研究热点。 0009 根据含 DNA 结合区的数目， AP2/EREBP 转录因子分为 AP2(APETALA2) 和乙烯应答 元件结合蛋白 EREBP(ethylene-responsive element binding protein) 以及 RAV 三个大 类型。AP2 型转录因子包括拟南芥的 AP2、 ANT， 玉米的 Glossy、 idsl。
16、 等。这种类型的转录 因子含有两个 AP2/EREBP 结构域， 调节细胞的生长发育， 在拟南芥中已发现 14 个 AP2 型转 录因子基因 ； EREBP 型转录因子仅含 1 个 AP2/EREBP 结构域， 调节植物对激素 ( 乙烯 )、 病 原、 低温、 干旱及高盐等地分子应答反应。EREBP 型转录因子中， 已发现有烟草 EREBP1-4、 番茄 Pti4-6、 拟南芥 RAV1-2、 AtEBP、 AtERF1-5、 DREB1A-C(CBF1-3) 和 DREB2A-B 等许多成 员， 分别与细胞发育、 激素、 抗病、 低温及干旱、 高盐等信号传递有关。这些 EREBP 型转录 因。
17、子又可以再分为 ： EREBP(ethylene-responsive element binding protein， 即 ERF) 亚 组， 包括烟草 EREBP1-4、 番茄 Pti4-6、 拟南芥 AtEBP、 AtERF1-5、 这类转录因子与含核心序 列 AGCCGCC 的 GCC- 盒特异结合， 因此， 它的 DNA 结合区又称为 GCC- 盒结合域 (GCC-box binding domain， GBD)， 其中第2个G、 第5个G、 第7个C对ERF蛋白的识别有重要作用(Hao D， Ohme-Takagi M， Sarai A， 1998)。用核磁共振对其三维空间结构的研。
18、究表明， AtERF1 的 GBD 通过形成 3 个反向的 - 片层与其靶序列 GCC- 盒的大沟相结合 ； DREBP 亚组， 包括拟 南芥 DREB1A-C(CBF1-3) 和 DREB2A-B， 这类转录因子在干旱、 高盐、 低温下特异结合干旱应 说 明 书 CN 102140134 A CN 102140139 A3/9 页 5 答元件 DRE/CRT， 在拟南芥基因组中发现 124 个 DREBP 型转录因子基因 ； RAV 型转录因子包 括拟南芥 RAV1、 RAV2、 含有两个不同的 DNA 结合区 -ERF/AP2 和 B3， 在拟南芥中已发现 6 个 RAV 型转录因子基因。。
19、还有一类特殊的转录因子 AL079349， 它与以上的转录因子都不同， 自 成一类。 0010 最近发现 EREBPs 蛋白参与了干旱、 高盐和低温胁迫的信号传导和基因表达调控。 Mine等人从低温储藏的土豆块茎中分离到了EREBP转录因子CIP353， 受低温胁迫诱导强烈 表达 (Mine T， Hiyoshi T， KasaokaK， Ohyama A， 2003)， 说明可能有 EREBP 蛋白参与了受低 温胁迫的基因表达调控。 Park等利用西红柿为材料， 得到了受高盐、 乙烯或茉莉酸诱导表达 的 EREBP 转录因子 Tsi 基因， EMSA(Electrophoretic mobi。
20、lity shift assays) 试验分析 发现， Tsi 蛋白与 GCC-box 和 DRE/CRT 顺式元件都能结合 (Park JM， Park CJ， Lee SB， Ham BK， Shin R， Paek KH， 2001)， 尽管前者结合能力大于后者， 但说明， 某些 EREBP 蛋白能激活 受渗透胁迫诱导表达的基因。在正常生长条件下， Tsi 基因的超量表达提高了转基因植株 (35S:Tsi1)的耐盐性、 增强了抗病性(Park JM， Park CJ， Lee SB， Ham BK， Shin R， Paek KH， 2001)， 以上说明了 Tsi 基因可能参与了生物胁。
21、迫和非生物胁迫两条信号传导途径。由高盐 胁迫激活的一条类 MAPK 信号传递模式 ( 包括 SIMKK 和 SIMK)， 将胁迫信号传递给 EIN2( 在 乙烯信号传递途径的CTR1下游)(Guo HW and EckerJ， 2004)， 最后激活某些EREBPs转录因 子， 调控渗透胁迫相关基因的表达， 提高植物的耐盐性。对于是否存在含 GCC-box 元件， 且 表达产物直接参与非生物胁迫响应的基因， 还有待作进一步的证实。 0011 综合目前的研究结果， 植物在逆境胁迫条件下的信号传递途径至少有以下六条途 径 ： (1)依赖于ABA的信号传递途径有三条 ： 受干旱、 高盐诱导， 激活M。
22、YB、 MYC类转录因子基 因， 调控具有 MYBR 或 MYCR 顺式作用元件的靶基因 ； 受干旱、 高盐、 高温诱导， 激活 ABF/AREB 类转录因子基因， 调控具有 ABRE 顺式作用元件的靶基因 ； 受干旱、 高盐诱导， 激活 CBF4， DREB1 类转录因子基因， 调控具有 DRE/CRT 顺式作用元件的靶基因。(2) 不依赖于 ABA 的信 号传递途径有三条 ： 受干旱、 高盐诱导， 激活 DREB2 类转录因子基因， 调控具有 DRE/CRT 顺 式作用元件的靶基因 ； 受低温诱导， 激活 CBF1-3/DREB1A-C 类转录因子基因， 调控具有 DRE/ CRT 顺式作。
23、用元件的靶基因 ； 受干旱、 高盐或乙烯诱导， 激活 ERF 类转录因子基因， 调控具有 DRE/CRT 或 GCC 顺式作用元件的靶基因。 0012 用酵母单杂交系统证明转录因子的激活特性的主要原理如图 3 所示， 将 DRE 顺式 作用元件和突变体 DRE 顺式作用元件分别构建到 pHISi-1 载体和 pLacZi 载体的基本启动 子 Pmin(minimal promoter) 上游， Pmin 启动子下游连接报道基因 (His3、 LacZ 和 URA3)。 当连接有编码转录因子的目的基因的表达载体 YEP-GAP( 不含激活功能 ) 分别转化到连有 DRE 顺式作用元件和突变体 D。
24、RE 顺式作用元件的酵母细胞后， 如果连有突变体 DRE 顺式作 用元件的酵母细胞中的报道基因不能表达， 而连有特定的 DRE 顺式作用元件的酵母细胞中 的报道基因能够表达， 说明该转录因子能与 DRE 顺式作用元件结合， 且具有激活功能， 激活 了 Pmin 启动子， 促使报道基因表达。从而证明了目的转录因子的体内结合特异性和激活功 能。 发明创造内容 0013 本发明的目的是提供一种脱水应答元件结合蛋白及其编码基因。 说 明 书 CN 102140134 A CN 102140139 A4/9 页 6 0014 本发明所提供的脱水应答元件结合蛋白， 名称为 ZmDBP2， 来源于玉米属玉米。
25、 (Zea mays L.)， 是具有序列表中SEQ ID ： 2氨基酸残基序列的蛋白质， 或者是将SEQ ID ： 2 的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、 缺失或添加且具有与 SEQ ID ： 2 的氨基酸残基序列相同活性的由 SEQ ID ： 2 衍生的蛋白质。 0015 序列表中序列 2 的氨基酸残基序列是由 343 个氨基酸残基组成的蛋白质， 自氨基 端第 166 位 -223 位氨基酸残基序列为保守的 AP2/EREBP 结构域。 0016 脱水应答元件结合蛋白编码基因， 名称为 ZmDBP2， 来源于玉米属玉米 (Zea mays L.)， 是下列核苷酸序列之一 ： 。
26、0017 1) 序列表中 SEQ ID ： 1 的 DNA 序列 ； 0018 2) 编码序列表中 SEQ ID ： 2 蛋白质序列的多核苷酸 ； 0019 3)与序列表中SEQ ID ： 1限定的DNA序列具有90以上同源性， 且编码相同功 能蛋白质的 DNA 序列。 0020 序列 1 中的 cDNA 序列由 1501 个碱基组成， 该基因的开放阅读框架为自 5端第 155 位 -1186 位碱基， 共编码 343 个氨基酸 ( 序列表中的序列 2)。 0021 含有本发明基因的表达载体及细胞系均属于本发明的保护范围。 0022 扩增 ZmDBP2 中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之。
27、内。 0023 实验证明本发明的 ZmDBP2 在干旱、 高盐、 低温、 ABA 的诱导下表达， 并且可以特异 的调控含有DRE/CRT顺式元件(核心序列 ： CCGAC)的基因的转录表达。 本发明的ZmDBP2为 人为控制抗逆和耐逆相关基因的表达提供了基础， 将在培育抗逆性和耐逆性增强的植物育 种中发挥重要的作用。 附图说明 0024 图 1 为 ZmDBP2 与玉米 ZmDREB 氨基酸序列的同源性比对结果 0025 图 2 为 ZmDBP2 受胁迫诱导表达的实时荧光定量 PCR 图谱 0026 图 3 为用酵母单杂交系统证明转录因子的体内结合特异性和激活特性的原理示 意图 图 4 为实时。
28、荧光定量 PCR 反应条件图 图 5 为获得 ZmDBP2 基因编码氨基酸部分的全序列的 PCR 扩增条件图 具体实施方式 0027 实施例 1、 ZmDBP2 的克隆 0028 一、 mRNA 的分离 0029 将沙土中生长20天左右的玉米两叶期幼苗进行干旱处理5小时(处理方法 ： 将幼 苗小心的取出， 注意不要伤根， 用干净的吸水纸将叶片及根部的水分吸干， 再将幼苗放在干 净的吸水纸上， 置于阴凉处 5 小时 )， 用液氮速冻， -80保存备用。 0030 采用 Trizol 法 (TianGen) 提取小麦叶片总 RNA， 第一链 cDNA 合成用反转录酶 XL(AMV)(TaKaRa)。
29、。采用 SMART 法 (BD) 进行合成 ds cDNA ： 取 2l cDNA 进行 100l 体系 的 LD-PCR 扩增 ds cDNA， 循环 数为 24， 延伸时间为 6min。扩增结束后取 5lPCR 产物进行 琼脂糖凝胶 (1.0 ) 电泳检测。 0031 二、 ZmDBP2 基因全长序列的获得 说 明 书 CN 102140134 A CN 102140139 A5/9 页 7 0032 通过 5 RACE 和 3 RACE 的方法从玉米中获得一个新的脱水应答元件结合蛋白基 因核苷酸序列及对应的氨基酸序列， 结果得到具有序列表中序列 1 所示的核苷酸序列的 ZmDBP2， 其。
30、开放阅读框架为自 5端第 155 位 -1186 位碱基， 共编码 343 个氨基酸 ( 序列表 中的序列 2)， 自氨基端第 166 位 -223 位氨基酸残基序列为保守的 AP2/EREBP 结构域。同源 序列比对结果表明， ZmDBP2 与已报道的玉米 ZmDBF1(AAM80486) 同源性最高， 只有 34.47 的同源性 ( 如图 1 所示 )， 说明 ZmDBP2 是一个新发现的玉米基因。图 1 中， 黑框表示一致的 氨基酸部分。 0033 实施例 2、 实时荧光定量 PCR 分析 ZmDBP2 的表达特性 0034 一、 苗龄为 20 天的玉米幼苗， 进行以下处理 ： 0035。
31、 (1) 干旱处理 ： 将水培的玉米幼苗取出吸干根上的水分， 置于干燥的滤纸上， 干旱 培养 1 小时、 2 小时、 5 小时、 12 小时、 24 小时、 48 小时后取出材料， 用液氮速冻， -80保存 备用。 0036 (2) 盐渍处理 ： 将玉米幼苗置于 2的由 NaCl 和 Na2SO4组成的钠盐溶液中 (NaCl 与 Na2SO4的质量百分比为 3 2) 中， 光照培养 1 小时、 2 小时、 5 小时、 12 小时、 24 小时、 48 小时后分别取出材料， 用液氮速冻， -80保存备用。 0037 (3) 冷害处理 ： 将玉米幼苗置于 4培养箱， 光照培养 1 小时、 2 小时。
32、、 5 小时、 12 小 时、 24 小时、 48 小时后取出并用液氮速冻， -80保存备用。 0038 (4)ABA处理 ： 将玉米幼苗置于200M的ABA溶液中， 光照培养1小时、 2小时、 5小 时、 12 小时、 24 小时、 48 小时后分别取出并用液氮速冻， -80保存备用。 0039 (5) 对照的处理 ： 直接取未经任何处理的玉米幼苗 -80冻存作为对照。 0040 二、 mRNA 的分离 0041 将生长 20 天的幼苗处理后， ， 用液氮速冻， -80保存备用。采用 Quikprep Micro mRNA PurificationKit(Pharmacia) 进行 mRNA。
33、 的分离。 0042 三 . 反转录为 cDNA 0043 采用 R103-Quant_Reverse_Transcriptase(TIANGEN) 将纯化的 mRNA 反转录为 cDNA. 0044 反应体系 ： 0045 10RT buffer 2l 0046 dNTP mix(2.5mM each) 4l 0047 oligo-dT 引物 (10) 2l 0048 RNase inhibitor(10U/) 1l 0049 Quant reverse transcriptase 1l 0050 RNase free H2O 5l 0051 模板 RNA 5l 0052 总体系为 20 0。
34、053 37孵育 60min。 0054 四、 实时荧光定量 PCR 0055 根 据 已 知 的 ZmDBP2 序 列，在 其 可 变 区 设 计 特 异 引 物。ZmDBP2RTF ： 5 -GCCCGATGGCATTTTAGACG-3 ； ZmDBP2RTR ： 5 -AACCAGGAGATTAGCACGCA-3 说 明 书 CN 102140134 A CN 102140139 A6/9 页 8 0056 以 actin 为内参基因。 0057 反应体系 ： 0058 cDNA 1l 0059 2.5RealMasterMIX 8l 0060 20SYBR 1l 0061 ddH2O 。
35、10l 0062 反应条件 ： 图 4 0063 0064 ZmDBP2 对各个胁迫及激素表现出响应。图 2 0065 实施例 3、 ZmDBP2 的激活特性 0066 一、 将 ZmDBP2 基因构建到表达载体 YEP-GAP 上 0067 1、 获得 ZmDBP2 基因编码氨基酸部分的全序列 0068 根据已克隆的 ZmDBP2 基因的序列设计引物， 引物末端分别加 EcoRI 和 XhoI 酶切 位点， PCR 扩增获得编码氨基酸部分的全序列， 程序及体系如下 ： 0069 引物序列 ： 0070 ZmDBP2-EI ： 5 -GGGGAATTCGCTCCATCCAAGCTGTAGTCC。
36、T-3 0071 ZmDBP2-XI ： 5 -GGGCTCGAGGCTCATGACAGGATGGAATCC-3 0072 反应体系 (50l) ： 0073 模板 (60ng/ul) 0.5l 0074 dNTP(10mM) 1l 0075 引物 (25M) 1l 0076 10buffer 5l 0077 ddh2O 42.1l 0078 Taq(5U/l) 0.4l 0079 扩增条件 (PTC-200) ： 图 5 0080 0081 取扩增产物 2ul 在 1.2琼脂糖凝胶中电泳检测， 溴化乙啶染色， 紫外凝胶成像仪 扫描， 观察在 1.1Kb 左 右的位置处是否有一条亮带。 008。
37、2 采 用 Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(TaKaRa 公司， Code No. ： DV807A) 回收纯化 PCR 产物 ( 同三、 cDNA 文库的筛选的探针的回收 )。 0083 2、 将 ZmDBP2 基因构建到表达载体 YEP-GAP 上 0084 将步骤 1 中纯化的 PCR 产物和表达载体 YEP-GAP(Liu Q， Kasuga M， Sakuma Y， Abe H， Miura S， Yamaguchi-Shinozaki K， Shinozaki K.， 1998)，用 EcoRI(Takara) 和 XhoI(Tak。
38、ara) 分别酶切 4-6hr， 反应体系如下 ： 0085 10 缓冲液 H 5l 0086 EcoR I(12U/l) 2l 0087 XhoI(12U/l) 2l 0088 PCR 产物 /YEP-GAP 20l 0089 ddH2O 21l 说 明 书 CN 102140134 A CN 102140139 A7/9 页 9 0090 采 用 Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(TaKaRa 公司， Code No. ： DV807A) 回收纯化酶切产物 ( 同三、 cDNA 文库的筛选的探针的回收 )。 0091 将纯化的酶切 PCR 产。
39、物和酶切载体 YEP-GAP 连接 4-8hr， 反应体系如下 ： 0092 10Ligase buffer 1l 0093 酶切 PCR 产物 4l 0094 酶切载体 YEP-GAP 4l 0095 T4DNA Ligase 1l 0096 取 0.5l 连接产物， 电击转化 JM109 菌株， 37过夜培养， 挑取阳性克隆， 测序分 析序列是否正确， 得到含有 ZmDBP2 基因的重组表达载体 YEP-GAP-ZmDBP2。 0097 二、 ZmDBP2 的体内结合特异性和激活特性的验证 0098 1、 酵母报道子的构建 0099 将含有 4 个 DRE 元件的片段 5 -GAATTC-。
40、DRE-DRE-DRE-DRE-GTCGAC-3 (DRE 的核心 序列 ： TACCGACAT) 分别构建到 pHis-1 载体 (MATCHMAKER One-Hybrid System， Clontech 公 司 ) 的 PminHIS3启动子和 pLacZi 载体 (MATCHMAKER One-Hybrid System， Clontech 公司 ) PCYCI启动子上游， 分别得到重组载体 pHis-1-DRE 和 pLacZi-DRE， 用 Xho I 和 Nco I 内切酶 分别将 pHis-1-DRE 和 pLacZi-DRE 载体切成线状。先将线状 pHis-1-DRE 载。
41、体转化到酵母 细胞 (YM4271 株系， MATCHMAKER One-Hybrid System， Clontech 公司 ) 内， 获得能在 SD/His 培养基上正常生长的酵母转化子(Yeast transformant)。 接着以这种酵母转化子为寄主细 胞， 继续转化含有 4 个重复 DRE 元件的 pLacZi-DRE 载体。这样在同时缺乏组氨酸和尿嘧啶 的 SD/His-/Ura-培养基上， 选择获得含有 pHis-1-DRE 和 pLacZi-DRE 的正常双重酵母报道 子 ； 将 4 个 DRE 元件的核心序列 CCGAC 突变成 TTTTT(MDRE)， 即 5 -GAAT。
42、TC-MDRE-MDRE-MDR E-MDRE-GTCGAC-3 ， 按正常的双重酵母报道子构建方法， 再构建一个含 4 个 MDRE 盒的突变 体双重酵母报道子。 0100 2、 PEG/LiAc 法转化酵母及结果分析 0101 (1) 接种酵母菌株 (YM4271 株系， MATCHMAKER One-Hybrid System， Clontech 公 司)到1ml YPD液体培养基中， 剧烈震荡2分钟， 分散团块后将悬浮液转至含有50ml YPD液 体培养基的三角瓶中， 30 /250rpm 摇过夜， 测 OD600 1.7-1.8( 计数约 4107个 /mL) ； 0102 (2) 。
43、取 30ml 步骤 (1) 过夜培养物接到 300ml 新鲜的 YPD 培养基中， 30 /250rpm 培养， 约 3 小时至 OD600 0.50.1， 室温 1000g 离心 5min， 收集菌体， 弃上清， 用 1/2 体积 1TE 悬浮， 1000g/5min 离心 ； 0103 (3) 吸弃上清， 用 1.5ml 新鲜配制的 1TE/LiAc 溶液悬浮， 振荡混匀备用 ； 0104 (4) 取出 0.1ml 酵母感受态进行转化， 依次加下列溶液 ： 0.1g 表达载体 YEP-GAP-ZmDBP2、 0.1mg ssDNA( 鲑 鱼 精 DNA， Sigma)、 0.6mlPEG/。
44、LiAc 高 速 振 荡 1 分 钟， 30 /200rpm 振荡培养 30 分钟 ； 0105 (5)加入70ul DMSO(sigma#D8779)， 轻轻倒置混匀， 42热激30分钟， 其间轻轻振 荡， 冰浴 2 分钟， 室温 1000g 离心 5min ； 0106 (6) 吸弃上清， 加入 0.5ml 1TE buffer 悬浮细胞 ； 0107 (7) 用接种环蘸取悬浮液， 分别在含有 0， 15mmol/L 3-AT 的 SD/His/Ura-/Trp-选 择性培养基上画线培养。 说 明 书 CN 102140134 A CN 102140139 A8/9 页 10 0108 (。
45、8)平板的一半培养步骤1构建的正常双重酵母报道子， 另一半培养步骤1构建的 突变体双重酵母报道子， 以便做对照分析。 0109 (9) 颠倒放置于培养箱中， 30培养 3-4 天。 0110 (10) 结果发现在 0mmol/L3-AT 的 SD/His-/Ura-/Trp-的培养基平板上正常的酵母 报道子和突变的酵母报道子都有生长， 但突变的酵母报道子的直径明显小 ； 而在 15mmol/L 3-AT 的 SD/His/Ura/Trp 的培养基平板上正常的酵母报道子能正常生长， 但突变的酵母报 道子被抑止没有生长。 0111 3、 半乳糖苷酶活性检测 0112 (1) 从 0mmol/L 3。
46、-AT 的 SD/His-/Ura-/Trp-的培养基平板上分别挑取正常的酵母 报道子和突变的酵母报道子菌落。 转至YPD液体培养基中， 于30振荡培养， 待长至对数生 长后期， 取 1.5ml 菌液， 3000rpm 离心 30s ； 0113 (2) 弃上清， 控干管中液体， 将离心管置于液氮中速冻 10min， 取出使其自然融解， 加 50ul Z/X-gal 溶液， 30温育， 结果发现正常的酵母报道子在 6-8h 内变蓝， 而突变的酵 母报道子在12h内没有变化， 仍为白色。 说明转录因子ZmDBP2能与DRE顺式作用元件结合， 且具有激活功能， 激活了 Pmin 启动子 ( 还是 。
47、PminHIS3启动子或 PCYCI启动子？ )， 促使报道基 因表达。从而证明了 ZmDBP2 的体内结合特异性和激活功能。 0114 三、 药剂配制 ： 0115 (1)YPD 液体培养基 0116 细菌培养用酵母抽提物 (Bacto-Yeast Extract) 10g/L 0117 细菌培养用胰化蛋白胨 (Bacto-Peptone) 20g/L 0118 调节 pH 至 5.8， 121 /15min 灭菌， 降至 60以后加入 40的 Glucose， 使其终浓 度为 20g/L。 0119 (2)SD/His/Ura/Trp 选择性培养基 0120 不含氨基酸的酵母氮源 (Yea。
48、st nitrogen base) 6.7g/L 0121 营养缺陷型混合物 (drop-out media without His/Ura/Trp) 100ml 0122 琼脂粉 (Bacteriological agar) 20g/L 0123 调节 pH 至 5.8， 121 /15min 灭菌， 降至 60后加入 40 Glucose， 使其终浓度为 20g/L。 0124 (3) 营养缺陷型混合物 (Drop-out mix) ： (10X) 0125 L-Isoleucine( 异亮氨酸 ) 300mg/L 0126 L-Valine( 缬氨酸 ) 1500mg/L 0127 L-Adenine( 腺嘌呤 ) 200mg/L 0128 L-Arginine( 精氨酸 ) 200mg/L 0129 L-Histidine Hcl monohydrate( 组氨酸 ) 200mg/L 0130 L-Leucine( 亮氨酸 ) 1000mg/L 0131 L-Lysine Hcl( 赖氨酸 ) 300mg/L 。