技术领域
本发明属于基因工程领域，涉及一种来源于橡胶树具有抗氧化功能的蛋白及其编 码基因与应用。
背景技术
正常生理情况下，植物体内活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）的产生与清 除处于动态平衡状态。干旱、低温、高温、盐胁迫和重金属等逆境条件会破坏植物细 胞内ROS的代谢平衡，造成大量ROS在体内积累。过量积累的ROS不仅可直接攻击 膜系统中不饱和脂肪酸，导致膜脂过氧化及其产物丙二醛（MDA）的产生，进而破坏 了膜结构使膜的流动性下降，还可以造成碱基突变、DNA链的断裂和蛋白质的损伤。 最终引起一系列生理生化功能的改变。如ROS中的氧自由基（OFR）可以通过与膜上 的酶和受体共价结合以及与膜脂质或蛋白上的游离氨基发生交联，从而改变了膜成分 的活性和结构，也可使膜微粘度和膜脆性增加，造成细胞活性物质外溢，进一步扩大 了自由基的损伤作用。总之，当植物体内大量积累ROS时，会严重影响植物的正常生 长发育，甚至导致植物死亡。
植物体在长期进化过程中形成了酶促和非酶促两大类抗氧化系统，它们在植物体 内能有效清除ROS，减轻或避免ROS对植物造成伤害，从而使植物表现出对氧化胁 迫的抗性。酶促抗氧化系统包括超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）、过氧 化氢酶（Catalase，CAT）、抗坏血酸过氧化物酶（Ascorbate Peroxidase，APX）等。非 酶促抗氧化系统主要有抗坏血酸、甘露醇、类黄酮和α-生育酚等。虽然，当植物体受 到氧化胁迫时会启动自身的抗氧化系统，但是随着污染及紫外辐射的日益严重化，增 强植物的抗氧化能力显得尤为重要，这势必会对提高作物及植物来源的工业原料的产 量具有很大的作用。
天然橡胶（顺式-1,4-聚异戊二烯，橡胶烃）是四大重要工业原料之一，是事关国 计民生和国防安全的重要战略物资。随着经济的发展，我国对天然橡胶的供需矛盾日 益突出。已有研究表明橡胶树的排胶时间和死皮是天然橡胶产量的限制因子。ROS能 破坏橡胶树胶乳中黄色体膜，致使胶乳原位凝固，从而引起乳管堵塞，停止排胶，严 重时甚至导致橡胶树死皮发生。因此，提高橡胶树抗氧化能力及对氧化胁迫的适应能 力有助于提高橡胶树胶乳产量。目前在橡胶树中已经发现了超氧化物歧化酶（SOD） 等基因，若能在橡胶树中继续发现新的具有较强抗氧化能力的基因，对于获得抗氧化 能力增强的橡胶树新品种，进而提高橡胶产量将具有重要的作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种来源于橡胶树具有抗氧化功能的蛋白及其编码基因与应 用。
本发明所提供的具有抗氧化功能的蛋白，名称为HbAOP，来源于大戟科橡胶树属 巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）品种热研7-33-97，是如下（a）或（b）：
（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添 加且具有抗氧化活性的由序列1衍生的蛋白质。
为了便于HbAOP蛋白的纯化，可在由序列表中序列1的氨基酸残基序列组成 的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。
表：标签的序列
标签 残基 序列 Poly-Arg 5-6（通常为5个） RRRRR Poly-His 2-10（通常为6个） HHHHHH FLAG 8 DYKDDDDK Strep-tag II 8 WSHPQFEK c-myc 10 EQKLISEEDL
上述（b）中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。 上述（b）中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一 个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变。
编码所述HbAOP蛋白的核酸分子也属于本发明的保护范围。
所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子 也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。
在本发明的一个实施例中，所述核酸分子具体为编码所述HbAOP蛋白的基因（命 名为HbAOP）；所述HbAOP基因是如下1）至4）中任一所述的DNA分子：
1）编码序列为序列表中序列2的第37-1710位所示的DNA分子；
2）序列为序列表中序列2所示的DNA分子；
3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA分子杂交且编码所述HbAOP蛋白的 DNA分子；
4）与1）-3）中任一限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码所述HbAOP 蛋白的DNA分子。
上述严格条件可为用6×SSC，0.5%SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC， 0.1%SDS和1×SSC，0.1%SDS各洗膜一次。
其中，序列2由2197个核苷酸组成，第37-1710位为ORF，编码序列表中序列1 所示的HbAOP蛋白。
含有上述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的 保护范围。
所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。
所述重组表达载体可用现有的表达载体构建。所述表达载体还可包含外源基因的 3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA 片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构 建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特 异型或诱导型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本发 明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子。
在本发明的实施例中，所述重组表达载体中启动所述HbAOP基因转录的启动子 具体为T7启动子。
更为具体的，所述重组表达载体为将所述HbAOP基因与pEASY-E1载体相连后得 到的重组质粒（pEASY-E1-HbAOP）。
所述表达盒由能够启动所述HbAOP基因表达的启动子，所述HbAOP基因，以及 转录终止序列组成。
所述HbAOP蛋白，或所述核酸分子，或所述重组表达载体、表达盒、转基因细 胞系或重组菌在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围：
a1）调控生物的抗氧化能力；
a2）选育抗氧化能力提高的生物品种；
a3）调控生物的抗逆性；
a4）选育抗逆性提高的生物品种；
所述抗逆性可为如下中的任一种：抗旱性、抗低温、抗盐性。
在本发明中，所述调控生物的抗氧化能力具体为提高生物的抗氧化能力；所述调 控生物的抗逆性为提高植物的抗逆性。
所述选育抗氧化能力提高的生物品种的方法可包括将所述HbAOP蛋白表达量较 高的生物作为亲本进行繁殖的步骤。
本发明的另一个目的是提供一种培育抗氧化能力提高的转基因生物的方法。
本发明所提供的培育抗氧化能力提高的转基因生物的方法，具体可包括将编码所 述HbAOP蛋白的基因导入目的生物中得到转基因生物的步骤；所述转基因生物与所 述目的生物相比，抗氧化能力提高。
在所述方法中，所述HbAOP蛋白在所述转基因生物中的表达量高于所述目的生 物；编码所述HbAOP蛋白的基因（即HbAOP基因）是如下1）至4）中任一所述的 DNA分子：
1）编码序列为序列表中序列2的第37-1710位所示的DNA分子；
2）序列为序列表中序列2所示的DNA分子；
3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA分子杂交且编码所述HbAOP蛋白的 DNA分子；
4）与1）-3）中任一限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码所述HbAOP 蛋白的DNA分子。
上述严格条件可为用6×SSC，0.5%SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC， 0.1%SDS和1×SSC，0.1%SDS各洗膜一次。
所述HbAOP基因具体可通过上述任一所述重组表达载体导入所述目的生物中， 得到所述转基因生物。
在上述应用或方法中，所述抗氧化均可具体体现为对过氧化氢胁迫的抗性。
在本发明中，上述所有生物均可为植物、动物或微生物。
在本发明的一个实施例中，所述生物具体为大肠杆菌（如BL21(DE3)）。相应的， 所述抗氧化具体体现在：将转入所述HbAOP基因的所述大肠杆菌（如BL21(DE3)） 培养至OD600为0.4时，用终浓度为1mM的IPTG于37℃诱导2h后所得菌液满足如 下条件中的至少一种：（a）所述菌液的100倍稀释液能够在含有200μmol/L过氧化氢 的固体培养基上生长；（b）所述菌液的50倍稀释液能够在含有400μmol/L过氧化氢的 固体培养基上生长；（c）所述菌液的10倍稀释液能够在含有800μmol/L过氧化氢的固 体培养基上生长。以上（a）-（c）中所述固体培养基均为含有相应过氧化氢的LB固 体培养基。
在本发明中，所述HbAOP蛋白是按照如下方法制备得到的：将含有所述HbAOP 蛋白编码基因（序列2）的以上所述重组表达载体（如pEASY-E1-HbAOP）导入大肠 杆菌（如BL21(DE3)）表达得到所述HbAOP蛋白。
扩增所述HbAOP基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。
实验证明，HbAOP在橡胶树叶片中表达量最高，该基因的表达受过氧化氢的调控。 将HbAOP基因在大肠杆菌中原核表达能提高大肠杆菌的抗氧化活性，证明HbAOP具 有抗氧化作用。可将HbAOP基因转入植物或微生物中，提高其对活性氧的清除能力， 从而提高抗氧化胁迫的能力。
附图说明
图1为HbAOP基因在橡胶树不同组织中的表达模式分析。纵坐标的相对表达量 即为HbAOP基因的相对表达量（以胶乳中HbAOP基因的表达量为1）。
图2为不同逆境胁迫处理下橡胶树HbAOP基因的表达模式分析。纵坐标的相对 表达量即为HbAOP基因的相对表达量（胁迫处理0h的HbAOP基因的表达量为1）。
图3为重组菌BL21(DE3)/pEASY-E1-HbAOP菌液PCR产物电泳图谱。其中1： marker；2：重组菌BL21(DE3)/pEASY-E1-HbAOP菌液PCR产物。
图4为HbAOP转基因大肠杆菌HbAOP蛋白的原核表达分析。其中，1：marker； 2：重组菌BL21(DE3)/pEASY-E1诱导前；3：重组菌BL21(DE3)/pEASY-E1诱导2h；4： 重组菌BL21(DE3)/pEASY-E1-HbAOP诱导前；5：重组菌BL21(DE3)/pEASY-E1-HbAOP 诱导2h；6：重组菌BL21(DE3)/pEASY-E1-HbAOP诱导4h；7：重组菌 BL21(DE3)/pEASY-E1-HbAOP诱导6h。箭头所指条带为受IPTG诱导后产生的特异表 达的目标蛋白。
图5为HbAOP转基因大肠杆菌的抗氧化特性分析。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
pMD18-T载体：购自宝生物工程（大连）有限公司，产品目录号为6011。
pEASY-E1载体：购自北京全式金生物技术有限公司，产品目录号为CE101-01。
大肠杆菌BL21(DE3)：购自Novagen公司，产品目录号为69450-3。
实施例1、橡胶树抗氧化蛋白HbAOP及其编码基因的获得
根据橡胶树胶乳转录组深度测序数据库，选定目的片段，设计特异引物，然后利 用cDNA末端快速扩增技术（RACE），最终获得包含完整读码框的cDNA序列。
具体方法如下：
（1）EST片段克隆
特异引物设计如下：
P1(正向)：5’-ATGGCTAATAAAAATGCTGA-3’；
P2(反向)：5’-TCCATCAAAGCAACTGGAGT-3’；
以巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）品种热研7-33-97（中国热带农业科学院橡胶 研究所培育，中国热带农业科学院橡胶研究所长期有种苗出售）胶乳RNA随机引物 反转录获得的cDNA为模板，P1和P2为引物进行PCR扩增。扩增程序为95℃预变 性5min；94变性30s，48℃变性1min，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。 获得一段698bp左右的核苷酸片段。PCR反应体系（25μl）如下：ddH2O18.3μl，10×PCR 缓冲液2.5μl，dNTP Mixture（2.5mmol/L）2.5μl，Taq酶（5U/μl）0.2μl，引物P1（10 mmol/L）0.25μl，引物P2（10mmol/L）0.25μl，模板（反转录的胶乳cDNA）1μl。
（2）5’端RACE
根据步骤（1）EST片段的测序结果设计5’RACE巢式引物，序列如下：
5’RACE-GSP（第一轮引物）：5’-AGGAATGAAGGGCCGCCCCCCAACTGA-3’；
5’RACE-NSP（第二轮引物）：5’-CTTTCCACGCCCCTCAATTAATGTGACA-3’；
按照Clontech公司SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit说明书步骤，以巴西 橡胶树热研7-33-97胶乳RNA为模板，用5’-RACE CDS引物A（5’-(T)25VN-3’(N=A， C，G或T；V=A，G或C)）和SMART II A oligo反转录合成5’RACE第一链cDNA。 以2.5μL5’RACE第一链cDNA为模板，使用终浓度分别为1×UPM和0.2μmol/L的 5’RACE-GSP引物，在50μL体系中进行PCR扩增。扩增程序为95℃预变性5min； 94℃变性30s，72℃延伸2min，5个循环；94℃变性30s，70℃退火30s，72℃延伸 2min，5个循环；94℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸2min，25个循环；72℃ 延伸10min。PCR产物稀释100倍后，取1μL稀释产物作为模板，使用终浓度均为 0.2μmol/L的NUP和5’RACE-NSP进行第二轮巢式PCR扩增，扩增程序同第一轮。 获得一段636bp左右的核苷酸片段。
（3）3’端RACE
根据步骤（1）EST片段的测序结果设计3’RACE巢式引物，序列如下：
3’RACE-GSP（第一轮引物）：5’-GGACAAGAATGGAGCAATAGAGGT-3’；
3’RACE-NSP（第二轮引物）：5’-TGGGCAGTTGGAGATGTTACAGA-3’；
按照Clontech公司SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit说明书步骤，以巴西 橡胶树热研7-33-97胶乳RNA为模板，用3’-RACE CDS引物A （5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)30VN-3’(N=A，C，G或T；V=A，G 或C)）反转录合成3’RACE第一链cDNA。以2.5μL3’-RACE第一链cDNA为模板， 使用终浓度分别为1×UPM和0.2μmol/L的3’RACE-GSP引物，在50μL体系中进行 PCR扩增。扩增程序为95℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸2 min，25个循环；72℃延伸10min。PCR产物稀释100倍后，取1μL稀释产物作为模 板，使用终浓度均为0.2μmol/L的NUP和3’RACE-NSP进行第二轮巢式PCR扩增， 扩增程序同第一轮。获得一段1015bp左右的核苷酸片段。
（4）cDNA全长克隆
根据步骤（1）-（3）获得EST片段、5’端和3’端序列，利用SECentral软件进行 序列拼接，得到目的基因全长cDNA的拼接序列，如序列表中序列2所示。
为了验证拼接序列的正确性，本发明的发明人根据拼接结果设计5’末端正向引物 AOP-F和3’末端反向引物AOP-R。以巴西橡胶树热研7-33-97胶乳RNA的第一链 cDNA为模板，使用PyrobestTM DNA聚合酶进行PCR扩增。扩增程序：95℃预变性5 min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸2.5min，30个循环；72℃延伸10min。
AOP-F：5’-AAAAGAACTACGCATACCTT-3’（序列2的第1-20位）；
AOP-R：5’-GTTAAAGATTGAAGGCTGTG-3’（序列2的第2178-2197位的反向 互补序列）。
反应结束后，进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。结果显示所得PCR扩增产物的大小 约为2197bp。
进一步将目的条带回收并纯化，与pMD18-T载体相连，将得到的重组质粒，明明 为pMD18-HbAOP。对重组质粒pMD18-HbAOP进行序列测定。测序结果显示，重组 质粒pMD18-HbAOP中的外源基因序列为序列2，与预期一致。将序列2所示基因命 名为HbAOP，序列2的第37-1710位为其开放阅读框（ORF），编码序列表中序列1 所示的蛋白质（命名为HbAOP）。
实施例2、橡胶树内HbAOP基因表达模式研究
一、HbAOP组织表达模式分析
以巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）品种热研7-33-97的叶片、树皮、胶乳、雌花、 和雄花RNA随机反转录的cDNA为模板，用HbAOP基因特异引物HbAOP-QF和 HbAOP-QR采用宝生物工程（大连）有限公司的Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）（产品目录号为RR820Q），进行实时荧光定量PCR。以18S rRNA为内参，引物 为18SQF和18SQR。
扩增HbAOP基因的引物：
HbAOP-QF：5’-GCTGAGTTGCAACGCCTTAC-3’（序列2的第556-575位）；
HbAOP-QR：5’-ACAATCTTTCCACGCCCCTC-3’（序列2的第622-641位的反向 互补序列）。
扩增内参18S rRNA基因的引物：
18SQF：5’-GCTCGAAGACGATCAGATACC-3’；
18SQR：5’-TTCAGCCTTGCGACCATAC-3’。
PCR反应体系（20μl）如下：ddH2O7.4μl，Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus） 10μl，正、反向引物（10mmol/L）各0.3μl，模板（反转录的cDNA）2μl。扩增程序 为：95℃预变性30s；94℃变性5s，60℃退火20s，72℃延伸20s，40个循环。
实验重复三次，结果取平均值。
数据处理：采用Pfaffl法对荧光定量PCR结果进行分析（Pfaffl MW.2001.A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR.Nucl Acids Res,29(9): e45）。
结果显示：HbAOP基因在橡胶树叶片中表达量最高，在胶乳中表达量最低（图1）。
二、逆境对HbAOP基因表达的影响
选择过氧化氢、干旱、低温和氯化钠等4种处理来研究逆境条件对HbAOP基因 表达的影响。
过氧化氢处理选用巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）品种热研7-33-97未开割幼树 为实验材料，处理方法参照文献（Zhu JH,Zhang QQ,Wu R,Zhang ZL.2010.HbMT2,an ethephon-induced metallothionein gene from Hevea brasiliensis responds to H2O2 stress. Plant Physiol Biochem,48:1-6）进行，以不作任何处理的未开割幼树为对照，分别于处 理后0、6、24和48h割胶收集胶乳提取RNA。
干旱、低温和氯化钠等胁迫处理选用巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）品种热研 7-33-97组培苗（中国热带农业科学院橡胶研究所组培，中国热带农业科学院橡胶研究 所长期有售）为实验材料，将组培苗根部泥土冲洗干净，放入清水中于30℃，湿度80%， 12h光照（光照强度480μmol/(m2·s)），12h黑暗静置培养2-3d后进行处理。干旱处 理具体参照文献（Zhang QQ,Zhu JH,Ni YM,Cai YB,Zhang ZL.2012.Expression profiling of HbWRKY1,an ethephon-induced WRKY gene in latex from Hevea brasiliensis in responding to wounding and drought.Trees,26:587-595）方法进行，低温处理方法具 体参照文献（安泽伟,陈根辉,程汉,赵彦宏,谢黎黎,黄华孙.2010.橡胶树冷应答转 录组cDNA-AFLP分析.林业科学,46:62-67）方法进行，氯化钠胁迫处理具体参照文 献（王瑞刚,陈少良,刘力源,郝志勇,翁海娇,李鹤,杨爽,段杉.2005.盐胁迫下3 种杨树的抗氧化能力与耐盐性研究.北京林业大学学报,27:46-52）方法进行，以不作 任何处理的组培苗为对照，分别采集处理后0、3、24和48h叶片提取RNA。
各处理组均参照步骤一的方法进行实时荧光定量PCR，检测不同胁迫处理前后 HbAOP基因的表达情况。
实验重复三次，结果取平均值。
结果显示：在所测的4种胁迫处理中，HbAOP基因的表达受过氧化氢诱导最为显 著（图2中A），干旱（图2中B）和低温（图2中C）也能诱导HbAOP基因表达， 但诱导程度依次递减。氯化钠对HbAOP的表达有抑制作用（图2中D）。
实施例3、HbAOP转基因菌株的获得及其抗氧化功能验证
一、重组表达载体pEASY-E1-HbAOP的构建及鉴定
利用pEASY-E1载体构建HbAOP基因的原核表达载体，具体方法如下：
根据HbAOP基因序列（序列2）设计正向引物HbAOP-F和反向引物HbAOP-R， 以实施例1获得的pMD18-HbAOP质粒DNA为模板，PCR扩增HbAOP基因的开放 阅读框。
HbAOP-F：5’-ATGGCTGCAGCTACTTCTCT-3’（序列2的第37-56位）；
HbAOP-R：5’-CTAAACACCTGCTGTAGCTT-3’（序列2的第1691-1710位的反 向互补序列）。
反应程序：95℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min， 30个循环；72℃延伸10min。
反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳检测。结果显示，扩增得到大小约为1674bp 的目的条带。将PCR产物胶回收后测序，测序结果表明该片段具有序列表中序列2的 第37-1710位核苷酸。将该片段与pEASY-E1载体连接，对重组载体进行测序鉴定。将 测序正确的含有序列表中序列2的第37-1710位核苷酸序列、读框准确的重组表达载 体命名为pEASY-E1-HbAOP。在重组表达载体pEASY-E1-HbAOP中，启动所述HbAOP 基因转录的启动子为T7启动子。
二、HbAOP转基因大肠杆菌的获得及鉴定
1、HbAOP转基因大肠杆菌的获得
将步骤一获得的重组载体pEASY-E1-HbAOP导入大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重 组表达菌。取重组大肠杆菌的菌悬液采用引物HbAOP-F和HbAOP-R（序列同上）进 行PCR扩增，将经鉴定得到大小为1674bp目的条带（序列2的第37-1710位）的重 组菌命名为BL21(DE3)/pEASY-E1-HbAOP（图3）。同时设置向大肠杆菌BL21(DE3) 中导入pEASY-E1空载体的对照，所得重组菌命名为BL21(DE3)/pEASY-E1。
2、HbAOP转基因大肠杆菌中HbAOP蛋白的原核表达
将步骤1鉴定正确的两种重组菌（BL21(DE3)/pEASY-E1-HbAOP和 BL21(DE3)/pEASY-E1）在含100mg/mL氨苄青霉素的LB培养基中培养至OD600=0.4， 添加IPTG至终浓度1mmol/L，37℃诱导2h、4h或6h。同时以未加IPTG的培养基 培养同样的重组菌作为对照。离心收集菌体，菌体蛋白进行12%SDS-PAGE电泳检测。
实验重复三次。
结果表明，在IPTG诱导下重组菌BL21(DE3)/pEASY-E1-HbAOP中成功表达了 HbAOP蛋白（诱导2h时表达量已经很高），HbAOP基因实现了高效异源表达，并且 表达HbAOP蛋白的表观分子量与理论分子量相近，约为60kDa（图4）。
三、HbAOP转基因大肠杆菌的抗氧化活性验证
抗氧化胁迫实验参照文献（Gnanasekar M,Ramaswamy K.2007.Translationally controlled tumor protein of Brugia malayi functions as an antioxidant protein.Parasitol Res. 101(6):1533–1540）方法进行。具体如下：
取以上步骤二中经过终浓度为1mmol/L的IPTG于37℃诱导2h的两种重组菌 BL21(DE3)/pEASY-E1-HbAOP（已证实有HbAOP蛋白的表达）和BL21(DE3)/pEASY-E1 的菌液，分别用含100mg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基，按照体积比为1:10、1:25、 1:50、1:100的比例稀释菌液，分别取2μL稀释液点样于含200、400和800μmol/L过 氧化氢的LB固体培养基平板上，晾干后，37℃培养过夜。观察结果并照相。同时以 不加过氧化氢的平板上点样作为对照。
实验重复三次。
结果如图5所示，在含200μmol/L过氧化氢的LB固体培养基平板上，重组菌 BL21(DE3)/pEASY-E1只有1:10稀释梯度下菌液能够生长，其余稀释梯度下均不生长； 而重组菌BL21(DE3)/pEASY-E1-HbAOP在4个稀释梯度下均能生长。在含400μmol/L 过氧化氢的LB固体培养基平板上，重组菌BL21(DE3)/pEASY-E1完全不能生长；而重 组菌BL21(DE3)/pEASY-E1-HbAOP在1:100稀释梯度下不能生长，其余稀释梯度仍能 生长。在含800μmol/L过氧化氢的LB固体培养基平板上，重组菌BL21(DE3)/pEASY-E1 完全不能生长；而重组菌BL21(DE3)/pEASY-E1-HbAOP在1:10稀释梯度下仍能生长， 其余稀释梯度不能生长。以上结果表明重组菌BL21(DE3)/pEASY-E1-HbAOP所表达的 HbAOP蛋白具有明显的抗氧化活性。
综合以上各实施例的实验结果，可见，HbAOP基因可作为橡胶树转基因育种的重 要靶标基因，有望通过调控这个基因的表达来调控乳管中活性氧的清除，保障逆境条 件下橡胶树的正常生长和生产，从而最大潜力的挖掘橡胶树的产胶能力。此外，该基 因可作为重要的基因资源，还可能在橡胶树以外的其他植物或微生物的抗逆基因工程 中得到应用。