技术领域
本发明涉及生物、化学及材料科学技术领域，尤其是涉及一种具有荧光性质的改性海藻酸钠及其制备方法；本发明还涉及一种具有荧光性质的改性海藻酸钠作为荧光材料的应用。
背景技术
在生命科学及现代分子生物学领域里，研究和应用高灵敏度的非同位素检测方法一直是各国学者共同努力的方向。目前生命科学研究主要集中于核酸、蛋白质等生物大分子的分析中。生物大分子检测的主要方法是标记分析法，其中发光标记是最主要的方法之一，检测的灵敏度很大程度上取决于标记物的发光强度和稳定性。但是传统的有机染料因自身的某些性质限制了其应用范围，例如激发光谱窄、发射光谱宽、拖尾造成谱峰重叠以及易光漂白和光解等。荧光标记技术指利用一些能发射荧光的物质共价结合或物理吸附在所要研究分子的某个基团上，利用它的荧光特性来提供被研究对象的信息。荧光标记技术广泛应用于分析化学、生物化学和细胞生物学等各个方面。
海藻酸钠作为一种天然多糖，具有稳定性、溶解性、粘性和安全性等特点。海藻酸钠水凝胶因其具有成型性和生物相容性己广泛用作药物载体、细胞培养及仿生材料的研究中。海藻酸钠由于具有良好的增稠性、成膜性、稳定性、絮凝性和螯合性，利用海藻酸钠开发新产品是一个有价值、有希望的课题。但由于海藻酸钠组成与结构的复杂性，不利于海藻酸钠相关新产品的开发以及与其他化学药剂作用机理研究。因此，研究开发具有荧光性质的改性海藻酸钠，为海藻酸钠相关新产品的开发以及与其他化学药剂作用机理研究提供新的思路，具有重大意义，将有利于促进生物技术的发展。然而，因为海藻酸钠没有氨基不能与FITC等荧光基团直接嫁接，不利于制备具有荧光性质的改性海藻酸钠。
发明内容
本发明的首要解决的技术问题在于克服具有荧光性质的改性海藻酸钠不易制备的难题，提供一种具有荧光性质的改性海藻酸钠的制备方法。
其次，本发明解决的技术问题在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种具有荧光性质的改性海藻酸钠，促进生物技术的发展。
本发明另一解决的技术问题在于提供一种具有荧光性质的改性海藻酸钠的应用。
为了解决上述技术问题，一方面，本发明提供一种具有荧光性质的改性海藻酸钠的制备方法，包括如下步骤：
1)将2体积份0.5mol/l的1，6-己二胺水溶液与1体积份10V％的乙酸水溶液混合，制得1，6-己二胺乙酸水溶液；
2)将3～4质量份海藻酸钠按质量体积比为1g/5ml的比例溶解于步骤1)制得的1，6-己二胺乙酸水溶液中；
3)将1～3质量份的NaBH3CN溶解在20质量份的蒸馏水中，制得NaBH3CN水溶液；然后将其加入到步骤2)制得的海藻酸钠溶液中，将混合溶液放在水浴恒温振荡器中，调节水浴温度为35～65℃反应48～60h；
4)反应后的溶液用离心机在9000～12000r/min转速下离心分离10～15分钟；
5)离心后取上清液经凝胶层析分离出流动相后，得到的产物经真空冷冻干燥制得海藻酸钠-1，6-己二胺的合成产物，冷冻保存；
6)将1重量份步骤5)制得的海藻酸钠-1，6-己二胺的合成产物溶于50重量份的蒸馏水中，并用NaHCO3水溶液调节pH值至7.5～9.5；加入0.1～0.15重量份异硫氰酸荧光素，将混合溶液置于37～45℃水浴环境下避光反应12～15h；反应完毕加入无水乙醇，至亮黄绿色沉淀不再析出，经离心分离弃去上清液获得沉淀物；所得沉淀物加水复溶、无水乙醇再沉淀、离心分离弃去上清液，反复多次，直至上清液无荧光吸收后，经凝胶层析分离出流动相，得到的产物经真空冷冻干燥。
作为进一步改进技术方案，本发明提供的具有荧光性质的改性海藻酸钠的制备方法，所述凝胶层析采用Sephadex G-25凝胶。
为了解决上述技术问题，另一方面，本发明提供一种具有荧光性质的改性海藻酸钠，其通过海藻酸钠与1，6-己二胺反应制备得到海藻酸钠-1，6-己二胺合成产物，所述海藻酸钠-1，6-己二胺合成产物经凝胶层析分离出流动相后得到洗脱的海藻酸钠-1，6-己二胺合成产物，所述洗脱的海藻酸钠-1，6-己二胺合成产物与异硫氰酸荧光素在pH值为7.5～9.5的碱性环境下反应制备得到。
作为进一步改进技术方案，本发明提供的具有荧光性质的改性海藻酸钠，经以下步骤制备得到：
1)将2体积份0.5mol/l的1，6-己二胺水溶液与1体积份10V％的乙酸水溶液混合，制得1，6-己二胺乙酸水溶液；
2)将3～4质量份海藻酸钠按质量体积比为1g/5ml的比例溶解于步骤1)制得的1，6-己二胺乙酸水溶液中；
3)将1～3质量份的NaBH3CN溶解在20质量份的蒸馏水中，制得NaBH3CN水溶液；然后将其加入到步骤2)制得的海藻酸钠溶液中，将混合溶液放在水浴恒温振荡器中，调节水浴温度为35～65℃反应48～60h；
4)反应后的溶液用离心机在9000～12000r/min转速下离心分离10～15分钟；
5)离心后取上清液经凝胶层析分离出流动相后，得到的产物经真空冷冻干燥制得海藻酸钠-1，6-己二胺的合成产物，冷冻保存；
6)将1重量份步骤5)制得的海藻酸钠-1，6-己二胺的合成产物溶于50重量份的蒸馏水中，并用NaHCO3水溶液调节pH值至7.5～9.5；加入0.1～0.15重量份异硫氰酸荧光素，将混合溶液置于37～45℃水浴环境下避光反应12～15h；反应完毕加入无水乙醇，至亮黄绿色沉淀不再析出，经离心分离弃去上清液获得沉淀物；所得沉淀物加水复溶、无水乙醇再沉淀、离心分离弃去上清液，反复多次，直至上清液无荧光吸收后，经凝胶层析分离出流动相，得到的产物经真空冷冻干燥。
为了解决上述技术问题，本发明还提供一种荧光材料，所述荧光材料包括前述任一项所述的具有荧光性质的改性海藻酸钠。
作为进一步改进技术方案，本发明提供的荧光材料在碱性溶液中具有绿色荧光特性.
作为进一步改进技术方案，本发明提供的荧光材料为固体粉末、膜、涂层、纤维、丝、胶束或微球。
在不冲突的情况下上述改进方案可单独或组合实施。
海藻酸钠由于具有良好的增稠性、成膜性、稳定性、絮凝性和螯合性，利用它开发新产品是一个有价值、有希望的课题。但由于海藻酸钠组成与结构的复杂性，不利于海藻酸钠相关新产品的开发以及与其他化学药剂作用机理的研究。本发明提供的技术方案，提供一种具有荧光性质的改性海藻酸钠及其生产方法，并提供其应用方案，从而为海藻酸钠相关新产品的开发以及与其他化学药剂作用机理研究提供了新的思路，具有较好的经济效益和社会效益。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，但并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为实施例原海藻酸钠的紫外可见吸收光谱图；
图2为其中的一个实施例制得的海藻酸钠-1，6-己二胺合成物的紫外光谱图；
图3为其中的一个实施例制得的具有荧光性质的改性海藻酸钠的紫外光谱图；
图4为反应溶液pH对改性海藻酸钠在320nm下紫外吸光度的影响图；
图5为1，6-己二胺与海藻酸钠反应时间对改性海藻酸钠在320nm下紫外吸光度的影响图；
图6为1，6-己二胺与海藻酸钠反应温度对改性海藻酸钠在320nm下紫外吸光度的影响图；
图7为1，6-己二胺与10V％乙酸反应体积比值对改性海藻酸钠在320nm下紫外吸光度的影响图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的实施方式作进一步的详细说明。
实施例1：
具有荧光性质的改性海藻酸钠的制备包括以下过程、步骤及工艺条件：
1)取20ml 0.5mol/l的1，6-己二胺水溶液与10ml10V％的己酸水溶液混合，制得1，6-己二胺乙酸水溶液；
2)将300mg海藻酸钠溶解于步骤1)制得的15ml 1，6-己二胺乙酸水溶液中；
3)将100mg的NaBH3CN溶解在2mL的蒸馏水中，制得NaBH3CN水溶液；然后将其加入到步骤2)制得的海藻酸钠溶液中，将混合溶液放在水浴恒温振荡器中，调节水浴温度为35℃反应60h；
4)反应后的溶液用离心机在9000r/min转速下离心分离15分钟；
5)离心后取上清液经Sephadex G-25柱分离出流动相后，得到的产物经真空冷冻干燥制得海藻酸钠-1，6-己二胺的合成产物(D-SA)，冷冻保存；
6)将200mg步骤5)制得的海藻酸钠-1，6-己二胺的合成产物溶于10mL蒸馏水中，并用NaHCO3水溶液调节pH值至7.5；加入20mg异硫氰酸荧光素(FITC)，将混合溶液置于37℃水浴环境下避光反应12h；反应完毕加入无水乙醇，至亮黄绿色沉淀不再析出，经离心分离弃去上清液获得沉淀物；所得沉淀物加水复溶、无水乙醇再沉淀、离心分离弃去上清液，反复三次，至上清液无荧光吸收后，经Sephadex G-25柱分离出流动相，得到的产物经真空冷冻干燥，即可得到所述具有荧光性质的海藻酸钠。制得的具有荧光性质的海藻酸钠用紫外分光光度计测定320nm的吸光度值为2.5。
实施例2：
具有荧光性质的改性海藻酸钠的制备包括以下过程、步骤及工艺条件：
1)取20ml 0.5mol/l的1，6-己二胺水溶液与10ml10V％的乙酸水溶液混合，制得1，6-己二胺乙酸水溶液；
2)将350mg海藻酸钠溶解于步骤1)制得的17.5ml 1，6-己二胺乙酸水溶液中；
3)将200mg的NaBH3CN溶解在2mL的蒸馏水中，制得NaBH3CN水溶液；然后将其加入到步骤2)制得的海藻酸钠溶液中，将混合溶液放在水浴恒温振荡器中，调节水浴温度为65℃反应48h；
4)反应后的溶液用离心机在12000r/min转速下离心分离10分钟；
5)离心后取上清液经Sephadex G-25柱分离出流动相后，得到的产物经真空冷冻干燥制得海藻酸钠-1，6-己二胺的合成产物(D-SA)，冷冻保存；
6)将200mg步骤5)制得的海藻酸钠-1，6-己二胺的合成产物溶于10mL蒸馏水中，并用NaHCO3水溶液调节pH值至9.5；加入25mg异硫氰酸荧光素(FITC)，将混合溶液置于40℃水浴环境下避光反应13h；反应完毕加入无水乙醇，至亮黄绿色沉淀不再析出，经离心分离弃去上清液获得沉淀物；所得沉淀物加水复溶、无水乙醇再沉淀、离心分离弃去上清液，反复三次，至上清液无荧光吸收后，经Sephadex G-25柱分离出流动相，得到的产物经真空冷冻干燥，即可得到所述具有荧光性质的海藻酸钠。制得的具有荧光性质的海藻酸钠用紫外分光光度计测定320nm的吸光度值为3.8。
实施例3：
具有荧光性质的改性海藻酸钠的制备包括以下过程、步骤及工艺条件：
1)取20ml 0.5mol/l的1，6-己二胺水溶液与10ml10V％的乙酸水溶液混合，制得1，6-己二胺乙酸水溶液；
2)将400mg海藻酸钠溶解于步骤1)制得的20ml 1，6-己二胺乙酸水溶液中；
3)将300mg的NaBH3CN溶解在2mL的蒸馏水中，制得NaBH3CN水溶液；然后将其加入到步骤2)制得的海藻酸钠溶液中，将混合溶液放在水浴恒温振荡器中，调节水浴温度为50℃反应55h；
4)反应后的溶液用离心机在10000r/min转速下离心分离12分钟；
5)离心后取上清液经Sephadex G-25柱分离出流动相后，得到的产物经真空冷冻干燥制得海藻酸钠-1，6-己二胺的合成产物(D-SA)，冷冻保存；
6)将200mg步骤5)制得的海藻酸钠-1，6-己二胺的合成产物溶于10mL蒸馏水中，并用NaHCO3水溶液调节pH值至8.5；加入30mg异硫氰酸荧光素(FITC)，将混合溶液置于45℃水浴环境下避光反应15h；反应完毕加入无水乙醇，至亮黄绿色沉淀不再析出，经离心分离弃去上清液获得沉淀物；所得沉淀物加水复溶、无水乙醇再沉淀、离心分离弃去上清液，反复三次，至上清液无荧光吸收后，经Sephadex G-25柱分离出流动相，得到的产物经真空冷冻干燥，即可得到所述具有荧光性质的海藻酸钠。制得的具有荧光性质的海藻酸钠用紫外分光光度计测定320nm的吸光度值为1.5。
实施例4：
具有荧光性质的改性海藻酸钠的制备包括以下过程、步骤及工艺条件：
1)取20ml 0.5mol/l的1，6-己二胺水溶液与10ml10V％乙酸水溶液混合，制得1，6-己二胺乙酸水溶液；
2)将400mg海藻酸钠溶解于步骤1)制得的20ml 1，6-己二胺乙酸水溶液中；
3)将300mg的NaBH3CN溶解在2mL的蒸馏水中，制得NaBH3CN水溶液；然后将其加入到步骤2)制得的海藻酸钠溶液中，将混合溶液放在水浴恒温振荡器中，调节水浴温度为47℃反应56h；
4)反应后的溶液用离心机在9500r/min转速下离心分离14分钟；
5)离心后取上清液经Sephadex G-25柱分离出流动相后，得到的产物经真空冷冻干燥制得海藻酸钠-1，6-己二胺的合成产物(D-SA)，冷冻保存；
6)将200mg步骤5)制得的海藻酸钠-1，6-己二胺的合成产物溶于10mL蒸馏水中，并用NaHCO3水溶液调节pH值至8.7；加入20mg异硫氰酸荧光素(FITC)，将混合溶液置于37℃水浴环境下避光反应12h；反应完毕加入无水乙醇，至亮黄绿色沉淀不再析出，经离心分离弃去上清液获得沉淀物；所得沉淀物加水复溶、无水乙醇再沉淀、离心分离弃去上清液，反复三次，至上清液无荧光吸收后，经Sephadex G-25柱分离出流动相，得到的产物经真空冷冻干燥，即可得到所述具有荧光性质的海藻酸钠。制得的具有荧光性质的海藻酸钠用紫外分光光度计测定320nm的吸光度值为0.8。
图1为各实施例原海藻酸钠的紫外可见吸收光谱图，没有明显的谷峰；
图2为其中的一个实施例制得的海藻酸钠-1，6-己二胺的合成产物的紫外光谱图；在320nm下有一小谷峰，320nm为1，6-己二胺的紫外特征吸收峰，说明海藻酸钠与1，6-己二胺结合成功。在其它实施例中也有相同或近似的结果。
图3为其中的一个实施例制得的具有荧光性质的海藻酸钠的紫外光谱图。在490nm下存在吸收峰，490nm为异硫氰酸荧光素(FITC)的紫外特征吸收峰，用苯酚硫酸法测得有糖存在，说明制得的海藻酸钠-1，6-己二胺的合成产物与异硫氰酸荧光素(FITC)结合成功。在其它实施例中也有相同或近似的结果。
图4为反应溶液pH对合成荧光海藻酸钠在在320nm下紫外吸光度的影响图，表明在pH＝8.5附近时，合成产物吸光度大，合成效果较好。
图5为1，6-己二胺与海藻酸钠反应时间对合成荧光海藻酸钠在320nm下紫外吸光度的影响图，表明反应时间对合成产物的吸光度影响很大，且反应时间应在48h以上，在考察范围内越长越好。
图6为1，6-己二胺与海藻酸钠反应温度对合成荧光海藻酸钠在在320nm下紫外吸光度的影响图，表明合成反应最佳反应温度为50℃以上。
图7为1，6-己二胺与10V％乙酸反应体积比值对合成荧光海藻酸钠在在320nm下紫外吸光度的影响图，1，6-己二胺与10V％乙酸体积比值为1∶0.5附近时，合成荧光海藻酸钠的紫外吸光度最高，即合成效率最好。
显然，本发明不限于以上优选实施方式，还可在本发明权利要求和说明书限定的精神内，进行多种形式的变换和改进，能解决同样的技术问题，并取得预期的技术效果，故不重述。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接或联想到的所有方案，只要在权利要求限定的精神之内，也属于本发明的保护范围。