一种用于鉴定中药黄芪的引物对及其应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710421392.2 (22)申请日 2017.06.07 (71)申请人 苏州市李良济健康产业有限公司 地址 215163 江苏省苏州市高新区科灵路 78号 (72)发明人 李建华 (74)专利代理机构 南京经纬专利商标代理有限 公司 32200 代理人 楼高潮 (51)Int.Cl. C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种用于鉴定中药黄芪的引物对及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种用于鉴定中药黄芪的引 。

2、物对及其应用， 所述引物对及其序列为： P1， SEQ IDNO.12； P2， SEQIDNO.34； P3， SEQID NO.56。 (1)本发明所述用于鉴定中药黄芪的引 物对经发卡结构修饰后能够特异性的识别药用 黄芪； (2)本发明所述引物对用于鉴定中药黄芪 的试剂盒中能够快速、 准确的鉴定是否为药用黄 芪。 权利要求书1页 说明书4页 序列表2页 附图1页 CN 107236796 A 2017.10.10 CN 107236796 A 1.一种用于鉴定中药黄芪的引物对， 其特征在于， 所述引物对及其序列为： P1， SEQ ID NO.12； P2， SEQ ID NO.34； P。

3、3， SEQ ID NO.56。 2.根据权利要求1所述的一种用于鉴定中药黄芪的引物对， 其特征在于， 所述引物对 P1、 P2和P3的上游引物的5， 端加上特异性的GC发卡结构， 所述发卡结构的长度为40bp， 序列 为SEQ ID NO.7。 3.权利要求1或2所述引物对在制备鉴定中药黄芪试剂盒中的应用。 4.根据权利要求3所述的应用， 其特征在于， 所述试剂盒的组分包括： 引物对、 dNTP、 DNA 聚合酶、 LC Green、 反应缓冲液。 5.根据权利要求3所述的应用， 其特征在于， 所述试剂盒鉴定中药黄芪的步骤包括： (1)提取黄芪样品的基因组DNA； (2)以步骤(1)提取的基。

4、因组DNA为模板， 以P1为特异性引物， 进行第一轮PCR扩增； (3)取步骤(2)的扩增产物， 稀释50500倍后作为第二轮PCR的模板， 以P2作为特异性 引物， 进行第二轮PCR扩增； (4)取第二轮PCR扩增的产物， 稀释10100倍后作为第三轮PCR的模板， 以P3作为特异 性引物， 进行第三轮PCR扩增； (5)收集第三轮PCR扩增的产物， 并采用琼脂糖凝胶电泳检测。 6.根据权利要求5所述的应用， 其特征在于， 所述黄芪样品的基因组DNA的提取方法是 试剂盒法或改良CTAB法。 7.根据权利要求5所述的应用， 其特征在于， 所述PCR扩增的程序为： 95， 2min； 95， 3。

5、0s， 52， 30s， 72， 55s， 35个循环； 72， 7min。 权利要求书 1/1 页 2 CN 107236796 A 2 一种用于鉴定中药黄芪的引物对及其应用 技术领域 0001 本发明属于分子生物学领域， 涉及一种采用分子生物学手段鉴定中药的方法， 具 体为一种用于鉴定中药黄芪的引物对及其应用。 背景技术 0002 卵巢癌是常见的妇科恶性肿瘤， 死亡率位居妇科疾病榜首。 其发生、 发展是多基因 改变的过程， 是多种癌基因和抑癌基因表达失衡导致肿瘤细胞无控增殖及凋亡抑制的结 果， 卵巢癌早期常无特征性症状和体征， 难以发现。 目前西医卵巢癌治疗以手术配合放化疗 为主， 随着中。

6、医药配合西医治疗肿瘤新模式的日趋完善， 对改善症状、 提高疗效， 甚至延长 生命都有着积极的作用， 近年来许多学者致力于卵巢癌中医药方向的实验研究， 表明半支 莲含药血清和熊果酸对人卵巢癌SKOV3细胞的增殖有抑制作用。 0003 针对目前中药治疗卵巢癌单体配伍方向的研究较少， 基于补气活血的中医理论基 础， 现有技术中对黄芪甲苷配伍姜黄素治疗发生转移的卵巢癌进行疗效观察。 采用免疫组 化及实时荧光定量PCR检测多种肿瘤因子蛋白和基因的表达。 探讨黄芪甲苷配伍姜黄素对 发生转移的卵巢癌肿瘤生长的抑制作用， 为临床用药和新药研发提供实验依据。 0004 黄芪是我国常用大众药材之一， 2010版药。

7、典收录记载， 为豆科植物蒙古黄芪或膜 荚黄芪的干燥根， 具有补气升阳， 固表止汗， 利水消肿， 生津养血， 行滞通痹， 脱毒排脓， 敛疮 生肌的功效。 现代药理研究表明， 中药黄芪对免疫系统的调节， 抗氧化、 抗肿瘤、 抗辐射、 抗 菌、 抗病毒、 保肝、 利尿等都有很好的作用。 0005 黄芪属品种繁多， 资源分布广泛， 且2010版药典收录的中药黄芪来源蒙古黄芪和 膜荚黄芪为国家三级保护植物， 属渐危种， 虽然近几年中药种植面积逐渐增加， 仍有供不应 求的状况发生。 市场上关于黄芪的伪品， 主要有华黄芪、 土黄芪、 紫花苜蓿、 斜茎黄芪等， 部 分伪品含有生物碱等， 误服后果严重。 中药黄。

8、芪及其混伪品的鉴别对植物资源保护及药用 植物安全合理利用都具有重要的意义。 随着分子生物学的发展， 分子鉴定方法也越来越多 的应用到中药材的鉴别上。 条形码技术作为一种热门、 前沿的分子鉴定技术， 在中药材鉴定 中得到广泛的应用。 发明内容 0006 本发明的目的是： 为了克服现有技术的缺陷， 获得一种采用分子生物学手段， 快 速、 准确鉴定黄芪的方法， 本发明提供了一种用于鉴定中药黄芪的引物对及其应用。 0007 技术方案： 一种用于鉴定中药黄芪的引物对， 所述引物对及其序列为： P1， SEQ ID NO.12； P2， SEQ ID NO.34； P3， SEQ ID NO.56。 00。

9、08 优选的， 所述引物对P1、 P2和P3的上游引物的5， 端加上特异性的GC发卡结构， 所述 发卡结构的长度为40bp， 序列为SEQ ID NO.7。 0009 表1 引物对及发卡结构序列 说明书 1/4 页 3 CN 107236796 A 3 0010 名称序列(5， -3， )SEQ ID NO. P1-FGCTCCTCCGCTTATTGATATGC1 P1-RGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGAT2 P2-FAAGGGCATTCAGGAGCTCTAG3 P2-RGTTTACGTGGCCTGTTTCAAG4 P3-FGGCCCGTAACACTGTCTGGTAA5 P3-R。

10、GCGCGTCGTGAAGCGTGAATTC6 发卡结构CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG7 0011 所述引物对在制备鉴定中药黄芪试剂盒中的应用。 0012 优选的， 所述试剂盒的组分包括： 引物对、 dNTP、 DNA聚合酶、 LC Green、 反应缓冲 液。 0013 优选的， 所述试剂盒鉴定中药黄芪的步骤包括： 0014 (1)提取黄芪样品的基因组DNA； 0015 (2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板， 以P1为特异性引物， 进行第一轮PCR扩增； 0016 (3)取步骤(2)的扩增产物， 稀释50500倍后作为第二轮PCR的模板。

11、， 以P2作为特 异性引物， 进行第二轮PCR扩增； 0017 (4)取第二轮PCR扩增的产物， 稀释10100倍后作为第三轮PCR的模板， 以P3作为 特异性引物， 进行第三轮PCR扩增； 0018 (5)收集第三轮PCR扩增的产物， 并采用琼脂糖凝胶电泳检测。 0019 进一步的， 所述黄芪样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。 0020 进一步的， 所述PCR扩增的程序为： 95， 2min； 95， 30s， 52， 30s， 72， 55s， 35 个循环； 72， 7min。 0021 有益效果： (1)本发明所述用于鉴定中药黄芪的引物对经发卡结构修饰后能够特 异。

12、性的识别药用黄芪； (2)本发明所述引物对用于鉴定中药黄芪的试剂盒中能够快速、 准确 的鉴定是否为药用黄芪。 附图说明 0022 图1是实施例13PCR鉴定结果电泳图； 0023 其中M为分子量为2000的Maker； 1为实施例1PCR产物鉴定结果； 2为实施例2PCR产 物鉴定结果； 3为实施例3PCR产物鉴定结果。 具体实施方式 0024 实施例1 0025 一种用于鉴定中药黄芪的引物对， 所述引物对及其序列为： P1， SEQ ID NO.12； P2， SEQ ID NO.34； P3， SEQ ID NO.56。 0026 所述引物对P1、 P2和P3的上游引物的5， 端加上特异性。

13、的GC发卡结构， 所述发卡结 构的长度为40bp， 序列为SEQ ID NO.7。 0027 所述引物对在制备鉴定中药黄芪试剂盒中的应用。 说明书 2/4 页 4 CN 107236796 A 4 0028 所述试剂盒的组分包括： 引物对、 dNTP、 DNA聚合酶、 LC Green、 反应缓冲液。 0029 所述试剂盒鉴定中药黄芪的步骤包括： 0030 (1)提取黄芪样品的基因组DNA； 0031 (2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板， 以P1为特异性引物， 进行第一轮PCR扩增； 0032 (3)取步骤(2)的扩增产物， 稀释50倍后作为第二轮PCR的模板， 以P2作为特异性引 物。

14、， 进行第二轮PCR扩增； 0033 (4)取第二轮PCR扩增的产物， 稀释100倍后作为第三轮PCR的模板， 以P3作为特异 性引物， 进行第三轮PCR扩增； 0034 (5)收集第三轮PCR扩增的产物， 并采用琼脂糖凝胶电泳检测。 0035 所述黄芪样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。 0036 所述PCR扩增的程序为： 95， 2min； 95， 30s， 52， 30s， 72， 55s， 35个循环； 72 ， 7min。 0037 实施例2 0038 一种用于鉴定中药黄芪的引物对， 所述引物对及其序列为： P1， SEQ ID NO.12； P2， SEQ ID。

15、 NO.34； P3， SEQ ID NO.56。 0039 所述引物对P1、 P2和P3的上游引物的5， 端加上特异性的GC发卡结构， 所述发卡结 构的长度为40bp， 序列为SEQ ID NO.7。 0040 所述引物对在制备鉴定中药黄芪试剂盒中的应用。 0041 所述试剂盒的组分包括： 引物对、 dNTP、 DNA聚合酶、 LC Green、 反应缓冲液。 0042 所述试剂盒鉴定中药黄芪的步骤包括： 0043 (1)提取黄芪样品的基因组DNA； 0044 (2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板， 以P1为特异性引物， 进行第一轮PCR扩增； 0045 (3)取步骤(2)的扩增产物，。

16、 稀释200倍后作为第二轮PCR的模板， 以P2作为特异性 引物， 进行第二轮PCR扩增； 0046 (4)取第二轮PCR扩增的产物， 稀释20倍后作为第三轮PCR的模板， 以P3作为特异性 引物， 进行第三轮PCR扩增； 0047 (5)收集第三轮PCR扩增的产物， 并采用琼脂糖凝胶电泳检测。 0048 所述黄芪样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。 0049 所述PCR扩增的程序为： 95， 2min； 95， 30s， 52， 30s， 72， 55s， 35个循环； 72 ， 7min。 0050 实施例3 0051 一种用于鉴定中药黄芪的引物对， 所述引物对及其序列。

17、为： P1， SEQ ID NO.12； P2， SEQ ID NO.34； P3， SEQ ID NO.56。 0052 所述引物对P1、 P2和P3的上游引物的5， 端加上特异性的GC发卡结构， 所述发卡结 构的长度为40bp， 序列为SEQ ID NO.7。 0053 所述引物对在制备鉴定中药黄芪试剂盒中的应用。 0054 所述试剂盒的组分包括： 引物对、 dNTP、 DNA聚合酶、 LC Green、 反应缓冲液。 0055 所述试剂盒鉴定中药黄芪的步骤包括： 0056 (1)提取黄芪样品的基因组DNA； 说明书 3/4 页 5 CN 107236796 A 5 0057 (2)以步骤。

18、(1)提取的基因组DNA为模板， 以P1为特异性引物， 进行第一轮PCR扩增； 0058 (3)取步骤(2)的扩增产物， 稀释500倍后作为第二轮PCR的模板， 以P2作为特异性 引物， 进行第二轮PCR扩增； 0059 (4)取第二轮PCR扩增的产物， 稀释10倍后作为第三轮PCR的模板， 以P3作为特异性 引物， 进行第三轮PCR扩增； 0060 (5)收集第三轮PCR扩增的产物， 并采用琼脂糖凝胶电泳检测。 0061 所述黄芪样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。 0062 所述PCR扩增的程序为： 95， 2min； 95， 30s， 52， 30s， 72， 55s。

19、， 35个循环； 72 ， 7min。 0063 如图1所示， 将实施例13的扩增产物进行电泳检测， 条带清晰可见， 产物单一。 说明书 4/4 页 6 CN 107236796 A 6 SEQUENCE LISTING 苏州市李良济健康产业有限公司 一种用于鉴定中药黄芪的引物对及其应用 7 PatentIn version 3.3 1 22 DNA 人工序列 1 gctcctccgc ttattgatat gc 22 2 24 DNA 人工序列 2 ggaagtaaaa gtcgtaacaa ggat 24 3 21 DNA 人工序列 3 aagggcattc aggagctcta g 21 4 21 DNA 人工序列 4 gtttacgtgg cctgtttcaa g 21 5 22 DNA 人工序列 5 ggcccgtaac actgtctggt aa 22 6 22 序列表 1/2 页 7 CN 107236796 A 7 DNA 人工序列 6 gcgcgtcgtg aagcgtgaat tc 22 7 40 DNA 人工序列 7 cgcccgccgc gcgcggcggg cggggcgggg gcacgggggg 40 序列表 2/2 页 8 CN 107236796 A 8 图1 说明书附图 1/1 页 9 CN 107236796 A 9 。