一.技术领域
本发明涉及一种结缔组织生长因子C区抗原的制备方法。
二.背景技术
CTGF是高度保守的CCN多肽家族(CTGF，CYR61，Nov)成员之一， 该蛋白为肝素结合型，含349个氨基酸，富含半胱氨酸，其38个保守的半胱氨 酸残基分成两个节段，其中22个在N末端区，16个在C末端区，蛋白结构主 要分为4个区为：胰岛素样生长因子结合蛋白区，von Willebrand因子C型重复 区，血小板反应蛋白(thrombospondin)1型重复区以及生长因子半胱氨酸群， Mr38000，主要由成纤维细胞，平滑肌细胞和内皮细胞合成分泌，成年哺乳动物 心，脑，肾，肺，肝以及胎盘中均有表达。
国外有报道，将CTGF基因克隆入pcDNA3.1载体，在哺乳动物细胞内表达， 纯化目的蛋白后作为抗原免疫动物获得抗体。由于CTGF蛋白有4个功能区，前 3个功能区与血清内其它细胞因子有共同抗原，用CTGF蛋白全序列作为抗原免 疫动物获得的抗体，将会与血清中其它细胞因子发生交叉反应，测定结果可能为 假阳性，给临床诊断带来错误判断，因此选用CTGF特异的C区作抗原获得的 抗体只争对CTGF发生抗原-抗体反应，而不与其它细胞因子发生反应，具有高 度的选择性，消除了由于交叉反应导致的假阳性结果。因此制备CTGF特异的C 区抗原具有十分重要的意义。
三、技术内容
本发明提供一种能够提高体内外蛋白分子稳定性并能增强免疫活性的结缔 组织生长因子C区抗原的制备方法。
本发明采用如下技术方案来解决其技术问题：
本发明即一种结缔组织生长因子抗原的制备方法，
第一步：用NheI和XbaI酶对pCOMB3载体进行双酶切，切除两酶切位点 NheI和XbaI之间的272bp条带后的载体用T4DNA连接酶自连后转化大肠杆 菌JM109，然后，以质粒pET-28(a)+作模板，分别以
p1：5’-GG CTCGAGGCCAACTCTAGTATGGCCC-3’及
p2：5’-GG ACTAGTCTAACCAGCACTTCAGTGGGAA-3’ 为上、下游引物，PCR扩增后，可见550bp条带的扩增产物，回收该条带，并 将回收的条带与被切除272bp后的pCOMB3载体连接，经转化JM109后筛选得 到阳性质粒pKM；
第二步：用组织贴壁法进行人内皮细胞原代培养，用50mmol/L葡萄糖修饰 的牛血清白蛋白对原代培养后的内皮细胞干预8h，0.125％胰蛋白酶消化后，用 Trizol法提取RNA，用逆转录试剂盒合成cDNA，在1.5ml管中依次加入：双蒸 H2O 31.5μl，10×Taq buffer 5μl，10mol/L dNTP 1μl，浓度为25pmol/μl的引 物
p3：5’-CCC GGATCCGAAGCGGACCTAGAG-3’1μl，
p4：5’-CCC AAGCTTTGCCATGTCTCCGTG-3’1μl， 浓度为0.65μg/μl的cDNA模板10μl，浓度为5U/μl的TaqPlus聚合酶0.5 μl，置于PCR仪扩增，扩增条件：94℃ 5min变性，94℃ 1min，65℃ 30sec， 72℃ 1min，35个循环，72℃延伸10min，4℃保温，再用SpeI和XhoI酶对 PCR产物与阳性质粒pKM分别进行双酶切后，用T4DNA连接酶使两个片段通 过粘性末端相连，转化大肠杆菌JM109，从中获得阳性质粒pKMc1； 编码结缔组织生长因子C区242-349位氨基酸的核苷酸序列
第三步：将含阳性质粒pKMc1的大肠杆菌JM109单菌落扩增后，用异丙基 -β-D-硫代半乳糖苷37℃诱导3h，得到含有结缔组织生长因子C区242-349位 氨基酸的大肠杆菌，超声破碎细胞，用镍离子树脂亲和层析获得结缔组织生长因 子抗原。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明从血管内皮细胞中提取总RNA，逆转录合成cDNA。设计特异性引 物，扩增CTGF C区242-349基因，插入噬菌体包膜蛋白基因III的上游，两个 基因用GGT GGC GGT GGC TCT相连，在启动子LacZ的作用下，翻译成 CTGF-GGGGS-pIII的融合蛋白。该融合蛋白在引导肽的作用下，定位于细胞周 质并自动折叠成具有免疫活性的蛋白分子。
a.用DNA重组技术将结缔组织生长因子C区抗原与丝状噬菌体III基因蛋白 通过GGGGS柔性连接肽相连，在启动子LacZ的作用下翻译成结缔组织生长因 子-GGGGS-pIII的融合蛋白。该融合蛋白在引导肽的作用下，定位于细胞周质并 自动折叠成具有免疫活性的蛋白分子，避免胞浆内蛋白酶的切割。
b.由于pIII蛋白片段是噬菌体包膜蛋白成分，对于人体来说是一种异源蛋白， 与人体血清或血浆成分无交叉反应，因此可以作为标准品或质控品不影响结果， 同时可在体外显著增加抗原的稳定性。
c.该融合蛋白由于含有噬菌体包膜蛋白成分，因此作为异种抗原免疫动物， 对于制备分子量小于20000的CTGF C区的抗体时，该片段是一种较好的免疫增 强剂。
d.与真核表达载体相比原核表达载体具有较高的产量。
四、附图说明
图1是本发明阳性质粒pKMc1图。
五、具体实施方案
1融合表达载体的构建
1.1pCOMB3第二个克隆位点的切除
用NheI+XbaI对购于美国SCRIPPS研究所的pCOMB3进行双酶切，可见272 bp条带，切除上述片段后，将切除272bp条带后的剩余大片段回收，并用T4 DNA连接酶自连后转化大肠杆菌JM109，扩增后抽提质粒，分别用NheI，XbaI， SpeI，XhoI及XhoI+SpeI酶切鉴定，结果显示：XbaI，NheI无酶切，SpeI，XhoI 可见单酶切条带，酶切位点正确；
1.2片段插入及鉴定
以购于美国NOVAGEN公司的pET-28(a)+作模板，
p1：5’-GG CTCGAGGCCAACTCTAGTATGGCCC-3’，
p2：5’-GG ACTAGTCTAACCAGCACTTCAGTGGGAA-3’
为上、下游引物，PCR扩增后，可见550bp条带，回收片段后与相同酶切的切 除272bp的pCOMB3连接，转化JM109后筛选阳性质粒，1.5％琼脂糖电泳条带 出现在空载体之后，随机挑选10个单菌落进行PCR检查，其中9个出现550bp 条带，阳性率90％。SpeI+XhoI双酶切检查，可见550bp及3800bp条带。质粒 送生工测序，结果与预期序列一致，测序结果正确的质粒命名为pKM；
2结缔组织生长因子(CTGF)C区基因的克隆
2.1人内皮细胞培养及总RNA的提取
用组织贴壁法进行人内皮细胞原代培养，含20％小牛血清的DMEM传代后， 用50mmol/L葡萄糖修饰的AGE-BSA干预8h，0.125％胰蛋白酶消化后加5ml Trizol试剂，用26号针头抽吸2次，室温5min，加1ml氯仿激烈震荡15s，4 ℃10000r/min离心10min，弃上清，沉淀用75％乙醇洗涤，12000r/min离心15 min，弃上清，室温干燥5～10min，用DEPC处理的双蒸水溶解，-70℃保存。 取适量稀释后测定OD260与OD280的比值，计算RNA浓度(OD260×稀释倍 数×40μg)为0.65μg/μl，取5μl用1.2％琼脂糖电泳，结果显示RNA完整； 2.2cDNA第一链的合成
RNA 20μl(13μg)加2μl Oligo(dT)18primer，混匀3～5s，70℃ 5min， 冰浴冷却5min，以次加入：5×M-Mulv buffer 4μl，10mmol/L dNTP 2μl， 核酶抑制剂(5U/μl)1μl，37℃ 5min，加M-Mulv 1μl(100U/μl)，37℃反 应60min，最后70℃10min灭活，-20℃保存；
2.3结缔组织生长因子C区基因的扩增
在Eppendorf管中依次加入：dd H2O 31.5μl，10×Taq buffer 5μl，10mol/L dNTP 1μl，p3(25pmol/μl)：5’-CCC GGATCCGAAGCGGACCTAGAG-3’1μl， p4(25pmol/μl)：5’-CCC AAGCTTTGCCATGTCTCCGTG-3’1μl，cDNA第一 链(6.5μg)10μl，TaqPlus(5U/μl)0.5μl，最后加一滴矿物油，置于PCR 仪。扩增条件：94℃ 5min变性，94℃ 1min，65℃ 30sec，72℃ 1min，35 个循环，72℃延伸10min，4℃保温。产物用1.2％琼脂糖电泳检查，结果显示 在350bp处有特异扩增条带。
3阳性质粒-结缔组织生长因子(pKM-CTGF)表达载体的构建及鉴定
PCR产物与载体pKM经SpeI+XhoI双酶切，回收相应片段，用T4连接酶 使两个片段通过粘性末端相连，转化JM109。随机挑取8个转化子扩增后抽提质 粒，分别用PCR及SpeI+XhoI双酶切等方法作鉴定。其中有1个克隆出现350bp 条带，酶切鉴定出现3800bp及350bp两条带。阳性质粒测序结果与预期序列一 致。该质粒命名为阳性质粒pKMc1(图1)。
4结缔组织生长因子CTGF融合蛋白的表达及纯化
挑取含pKMc1质粒的JM109单菌落接种400ml含Amp(50mg/L)的LB中， 37℃振摇至OD600为0.5，加IPTG至终浓度1mmol/L，37℃诱导3h。分装50ml 离心管，5000r/min，离心15min，弃上清，加入20ml NTA-0 Buffer及1mmol/L PMSF，4mg溶菌酶，混匀使细胞悬浮，冰上放置30min，超声破碎细胞。加入 2ml Triton X-100，充分混匀，冰上放置15min，继续超声破碎细胞至粘稠度下 降。加入1mmol/L MgCl2及200μg DNase混匀，室温放置10min，15000r/min 4℃离心15min，取上清，置于-20℃保存。
将NTAResin装入2×5cm玻璃柱中，用10倍体积NTA-0 Buffer平衡，将 样品加入柱中，流速控制在15ml/h左右，用5倍体积的NTA-0 Buffer洗涤，流 速控制在30ml/h左右。然后分别用NTA-20 Buffer，NTA-40 Buffer，NTA-60 Buffer，NTA-80 Buffer，NTA-100 Buffer，NTA-200 Buffer，NTA-1000 Buffer洗 脱，流速控制在15ml/h左右，收集洗脱峰，每管收集一个NTA体积。紫外检测 蛋白分布情况，并用SDS/PAGE鉴定蛋白纯度。结果显示：在35ku处出现很浓 的蛋白条带，与预期分子量一致，而pKM及JM109在相应位置未出现条带，扫 描分析该条带占菌体总蛋白的40.3％，样品经NTA Resin纯化后呈现单条带。 5结缔组织生长因子CTGF融合蛋白免疫活性测定
将纯化后的CTGF融合蛋白按250ng/孔包被96孔板，以含pKM的JM109 菌体蛋白作阴性对照，4℃过夜。含20％小牛血清PBS 37℃封闭2h，PBST洗涤 5次，每孔加CTGF单抗(1μg/ml)100μl，37℃1h，PBST洗涤5次，每孔加 HRP标记的羊抗鼠二抗100μl，37℃1h，PBST洗涤5次后加TMB显色剂100 μl，室温反应20min，加1mol/L HCl终止反应，在全自动酶标仪上扫描测定在 λ＝450nm时的吸光度值。结果显示：CTGF融合蛋白包被孔OD450平均值为 2.96，阴性对照OD450平均值为0.18，以测定值大于2倍阴性对照OD值为Cut Off值，判定测定结果为阳性。
CTGF融合蛋白分别置于-20℃、4℃、37℃保存，每周测定一次免疫学活性， 至12周时OD450平均值分别为：2.85、2.79和2.61，活性分别为96.3％、94.2％ 和88.2％，显示该融合蛋白具有较高的稳定性。