技术领域
本发明涉及一种笼状多异戊烯基xanthones类化合物及其制备方法和在医药上的应用。
背景技术
随着物质生活水平提高、环境污染加剧等因素的影响，恶性肿瘤的发病率正逐年攀升。现有的抗肿瘤药物品种有限，毒副作用大，已经远远不能满足临床的用药需求。
藤黄为藤黄科(Guttifera)植物藤黄树(Garcinia hanburyi Hook F.G.)的树干被割伤后所分泌出的胶状树脂。呈红黄色或橙红色，主产柬埔寨、泰国和越南，我国广东省和海南省有栽培。藤黄为树脂70％-80％，树胶15％-25％等的混和物。其中含藤黄酸(gambogic acid)22.75％-36.59％，新藤黄酸(neogambogic acid)、别藤黄酸(allogambogic acid)等成分。中医用于攻毒，消肿，祛腐敛疮，止血，杀虫。主治痈疽肿毒，溃疡，湿疮，肿瘤，顽癣，跌打损伤，创伤出血及烫伤。国外用作利尿剂，治疗水肿和脑出血时降血压等，收载于美国药典第十版。近20多年来，国内外特别是我国学者对藤黄及其活性成分藤黄酸等做了大量的研究工作。藤黄及藤黄酸等用于治疗肿瘤疗效显著，毒副作用小，活性成分性质稳定，已引起广泛关注。
生品藤黄有大毒，严重者剧烈腹泻、腹痛，甚至脱水、休克，故一般不能内服，主要是外用治疗痈疽肿毒、顽癣。生品藤黄经炮制后，不仅保证药物的净度，而且制后毒性降低，可供内服，用于跌打损伤，金疮肿毒，肿瘤，如黎峒丸。
藤黄用药始于唐代，其炮制始于清代，藤黄的传统炮制方法主要有清水制(载于《本草纲目拾遗》)，荷叶制(载于《医宗金鉴》)、豆腐制和山羊血制(载于《外科证治全生集》)。现代对藤黄的炮制主要是倾向于两种方法：清水制和高压蒸制，具有辅料易得，操作方便等特点。
藤黄酸(Gambogic acid)的结构式如下：
现有技术中，表藤黄烯酸(epigambogellic acid)为已知化合物，其结构式如下：
研究表明，藤黄酸对人肝细胞性肝癌SMMC-7721细胞株和QGY-7701细胞株有明显增殖抑制作用，并呈剂量依赖性，而对正常人肝组织L-02细胞株作用相对较弱。藤黄酸的主要毒性为肝功能损害、疼痛。
综上所述，鉴于现有技术中治疗肿瘤药物品种有限且毒副作用大，发明安全有效的新化合物十分必要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题之一是提供一种具有抗肿瘤活性的化合物。
本发明所要解决的另一个技术问题在于提供一种制备上述化合物的方法。
本发明所要解决技术的技术问题还在于上述化合物可用于制备抗肿瘤药物。
为了解决上述技术问题，本发明提出下列技术方案：
下式表示的表藤黄醇酸(Epigambogollic acid)，其结构式为：
所述表藤黄醇酸的制备方法，其特征在于所述的方法由下列步骤组成：
(1)取藤黄酸，加入其质量80-120倍量的水，油浴加热回流24-60h，减压浓缩蒸干，即得残留物；
(2)制备液相分离：
色谱条件如下：以规格为10μm，19mm×300mm的μBondapark C18柱为色谱柱；以体积比为85∶15的甲醇-1％冰醋酸为流动相，流速为16mL/min，检测波长为360nm，柱温为30℃；
取前步所得残留物，用流动相溶解，滤过，注入制备液相色谱仪，收集出峰时间为14-16min之间的馏分，合并，减压浓缩至干，即得。
所述的表藤黄醇酸在制备抗肿瘤药物中的应用。
表藤黄醇酸的制备及结构解析的资料见试验一。
试验一、表藤黄醇酸的制备及结构解析。
1制备方法：按实施例3制备。
2结构鉴定数据如下：
2.1参照化合物表藤黄烯酸(epigambogellic acid)的波谱数据
将表藤黄烯酸(epigambogellic acid)溶于氘代氯仿，以TMS为内标，进行检测，其NMR数据见表1：
表1表藤黄烯酸的核磁相关数据
2.2表藤黄醇酸的结构鉴定
2.2.1UV鉴定
取适量化合物，以甲醇为溶剂，制成浓度为0.01mg/mL的溶液，室温下(25℃)检测，紫外的吸收光谱见说明书附图1，最大吸收值在215nm，360nm，与藤黄酸相比，缺少了280nm处的紫外吸收。
2.2.2MS鉴定
取适量化合物，以甲醇为溶剂，制成浓度为0.01mg/mL的溶液，以甲醇-1％醋酸为流动相，蠕动进样5μL。结果见说明书附图2，高分辨质谱给出化合物[M+H]+的准分子离子峰m/z647.3228，确定该化合物的分子式为C38H46O9，m/z629为其[M-H2O]+峰，m/z573为其[M-H2O-C4H7]+峰，m/z679为其[M+Na]+峰。
2.2.3NMR鉴定
将化合物溶于氘代氯仿，以TMS为内标，进行检测，结果见说明书附图3-8。化合物的NMR数据见表2：
表2表藤黄醇酸的核磁相关数据
2.2.4化合物的结构解析
黄色油状化合物，易溶于氯仿，10％硫酸乙醇溶液显色后黄色加深，提示可能为xanthone类化合物。1H-NMR谱中，给出一个与羰基缔合的羟基质子信号δ13.93(1H，s)，两个典型的异戊烯基上的烯氢质子信号，δ4.98和δ6.25(each，1H，m)，另外，可见8个甲基单峰质子信号，分别位于δ1.14、δ1.26、δ1.36、δ1.56、δ1.63、δ1.69、δ1.72和δ1.72(each，3H，s)。13C-NMR谱中，共给出38个碳信号，其中，δc203.7为酮羰基信号，δc179.0为不饱和酮羰基信号，δc167.8为羧基信号。1H-NMR谱中，63.46(1H，dd，J＝4.5，6.9Hz，H-11)、δ2.29(1H，dd，J＝4.5，9.2Hz，Ha-21)和δ2.49(1H，d，J＝9.2Hz，Ha-22)为双环[2，2，2]辛烷上的特征质子信号。结合碳谱中出现的三个连氧碳信号δc91.1、δc84.3、δc83.9，可推测该化合物为一笼状多异戊烯基xanthones类化合物。与已知化合物表藤黄烯酸(epigambogellic acid)相比，多了一个甲基单峰质子信号，少了末端双键质子信号，判断为C-38、C-40位置的双键与水发生加成反应。同时，其ROESY谱中，未见到H-37与H-19的空间位置相关信号，提示19-甲基与37-H在六元环的异侧。经检索，化合物为一未见文献报道的新化合物，命名为表藤黄醇酸epigambogollic acid。其结构式见说明书附图9。
表藤黄醇酸抗肿瘤的药理活性可以通过下述试验体现。
试验例二表藤黄醇酸对肝癌细胞SMMC-7721、人正常肝细胞L-02的抑制作用研究
1实验材料
1.1药物
表藤黄醇酸，按实施例3制备。藤黄酸，自制。
1.2主要试剂、耗材
新生牛血清(FBS)：杭州四季青生物工程材料有限公司；
RPMI Medium1640培养基：GIBCOTMInvitrogen Corporation，Cat.No.31800-014.Lot No.1279327；
Costar96孔板，细胞培养瓶，美国Corning公司；
二甲基亚砜(DMSO)，Biosharp公司，Lot：2010/10；
噻唑蓝(MTT)：Biosharp，Lot：2010/08；
NaCl：汕头市西陇化工厂有限公司，分析纯，批号：080916；
KCl：南京化学试剂厂，分析纯，批号：830602；
KH2PO4：上海试剂二厂，分析纯；批号：950215；
Na2HPO4-12H2O：上海凌峰化学试剂有限公司，分析纯；批号：080102；
水为超纯水，其它试剂均为分析纯。
1.3主要仪器
酶标仪：Power Wave X340，BIO-TEK INTRUMENTS，Inc
超净工作台：苏州市净化设备有限公司；
LDZ5-2低速自动平衡离心机：北京医用离心机厂；
Serious II water jacketed CO2Incubator：Thermo Electron Corporation；
Olympus CKX31显微镜
电子天平：FA2004N上海精科(万分之一)，Sartorius BT125D(十万分之一)
手提式压力蒸汽灭菌器YXQ.SG41.280，上海华线医用核子仪器有限公司
1.4细胞株
人肝癌细胞SMMC-7721，人肝正常细胞L-02，由江苏省炮制研究重点实验室和临床药理实验室提供。
2方法和结果
2.1主要试剂的配制
2.1.1PBS溶液的配制
精密称取NaCl4g，KCl0.1g，Na2HPO41.74g，KH2PO40.1g，加超纯水500mL，连续搅拌15min至完全溶解。
2.1.2RPMI1640培养基
取RPMI Medium1640培养基粉末，另加NaHCO31.70g，添加超纯水1000mL，连续搅拌30min至完全溶解。
2.1.3胰酶溶液的配制
精密称取胰蛋白酶0.25g，添加PBS溶液100mL，混匀。
上述溶液于超净台内，用无菌注射滤器(0.22μm无菌微孔滤膜)过滤除菌，分装成小瓶，4℃保存备用。
2.1.4MTT液的配制
称取MTT粉末，加适量PBS溶液，涡旋溶解，使成浓度为5mg/mL的溶液。
2.2供试液的配置
2.2.1样品溶液的配制
精密称取化合物表藤黄醇酸1.08mg，藤黄酸1.14mg，分别添加适量DMSO，超声至完全溶解。
给药前，用RPMI1640培养基稀释至0.25μmol/L，0.5μmol/L，1μmol/L，2μmol/L，4μmol/L，8μmol/L，16μmol/L等一系列浓度，4℃保存备用。
2.2.2西药阳性药溶液
取DDP(商品名：顺铂)的母液(1mg/mL)，给药前用RPMI1640培养基稀释至2μg/mL。
2.2.3空白对照组溶液的配制
吸取一定体积的DMSO，用RPMI1640培养基稀释至需要的浓度，最高不超过5‰。
3相关成分对正常细胞的毒性实验
3.1肝正常细胞L-02的培养
肝正常细胞L-02常规培养于含15％小牛血清的RPMI1640培养基中。置于37℃、5％CO2培养箱内培养，培养至70％-80％融合时，0.25％胰蛋白酶消化、传代，维持适当的细胞浓度。
3.2MTT法测定细胞增殖抑制率
取对数生长期的肝正常细胞L-02，PBS清洗2-3次，加0.25％胰酶溶液消化，待细胞回缩，变圆，及时倾去胰酶，往细胞瓶中加含15％小牛血清的RPMI1640培养基，吹打瓶壁上的细胞，使细胞分散至培养基中。吸取少量细胞混悬液，于显微镜下计数，调节细胞浓度为5×104/mL。接种于96孔细胞培养板中，每孔100μL。待细胞贴壁后(约24h)后，轻轻吸弃孔内培养基上清液，添加RPMI1640培养基饥饿24h。轻轻吸弃孔内培养基上清液，分别加入用不同浓度的样品溶液200μL：0.25μmol/L，0.5μmol/L，1μmol/L，2μmol/L，4μmol/L，8μmol/L，16μmol/L…每个浓度设6个复孔，并设不含样品的空白对照组和西药阳性药对照组。培养44h后，每孔加入5mg/mL的MTT溶液20μL作用4h后，轻轻吸弃孔内培养上清液，每孔加入DMSO溶液150μL轻轻震荡10min，使结晶物充分溶解，以空白孔凋零。在酶联免疫检测仪490nm波长处测定各孔光密度值(OD值)，求其平均值。以空白对照组对照组细胞存活率记为100％。
3.3实验结果
按下列公式计算：实验组细胞抑制率％＝(1-实验组OD值/对照组OD值)×100％，以药物浓度(μmol/L)和抑制率(％)做线性回归，计算该药对肝正常细胞L-02的半数抑制浓度IC50。
表3化合物对肝正常细胞L-02的IC50计算结果
4相关成分的抗肿瘤药效验证
4.1肝癌细胞SMMC-7721的培养
肝癌细胞SMMC-7721常规培养于含10％小牛血清的RPMI1640培养基中。置于37℃、5％CO2培养箱内培养，培养至70％-80％融合时，0.25％胰蛋白酶消化、传代，维持适当的细胞浓度。
4.2MTT法测定细胞增殖抑制率
取对数生长期的肝癌细胞SMMC-7721，PBS清洗2-3次，加0.25％胰酶溶液消化，待细胞回缩，变圆，及时倾去胰酶，往细胞瓶中加含10％小牛血清的RPMI1640培养基，吹打瓶壁上的细胞，使细胞分散至培养基中。吸取少量细胞混悬液，于显微镜下计数，调节细胞浓度为5×104/mL。接种于96孔细胞培养板中，每孔100μL。待细胞贴壁后(约24h)后，轻轻吸弃孔内培养基上清液，添加RPMI1640培养基饥饿24h。轻轻吸弃孔内培养基上清液，分别加入用不同浓度的样品溶液200μL：0.25μmol/L，0.5μmol/L，1μmol/L，2μmol/L，4μmol/L，8μmol/L…每个浓度设6个复孔，并设不含样品的空白对照组和西药阳性药对照组。培养44h后，每孔加入5mg/mL的MTT溶液20μL作用4h后，轻轻吸弃孔内培养上清液，每孔加入DMSO溶液150μL轻轻震荡10min，使结晶物充分溶解，以空白孔凋零。在酶联免疫检测仪490nm波长处测定各孔光密度值(OD值)，求其平均值。以空白对照组细胞存活率记为100％。
4.3实验结果
按下列公式计算：实验组细胞抑制率％＝(1-实验组OD值/对照组OD值)×100％，以药物浓度(μmol/L)和抑制率(％)做线性回归，计算该药对肝癌细胞SMMC-7721的半数抑制浓度IC50。
表4化合物对肿瘤细胞SMMC-7721的IC50计算结果
5结论
如果单从IC50分析，化合物表藤黄醇酸对肝癌细胞SMMC-7721的抑制效果与藤黄酸相当，而其对肝正常细胞L-02的毒性比藤黄酸要低。
表藤黄醇酸用于制备抗肿瘤药物中的应用时，其口服或非口服给药均是安全有效的。口服给药可以制成任何常规剂型，如：散剂、颗粒、胶囊、片、口崩片、滴丸、软胶囊等；非口服给药，可制成各种常规剂型，如注射液等。
表藤黄醇酸用于制备抗肿瘤药物时，其辅料及制备方法可选用任何药学可接受的形式。
表藤黄醇酸的剂量可根据服用方式、病人的年龄、病情严重程度等因素而改变，成人口服剂量为1-200mg/日，成人注射剂量为1-50mg/日。
附图说明
下面结合实施例对本发明作进一步的说明：
图1表藤黄醇酸的紫外吸收光谱；
图2表藤黄醇酸的质谱图；
图3表藤黄醇酸的1H-NMR谱图
图4表藤黄醇酸的13C-NMR图谱
图5表藤黄醇酸的H-H COSY图谱
图6表藤黄醇酸的HSQC图谱
图7表藤黄醇酸的HMBC图谱
图8表藤黄醇酸的ROESY图谱
图9表藤黄醇酸的结构式
具体实施方式
下述实施例可以更好的说明本发明，其不以任何形式限制本发明所要求的保护范围。
实施例1表藤黄醇酸的制备
(1)取藤黄酸100mg，加入其质量80倍量的水，油浴加热回流24h，减压浓缩蒸干，即得残留物；
(2)制备液相分离：
色谱条件如下：以规格为10μm，19mm×300mm的μBondapark C18柱为色谱柱；以体积比为85∶15的甲醇-1％冰醋酸为流动相，流速为16mL/min，检测波长为360nm，柱温为30℃；
取前步所得残留物，用流动相溶解，滤过，注入制备液相色谱仪，收集出峰时间为14-16min之间的馏分，合并，减压浓缩至干，即得黄色油状化合物8.6mg，经HPLC归一化法检测，纯度为96.7％，其波谱数据与前文记载的内容一致。
实施例2表藤黄醇酸的制备
(1)取藤黄酸100mg，加入其质量120倍量的水，油浴加热回流60h，减压浓缩蒸干，即得残留物；
(2)制备液相分离：
色谱条件如下：以规格为10μm，19mm×300mm的μBondapark C18柱为色谱柱；以体积比为85∶15的甲醇-1％冰醋酸为流动相，流速为16mL/min，检测波长为360nm，柱温为30℃；
取前步所得残留物，用流动相溶解，滤过，注入制备液相色谱仪，收集出峰时间为14-16min之间的馏分，合并，减压浓缩至干，即得黄色油状化合物10.6mg，经HPLC归一化法检测，纯度为96.3％，其波谱数据与前文记载的内容一致。
实施例3表藤黄醇酸的制备
(1)取藤黄酸100mg，加入其质量100倍量的水，油浴加热回流48h，减压浓缩蒸干，即得残留物；
(2)制备液相分离：
色谱条件如下：以规格为10μm，19mm×300mm的μBondapark C18柱为色谱柱；以体积比为85∶15的甲醇-1％冰醋酸为流动相，流速为16mL/min，检测波长为360nm，柱温为30℃；
取前步所得残留物，用流动相溶解，滤过，注入制备液相色谱仪，收集出峰时间为14-16min之间的馏分，合并，减压浓缩至于，即得黄色油状化合物10.2mg，经HPLC归一化法检测，纯度为96.4％。
实施例4表藤黄醇酸片的制备
片剂：表藤黄醇酸20mg，淀粉180g，制粒，压片制成1000片。服用方法：成人一次1片，一日3次。