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三孢布拉霉负菌crgA基因及其克隆和应用.pdf

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文档编号：8767524

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710324829.0 (22)申请日 2017.05.10 (71)申请人江南大学地址 214122 江苏省无锡市滨湖区蠡湖大道1800号 (72)发明人罗玮程妙文巩尊洋余晓斌 (51)Int.Cl. C12N 15/31(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12N 15/10(2006.01) C12N 15/70(2006.01) (54)发明名称三孢布拉霉负菌crgA基因及其克隆和应用 (57)摘要本发明公开了三孢布拉霉( Bla。

2、keslea trispora)负菌crgA基因、基因克隆方法与应用，属于基因工程技术领域。本发明根据三孢布拉霉正菌的crgA基因序列设计四对引物对成功克隆出三孢布拉霉负菌的crgA基因，并将两者的crgA 基因进行了同源比对分析。而后对该基因进行敲除，在表型特征、关键酶基因转录水平、类胡萝卜素合成水平等方面将基因敲除株与野生株进行比较分析，初步显示了该基因在三孢布拉霉中起到负调控因子的作用。本发明通过基因工程技术克隆出三孢布拉霉负菌中的crgA基因，将有助于解析其在三孢布拉霉生产类胡萝卜素过程中的调控机制，有助于提高类胡萝卜素的产量，具有很好。

3、的应用前景。权利要求书1页说明书4页序列表5页附图2页 CN 107099541 A 2017.08.29 CN 107099541 A 1.一种丝状真菌类胡萝卜素合成关键调控因子crgA基因，其特征在于所述的三孢布拉霉调控基因crgA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。 2.根据权利1所述的三孢布拉霉调控基因crgA，其特征在于其来源于负菌，根据三孢布拉霉正菌的crgA基因序列设计引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。 3.一种权利1所述的三孢布拉霉crgA基因的克隆方法，其特征在于包括如下步骤： (1)以三孢布拉霉负菌基因组DNA为模板，进行PC。

4、R扩增，使用的上下游引物分别为： F1(up)： GGAAATTAAGCTATGCACCGCAGTATAGTC F1(down)： AGGAAGGTTTGAACAGAAAACTCTTGTAGC F2(up)： GGTAATGTATGTCGGTGTTGGTT F2(down)： ACTCGGTTGAAGTGCGATTGTAT F3(up)： AGTTAAAGCAATTCAAGCTTCGATTCTA F3(down)： CTTTAAGAAATGCAACAAGTAGCAGGTG F4(up)： ACAGACGACTGAAGAGATGATTGATGAACT F4(down)： TATTTTCATAT。

5、GGAACAAGATTTGTCTATA (2)将得到的PCR产物进行回收和纯化； (3)将所得PCR产物通过质粒的构建转化到大肠杆菌进行扩增，再进行抽提测序； (4)将测序结果输入至DNAMAN与三孢布拉霉正菌crgA基因序列进行比对。 4.权利要求1所述的三孢布拉霉crgA基因在调控类胡萝卜素合成以及提高丝状真菌菌丝体内类胡萝卜素产量方面的应用。 5.根据权利要求3所述的三孢布拉霉负菌crgA基因的克隆方法，其特征在于所述PCR的反应体系总体积为50ul，其中Ex Taq酶0.25uL， Ex Taq Buffer 5uL， dNTP Mix 4uL，从负菌中提取的模板小于。

6、1ug，上/下游引物(10uM)各1uL， ddH2O up to 50ul。 6.根据权利要求3所述的三孢布拉霉负菌的crgA基因的克隆方法，其特征在于所述PCR 的反应条件为： 94预变性5min； 30个循环： 94变性30s,55退火30s,72延伸1min； 72 后延伸10min。 7.一种含有权利要求1所述的三孢布拉霉负菌的crgA基因的表达载体。 8.一种三孢布拉霉负菌的crgA基因的应用，其特征在于， crgA基因是丝状真菌光诱导类胡萝卜素生物合成过程中的一个关键负调控因子，通过催化类胡萝卜素合成过程其他蛋白泛素化来调控类胡萝卜素的合成。 crgA基因的成功。

7、克隆及基因序列的确定为提高其他丝状真菌中类胡萝卜素生物合成水平奠定技术基础。权利要求书 1/1 页 2 CN 107099541 A 2 三孢布拉霉负菌crgA基因及其克隆和应用技术领域 0001 本发明属于基因工程技术领域，主要是涉及一种三孢布拉霉负菌调控因子crgA基因、克隆方法与应用。背景技术 0002 三孢布拉霉属于接合菌门接合菌纲毛霉目笄霉科，是一种异宗接合菌，有正菌和负菌之分，其中负菌是合成类胡萝卜素的主要宿主。三孢布拉霉生物量大，类胡萝卜素产量高，被认为是工业化生产天然 -胡萝卜素和番茄红素的理想微生物。而目前三孢布拉霉的遗传背景尚未弄清。

8、，成为进一步提高类胡萝卜素产量的瓶颈。本发明从三孢布拉霉类胡萝卜素合成的关键调控基因入手，为提高类胡萝卜素产量奠定技术基础。 0003 crgA基因是在卷枝毛霉中发现的一个负调控因子1，该基因缺失突变后能够引起类胡萝卜素合成关键酶基因(carRA和carB)表达水平和类胡萝卜素合成量的提高。在卷枝毛霉中， crgA基因与一光受体蛋白基因相互作用影响类胡萝卜素的表达， crgA基因的存在可能会促进某一光受体蛋白的泛素化，从而使得类胡萝卜素结构基因表达得到活化2。有研究者在三孢布拉霉正菌中发现了crgA的同源基因3，并将该基因导入卷枝毛霉crgA突变株中能。

9、恢复其野生型表型，证实了该基因序列在丝状真菌中具有较高的保守性。如通过基因工程技术克隆出三孢布拉霉负菌中的crgA基因，将有助于利用三孢布拉霉负菌生产类胡萝卜素，具有很好的应用前景。 0004 本发明除利用基因工程技术成功克隆出三孢布拉霉负菌的crgA基因外，还将对该基因进行敲除，在表型特征、关键酶基因转录水平、类胡萝卜素合成水平等方面将基因敲除株与野生株进行比较分析。发明内容 0005 本发明的第一目的在于提供一种三孢布拉霉负菌的crgA基因；第二目的在于提供一种所述三孢布拉霉负菌的crgA基因的克隆方法；第三目的在于构建一种crgA基因原核表达体系；。

10、第四目的在于对三孢布拉霉负菌crgA基因的分析；第五目的在于初步探索crgA基因调控三孢布拉霉合成类胡萝卜素的作用机制；第六目的在于为研究三孢布拉霉产类胡萝卜素的调控作用以及三孢布拉霉的光诱导机制奠定了重要基础。 0006 本发明第一目的是这样实现的,所述三孢布拉霉负菌的crgA基因的碱基序列如 SEQ ID NO.1所示。 0007 本发明第二的是这样实现的,所述三孢布拉霉负菌的crgA基因的克隆方法包括如下步骤： (1)从NCBI寻找三孢布拉霉正菌crgA基因序列，分四段进行克隆并分别设计引物： F1(up)： GGAAATTAAGCTATGCACCGCAGTATAGTC 。

11、F1(down)： AGGAAGGTTTGAACAGAAAACTCTTGTAGC F2(up)： GGTAATGTATGTCGGTGTTGGTT 说明书 1/4 页 3 CN 107099541 A 3 F2(down)： ACTCGGTTGAAGTGCGATTGTAT F3(up)： AGTTAAAGCAATTCAAGCTTCGATTCTA F3(down)： CTTTAAGAAATGCAACAAGTAGCAGGTG F4(up)： ACAGACGACTGAAGAGATGATTGATGAACT F4(down)： TATTTTCATATGGAACAAGATTTGTCTATA (2)三孢布拉霉。

12、负菌的基因组DNA为模板，使用上述引物进行PCR扩增。 (3)对所得的PCR产物进行回收和纯化； (4)将所得PCR产物通过质粒的构建转化到大肠杆菌进行扩增，再进行抽提测序。 0008 本发明中从NCBI中寻找的三孢布拉霉正菌的crgA基因的碱基序列如SEQ ID NO.2 所示。 0009 本发明第三目的是这样实现的,所述三孢布拉霉负菌的crgA基因的原核表达体系包括crgA基因， PMD-18T载体和大肠杆菌DH5。 0010 本发明第四目的是这样实现的,将负菌crgA基因测序结果输入DNAMAN与三孢布拉霉正菌crgA基因序列进行比对。 0011 本发明第五目的是这样实现的,将三。

13、孢布拉霉负菌crgA基因敲除，再测定菌内的类胡萝卜素结构基因的表达和类胡萝卜素的含量。 0012 本发明提供的三孢布拉霉负菌的crgA基因具有重要的应用价值，而三孢布拉霉负菌是 -胡萝卜素和番茄红素的主要生产菌，因此在负菌中进行该基因的确定以及调控类胡萝卜素合成的研究具有重要的理论意义和潜在的经济价值。附图说明 0013 图1为验证crgA基因片段扩增电泳图，片段大小分别为： 974bp、 1243bp、 1428bp、 1019bp，图中M为DL2000DNA marker(大连宝生物)。 0014 图2为将测序所得的三孢布拉霉负菌crgA基因与正菌crgA基因进行。

14、同源比对分析结果。 0015 图3为crgA基因对三孢布拉霉产孢能力的影响。 0016 图4为crgA对 -胡萝卜素合成关键酶基因表达以及类胡萝卜素产量的影响。具体实施方式 0017 下面进一步详细说明本发明，应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而不以任何形式限制本发明的范围。 0018 实施例1三孢布拉霉基因组DNA的提取。 0019 取培养好的三孢布拉霉负菌种子液，离心去上清后反复洗涤两次获得菌丝体，然后加入适量液氮研磨至白色粉末状，取少量提取DNA，操作参照真菌DNA抽提试剂盒说明书进行。 0020 实施例2三孢布拉霉负菌crgA基因的分离克隆。 002。

15、1 根据三孢布拉霉正菌crgA基因序列，分四段进行克隆并分别设计引物： F1(up)： GGAAATTAAGCTATGCACCGCAGTATAGTC F1(down)： AGGAAGGTTTGAACAGAAAACTCTTGTAGC 说明书 2/4 页 4 CN 107099541 A 4 F2(up)： GGTAATGTATGTCGGTGTTGGTT F2(down)： ACTCGGTTGAAGTGCGATTGTAT F3(up)： AGTTAAAGCAATTCAAGCTTCGATTCTA F3(down)： CTTTAAGAAATGCAACAAGTAGCAGGTG F4(up)： ACAG。

16、ACGACTGAAGAGATGATTGATGAACT F4(down)： TATTTTCATATGGAACAAGATTTGTCTATA 0022 PCR反应体系为50ul，包括： Ex Taq酶0.25uL， Ex Taq Buffer 5uL， dNTP Mix 4uL，从负菌中提取的模板小于1ug，上/下游引物(10uM)各1uL， ddH2O up to 50ul； PCR反应在扩增仪上进行，反应程序为：扩增条件： 94预变性5min； 30个循环： 94变性30s,55退火 30s,72延伸1min； 72后延伸10min。扩增反应完成后,进行电泳鉴定、回收和加A反应，。

17、结果如图1所示。 0023 实施例3以PMD-18T质粒和大肠杆菌DH5为例说明原核表达体系的构建过程。 0024 产物进行核酸电泳鉴定并割胶回收纯化,纯化回收后连接至pMD-18T载体构建重组克隆质粒,然后转化至大肠杆菌DH5 中扩增，挑取阳性转化子LB液体培养基(AMPr)37, 220rpm培养10-12h,提取质粒后对质粒进行双酶切、验证,验证正确的进行序列测定。 0025 实施例4为三孢布拉霉crgA基因的序列分析。 0026 将三孢布拉霉负菌crgA基因测序结果输入至NCBI与三孢布拉霉正菌crgA基因序列进行比对。其比对结果如图2所示，由图可以确定三孢布拉霉负菌中。

18、同样含有crgA基因。 0027 实施例5为三孢布拉霉crgA基因对其产孢能力影响分析。 0028 根据上述得到的三孢布拉霉负菌crgA基因利用Split-marker法4对菌株进行 crgA基因的敲除以及构建crgA基因回补菌株。首先制备三孢布拉霉的原生质体悬浮液，再加入split-marker敲除载体片段混合，涂布于麦汁培养基，待长出孢子后进行PCR验证。 crgA基因的回补也采用Split-marker法，基因片段同时转化三孢布拉霉原生质体后涂布麦汁培养基，待长出孢子并传代4-5次，测序验证阳性即为crgA基因回补菌株C-crgA菌。三种菌株产孢子现象如图3所示。。

19、0029 实施例6为分析crgA基因对三孢布拉霉类胡萝卜素结构基因的表达和产类胡萝卜素的影响。 0030 将培养不同时间的三孢布拉霉发酵液10000r/min离心3min收集菌丝体，取适量置于预冷的研钵中，加入液氮将菌丝体研磨至粉末状，之后按照总RNA提取试剂盒说明书进行提取。反转录按照AMV第一链cDNA合成试剂盒说明书进行，产物(cDNA)置于-20保存或直接用于下一步实验。将cDNA稀释至50ng/ L，按照说明书配制20 L反应体系： cDNA 2 L， Premix Ex-Taq10 L，引物(10 mol/L)0.8 L， ddH2O 6.4 L。反应。

20、程序：预变性95 ， 30s；变性95， 5s；退火55， 20s； 40个循环。 tef1为真核生物的转录因子，其表达不受菌的状态和所处环境的影响，所以在该荧光定量PCR中，选用tef1为内参基因5。采用2- Ct 法分析实验结果，计算基因表达差异倍数，所用引物见下表。结果如图4所示。 0031 取培养不同时间的三孢布拉霉发酵液10000r/min离心5min，将获得的菌丝体置于真空干燥箱40干燥24h，取适量加入石油醚多次研磨至菌丝无色，收集提取液按20:1(石油醚： BHT， v/m)的比例加入BHT，然后置于-70或直接用于下一步实验。将提取液置于旋。

21、转蒸发仪， 50蒸干并加入5mL乙腈重新溶解，取少量用0.22 m有机系滤膜过滤， HPLC法测定说明书 3/4 页 5 CN 107099541 A 5 色素含量。其中，色谱柱为安捷伦TC-C18，流动相为80乙腈、 20甲醇，检测波长450nm，流速0.1mL/min，进样量10 L，柱温为28。分析crgA基因对三孢布拉霉产类胡萝卜素的影响如图4所示。 0032 参考文献： 1Navarro E,Ruiz-Prez VL,Torres-Martnez S.Overexpression of the crgA gene abolishes light requi。

22、rement for carotenoid biosynthesis in Mucor circinelloides.European Journal of Biochemistry 2000,267:800-807。 2Navarro E,A,Hansberg W,Torres-Martnez S,Garre V.A White Collar 1-like protein mediates opposite regulatory functions in Mucor circinelloides.Fungal Genetics and Biology 2013,52:42-52。 3Quil。

23、es-Rosillo MD,Ruiz-Vazquez RM,Torres-Martinez S,Garre V.Light induction of the carotenoid biosynthesis pathway in Blakeslea trispora.Fungal Genetics and Biology 2005,42:141-153。 4罗玮,巩尊洋,余晓斌.一种基因敲除载体及其构建方法和在三孢布拉霉中的应用. 专利号20161026195.7。 5Schmidt AD,Thorsten H,Markus M,Liebmann B,Bollschweiler C,Brakha。

24、ge AA.Analysis of mating-dependent transcription of Blakeslea trispora carotenoid biosynthesis genes carB and carRA by quantitative real-time PCR.Administration,2005,67(4):549-555。说明书 4/4 页 6 CN 107099541 A 6 SEQUENCE LISTING SEQ ID NO.1 SEQ: 4293 bp; Composition 1262 A; 935 C; 805 G; 1288 T; 3 OTH。

25、ER Percentage: 29.4% A; 21.8% C; 18.8% G; 30.0% T; 0.1%OTHER Molecular Weight (kDa): ssDNA: 1322.54 dsDNA: 2646.23 COLOURS sequence = 1 features = 0 ORIGIN 1 GGAAATTAAG CTATGCACCG CAGTATAGTC AAGATTATAC AGAAAAGAGG ATCTGCAGAG 61 AAAGCCAAGT TGCCGGAAGA CCTAAGAAGG CTTCTGAGCG AGTACATTCG TTCATTGTTG 121 CTA。

26、TATGTAG CACAGAACCT TTTTGATAGC TTTGCCAAAA TTCAGACACA AGCCAAGGCC 181 TTTGGGTTTG ATACGTCCAA AGACACAATC ATCGGCTATC TAGCCCAGAA TGGCTTCCCA 241 TTCGATCTGG ACAGCTCATA GACCAAAGCT GACGGATAGA CCCAAGGCAA AACGACTGGA 301 TTGGGCACTT ACCCACACAA ACTGGACCAG TTACCAGTAG GAGGGTGTCA TCTGGTCGGA 361 TGAGTCTCGT TTCCGAGTGG A。

27、GAAACAACG ACTGTGACCT CCCCGGGTAA TCTGTAAGAA 421 GGGGGGACAC GCTAGAGGAG AGGAATATCC TCGAAACTAT CAAGTACGGT CATGTTATGG 481 GCATGTTTTT GGGCTAGCAG TTTTGGTCCC TTGGTGGCAG TTGGAGAGAA GATTGGCTGC 541 CGAAAAACAT ATCGTCCAAA ATGTGAAGGA ATTGGCAGCC CCTCATCCAT CAAGAATAGG 601 ACACTTTAGT CGAAAGTATG CCAAATAGAT GTGCAGCTGT。

28、 CATAAAGGCC AAAGGCGGGC 661 GGGCATACAA GATACTAAAA AACCAATTTT CTTATTTTAT TTTAATAAAG AAGACACTTT 721 TTTTGATCTG TTTTGCATCA TGGACGTGTT TTGGCCATGC TTTCAAACTT TTGTTTTCAG 781 TTTGGATTTA ATTTAATTTC ACCGAAAGAC GCTTTGATAG GTAATGTATG TCGGTGTTGG 841 TTTTTGAATC GTGATAGGTG TAACTCGGAC ACTTCTCTTT TCTGATCGTG AAACTGTT。

29、GT 901 AAAGCCCAAG ACTATGAAAA TCAATTCCAA ACCAACTTTG TTTGGCTACA AGAGTTTTCT 961 GTTCAAACCT TCCTGATATA AAAGCGCTCT AAAAGTCCTT TCTGATCTCC CAAAAAAAAA 1021AGCCTACGTT TTGAGTAGCT CGATCCACTA ATAAAGAGCA AGAGAAGAGA CTCCTAAAAT 1081GACTGATTTA TCGCCAGGCT CAAATTTATA CACTTTTGGT AATTATCGAT CATGAAGAAA 1141GAGGATTTCC CT。

30、CAGAAGGG CGGGGTTGAT TTGTCGATCA CAAGATAAAT GATTAAGAAA 1201GAATGATAGC ATGACTACAA GGAAACCATT TTGACAATGA CGCAAAATTA ATTAAGCTTT 1261CTGATTCTCT CTCAAAAAAA AAAGGGGCTT TTTTAACGCT TGATCGATTC TTTTTTTTTT 1321TGGCCTTTTT TGTAAGATAA AGTTTTTTTT CTTTTGGGTT TTAAAATCAA AAAAACCAAA 1381AAGAACCCGG GTTTGTTATT TCAAAAATAT 。

31、TAAATGCTAA AAATGGAGAA AATTGCTGAA 1441AAAGAAATTC AAGGTAAAAA TAAAAACCGA CGAAATTTTC AATTTTTTTT GGGCATAAAA 1501TAAATAAAAA TGAAGTCTTT TTTTTTTCCC TTTTTTTTAA ATAATTCCAT TTCCTTTTTT 1561TTTTCCCCTA ATTTTTTTTC CCTAAGGGGA ATTTTTTACC TTTTTTGGAA ATTTCCTTTT 1621TTTTTTTTTT TAAACCCAGG CCTTTTATTG ACTTTATTTT TTTTTTTTT。

32、T TTTTAGTTAA 序列表 1/5 页 7 CN 107099541 A 7 1681AGCAATTCAA GGTTTGATTT TTTTGTTTCA ATTCCTTTTT TTCAAGGAAA AAAAATTTTT 1741GCTTCAATTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT CTTTTGAGAA TTATCAACAG TGCAAAGCAT 1801ACAACAACAT AAACGATCCC GCGACCAGGT CGACACTTTA TCTGTAGGAC AATTCAATTA 1861GAAGCAAAAG CAGATCGATG TATTTTCACC CTCTGTAGTT 。

33、GTAGAAGCAT TCACTCGATG 1921TCCTTCTTGT CATGGCAAAT TGAATAAACC AACCACTTTG CCTTGTGGCT TTACAGCTTG 1981TCATZXCVGC ACTGCGTGGC ATTCGATCAC AGACAGATGT ACATCACTTA TCTTATCGAT 2041CCCCGGCTTA AAATCCCCTT TCACCCGAGG GTCCTTTTTC GGGCTTTGCA AGCCATTGTA 2101GTCGGGGCAA AAGCTTCTCA AACCCTCAAC ATTTTACTTC CCACACTCAA TTCACCCCC。

34、C 2161AAAGGTCCCA TCTGTTGTTC CCGCTTCAAA AATCCAACAA CTACTCCTTG GGGACCCACC 2221TTTTGCAAAA ACGGCCGAAT TCCCTCACTT GACCATCAAC CCCCTGGCCC CTTTTGTCGC 2281GACATTCCCA ATTTGGGCCC CCCCCCACCC AAAATCTTGG GGGACATTCT CTCCCACTGG 2341AATGCTATGG ATGCAAAACC GGATAAAAAT GCATGGGCCA GGCTTGATCA AGAGGGCCGG 2401GTTCCCTGGT GAA。

35、TGGGCAA CCGGGCCTTC CCTCTGGACA AATGTGCCTT TCATGGTGTT 2461TGAACCCGCG CTATCGCCTA ATGGTTCGTC GTATCAGGCA GCCCAACCCG CCGTCAATTT 2521GCCTGGTGTA TTGCTCGCCG AAAACAAACC AAAGGGCAAC TCTCCACTTA ACAAAATATG 2581GCCCTAATGC TTGTATTTGA CCCATGCTCC AACCTTTGGC GTGATGGCTC GTTCCTTTGG 2641GAAGAAGCCT ATTGGCTCCG ACAGCCCCTT C。

36、CAGGTCCTC GACATATGTA AATTGCACAG 2701ATGGTTCATC ATATGGCTTC CCATTGGAAA GAATTGATGA TATTGATTGG TGAGCAGAAA 2761ACTTCGCCTT GACGACCACG TACTCTGAAA GCCAGTGCCT CTTCGTGCAC GTCTACACAG 2821AGACCTTGCA TGTCCATATC ACTTGACCTG CACTGCCTTG TCGTTCGACA ATGGATCCAC 2881GTATCACGAT CTCCAATGAT TCTACCCGCT AGTATGATGG CCAGACCCGC。

37、 TAGTATGATC 2941GCTAGACCCG CCAGCATGAT GGCCAGACCC GCCAGTATGA TCGCTAGACC CGCCAGTATG 3001GCATCCAGAT CTAACCCAGC CGTTCGCGCA CCCATGGGTC GCCCAATGCC CCATCAAGTT 3061AGACCTCAAG CTACAAATGC TAGCATGGAA CCCAACAATG CTCGTCAATC CTGGGCTCAA 3121CGTGCTCATC CTCAGACACA AGCACCTGTT AGTCGAGCTC CTTGGCTTCA AATGCATGTT 3181CAAG。

38、GTCTAT CTGCTCAACG ATCTAAGCCT CAATTACAAC AACAACAACA ACAGCAGCAG 3241CAACAACAGC AATCTCACAA CATCCCTATT GTACCCGAAA AAACAGTCAA GAATCGTCAA 3301GAACAGACGA CTGAAGAGAT GATTGATGAA CTAACAGCTT TTGTTGAAAA ATTATTATGT 3361CATAAGAATG CTAATCCTAA TGACAGCATG TCTACTTGGC TAAGTGCCTT GGGTGATCCT 3421CCTACATTAC GTGGTCCTCA AC。

39、GCGATCGA GTCATCTTGA CTTGGTGGGT CATTAACATG 3481ATGCCCTTGA GTGAAGATGA AAAGGTTTCT CTGATAGCCA TGCGTACTCT CCGTGAACGC 3541GTCTTGGTGA TCATTTCCCG TATTGATCGA TTCGAGAGTC AATGGTCTGT CTTTTTAAAC 3601AACTCATCGT CTACTCACTC TTCCTCTAAT CAAACACCTG CTACTTGTTG CATTTCTTAA 3661AGCCCATTCC TTTTACTTAA TTTATTATGC CCTCACTCTC 。

40、ACTCTCTCTC TCTTTCTTTC 3721TTTGTAATCA TATCATTGTC TATAACTATC TATGCCATAA AAAAAAACAC CTTAATTTAT 3781TTCTAAAAAC GCAATCCTTA ATGAATAATA AAATATTACT AATCTATTGT GTAATTCAGT 3841TTAACATTGG TTTATCCATC TTTTGTCCAA TAAAAATAAA TCATGTAGTA AATAACCCAT 3901TTTACCTAGT GCTCTTGGAA GAGGAGTAGG GCAGTATCAC TCCTCAATTG CTGCAATAT。

41、T 3961TTTGATAAGA ACATATGTCT TGGGAAATGT AAAGCCAAAG GAGGGGAAGA AACCATAAGA 序列表 2/5 页 8 CN 107099541 A 8 4021GAGAAAGCTA ATACGAATAA AGATCTTGTA ATTCCACTAT TAAAAGGAGA TTGTTTCTTT 4081TTCTTTTTAT CTACATTTTG TCTTTTTATT TCCGAAAATG ACATGTTGAT TATTTATGTA 4141AAAAGGGTAA AGAGGGAAGA AAAAAAAAAG AGGGGGAAGG GAGGAGAAAG 。

42、GAGGGGATGA 4201AAGGGTGCTT ATGCTTCAAG AGAAACATAC CAAGATCGAA CAATTGCTCA AACAATTCTC 4261CAGTATAGAC AAATCTTGTT CCATATGAAA ATA SEQ ID NO.2 SEQ DNAMAN1: 4261 bp; Composition 1269 A; 891 C; 788 G; 1313 T; 0 OTHER Percentage: 29.8% A; 20.9% C; 18.5% G; 30.8% T; 0.0%OTHER Molecular Weight (kDa): ssDNA: 1313.。

43、10 dsDNA: 2626.45 COLOURS sequence = 1 features = 0 ORIGIN 1 GGAAATTAAG CTATGCACCG CAGTATAGTC AAGATTATAC AGAAAAGAGG ATCTGCAGAG 61 AAAGCCAAGT TGCCGGAAGA CCTAAGAAGG CTTCTGAGCG AGTACATTCG TTCATTGTTG 121 CTATATGTAG CACAGAACCT TTTTGATAGC TTTGCCAAAA TTCAGACACA AGCCAAGGCC 181 TTTGGGTTTG ATACGTCCAA AGACACAA。

44、TC ATCGGCTATC TAGCCCAGAA TGGCTTCCCA 241 TTCGATCTGG ACAGCTCATA GACCAAAGCT GACGGATAGA CCCAAGGCAA AACGACTGGA 301 TTGGGCACTT ACCCACACAA ACTGGACCAG TTACCAGTAG GAGGGTGTCA TCTGGTCGGA 361 TGAGTCTCGT TTCCGAGTGG AGAAACAACG ACTGTGACCT CCCCGGGTAA TCTGTAAGAA 421 GGGGGGACAC GCTAGAGGAG AGGAATATCC TCGAAACTAT CAAGTA。

45、CGGT CATGTTATGG 481 GCATGTTTTT GGGCTAGCAG TTTTGGTCCC TTGGTGGCAG TTGGAGAGAA GATTGGCTGC 541 CGAAAAACAT ATCGTCCAAA ATGTGAAGGA ATTGGCAGCC CCTCATCCAT CAAGAATAGG 601 ACACTTTAGT CGAAAGTATG CCAAATAGAT GTGCAGCTGT CATAAAGGCC AAAGGCGGGC 661 GGGCATACAA GATACTAAAA AACCAATTTT CTTATTTTAT TTTAATAAAG AAGACACTTT 721 。

46、TTTTGATCTG TTTTGCATCA TGGACGTGTT TTGGCCATGC TTTCAAACTT TTGTTTTCAG 781 TTTGGATTTA ATTTAATTTC ACCGAAAGAC GCTTTGATAG GTAATGTATG TCGGTGTTGG 841 TTTTTGAATC GTGATAGGTG TAACTCGGAC ACTTCTCTTT TCTGATCGTG AAACTGTTGT 901 AAAGCCCAAG ACTATGAAAA TCAATTCCAA ACCAACTTTG TTTGGCTACA AGAGTTTTCT 961 GTTCAAACCT TCCTGATAT。

47、A AAAGCGCTCT AAAAGTCCTT TCTGATCTCC CAAAAAAAAA 1021AGCCTACGTT TTGAGTAGCT CGATCCACTA ATAAAGAGCA AGAGAAGAGA CTCCTAAAAT 1081GACTGATTTA TCGCCAGGCT CAAATTTATA CACTTTTGGT AATTATCGAT CATGAAGAAA 1141GAGGATTTCC CTCAGAAGGG CGGGGTTGAT TTGTCGATCA CAAGATAAAT GATTAAGAAA 1201GAATGATAGC ATGACTACAA GGAAACCATT TTGACAATGA CGCAAAATTA ATTAAGCTTT 1261CTGATTCTCT CTCAAAAAAA AAAGGGGCTT TTTTAACGCT TGATCGATTC TTTTTTTTTT 1321TGGCCTTTTT TGTAATGATA GAGTTTTTTT TCCTTATTGG CTTTAAGATC AGAAAGATCA 1381AAAAGCAACC ATGTTTGTTA TTTCAAAAAT AGTAAATGCT AAAAAT。

摘要
申请专利号：	CN201710324829.0	申请日：	20170510
公开号：	CN107099541A	公开日：	20170829
当前法律状态：		有效性：	审查中
法律详情：
IPC分类号：	C12N15/31,C12N15/11,C12N15/10,C12N15/70	主分类号：	C12N15/31,C12N15/11,C12N15/10,C12N15/70
申请人：	江南大学
发明人：	罗玮,程妙文,巩尊洋,余晓斌
地址：	214122 江苏省无锡市滨湖区蠡湖大道1800号
优先权：	CN201710324829A
专利代理机构：		代理人：
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内容摘要

本发明公开了三孢布拉霉(Blakeslea trispora)负菌crgA基因、基因克隆方法与应用，属于基因工程技术领域。本发明根据三孢布拉霉正菌的crgA基因序列设计四对引物对成功克隆出三孢布拉霉负菌的crgA基因，并将两者的crgA基因进行了同源比对分析。而后对该基因进行敲除，在表型特征、关键酶基因转录水平、类胡萝卜素合成水平等方面将基因敲除株与野生株进行比较分析，初步显示了该基因在三孢布拉霉中起到负调控因子的作用。本发明通过基因工程技术克隆出三孢布拉霉负菌中的crgA基因，将有助于解析其在三孢布拉霉生产类胡萝卜素过程中的调控机制，有助于提高类胡萝卜素的产量，具有很好的应用前景。

权利要求书

1.一种丝状真菌类胡萝卜素合成关键调控因子crgA基因，其特征在于所述的三孢布拉霉调控基因crgA的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。 2.根据权利1所述的三孢布拉霉调控基因crgA，其特征在于其来源于负菌，根据三孢布拉霉正菌的crgA基因序列设计引物，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。 3.一种权利1所述的三孢布拉霉crgA基因的克隆方法，其特征在于包括如下步骤：(1)以三孢布拉霉负菌基因组DNA为模板，进行PCR扩增，使用的上下游引物分别为：F1(up)：GGAAATTAAGCTATGCACCGCAGTATAGTCF1(down)：AGGAAGGTTTGAACAGAAAACTCTTGTAGCF2(up)：GGTAATGTATGTCGGTGTTGGTTF2(down)：ACTCGGTTGAAGTGCGATTGTATF3(up)：AGTTAAAGCAATTCAAGCTTCGATTCTAF3(down)：CTTTAAGAAATGCAACAAGTAGCAGGTGF4(up)：ACAGACGACTGAAGAGATGATTGATGAACTF4(down)：TATTTTCATATGGAACAAGATTTGTCTATA(2)将得到的PCR产物进行回收和纯化；(3)将所得PCR产物通过质粒的构建转化到大肠杆菌进行扩增，再进行抽提测序；(4)将测序结果输入至DNAMAN与三孢布拉霉正菌crgA基因序列进行比对。 4.权利要求1所述的三孢布拉霉crgA基因在调控类胡萝卜素合成以及提高丝状真菌菌丝体内类胡萝卜素产量方面的应用。 5.根据权利要求3所述的三孢布拉霉负菌crgA基因的克隆方法，其特征在于所述PCR的反应体系总体积为50ul，其中ExTaq酶0.25uL，ExTaqBuffer5uL，dNTPMix4uL，从负菌中提取的模板小于1ug，上/下游引物(10uM)各1uL，ddHOupto50ul。 6.根据权利要求3所述的三孢布拉霉负菌的crgA基因的克隆方法，其特征在于所述PCR的反应条件为：94℃预变性5min；30个循环：94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸1min；72℃后延伸10min。 7.一种含有权利要求1所述的三孢布拉霉负菌的crgA基因的表达载体。 8.一种三孢布拉霉负菌的crgA基因的应用，其特征在于，crgA基因是丝状真菌光诱导类胡萝卜素生物合成过程中的一个关键负调控因子，通过催化类胡萝卜素合成过程其他蛋白泛素化来调控类胡萝卜素的合成。crgA基因的成功克隆及基因序列的确定为提高其他丝状真菌中类胡萝卜素生物合成水平奠定技术基础。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，主要是涉及一种三孢布拉霉负菌调控因子crgA基因、克隆方法与应用。

背景技术

三孢布拉霉属于接合菌门接合菌纲毛霉目笄霉科，是一种异宗接合菌，有正菌和负菌之分，其中负菌是合成类胡萝卜素的主要宿主。三孢布拉霉生物量大，类胡萝卜素产量高，被认为是工业化生产天然β-胡萝卜素和番茄红素的理想微生物。而目前三孢布拉霉的遗传背景尚未弄清，成为进一步提高类胡萝卜素产量的瓶颈。本发明从三孢布拉霉类胡萝卜素合成的关键调控基因入手，为提高类胡萝卜素产量奠定技术基础。

crgA基因是在卷枝毛霉中发现的一个负调控因子[1]，该基因缺失突变后能够引起类胡萝卜素合成关键酶基因(carRA和carB)表达水平和类胡萝卜素合成量的提高。在卷枝毛霉中，crgA基因与一光受体蛋白基因相互作用影响类胡萝卜素的表达，crgA基因的存在可能会促进某一光受体蛋白的泛素化，从而使得类胡萝卜素结构基因表达得到活化[2]。有研究者在三孢布拉霉正菌中发现了crgA的同源基因[3]，并将该基因导入卷枝毛霉ΔcrgA突变株中能恢复其野生型表型，证实了该基因序列在丝状真菌中具有较高的保守性。如通过基因工程技术克隆出三孢布拉霉负菌中的crgA基因，将有助于利用三孢布拉霉负菌生产类胡萝卜素，具有很好的应用前景。

本发明除利用基因工程技术成功克隆出三孢布拉霉负菌的crgA基因外，还将对该基因进行敲除，在表型特征、关键酶基因转录水平、类胡萝卜素合成水平等方面将基因敲除株与野生株进行比较分析。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种三孢布拉霉负菌的crgA基因；第二目的在于提供一种所述三孢布拉霉负菌的crgA基因的克隆方法；第三目的在于构建一种crgA基因原核表达体系；第四目的在于对三孢布拉霉负菌crgA基因的分析；第五目的在于初步探索crgA基因调控三孢布拉霉合成类胡萝卜素的作用机制；第六目的在于为研究三孢布拉霉产类胡萝卜素的调控作用以及三孢布拉霉的光诱导机制奠定了重要基础。

本发明第一目的是这样实现的,所述三孢布拉霉负菌的crgA基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明第二的是这样实现的,所述三孢布拉霉负菌的crgA基因的克隆方法包括如下步骤：

(1)从NCBI寻找三孢布拉霉正菌crgA基因序列，分四段进行克隆并分别设计引物：

F1(up)：GGAAATTAAGCTATGCACCGCAGTATAGTC

F1(down)：AGGAAGGTTTGAACAGAAAACTCTTGTAGC

F2(up)：GGTAATGTATGTCGGTGTTGGTT

F2(down)：ACTCGGTTGAAGTGCGATTGTAT

F3(up)：AGTTAAAGCAATTCAAGCTTCGATTCTA

F3(down)：CTTTAAGAAATGCAACAAGTAGCAGGTG

F4(up)：ACAGACGACTGAAGAGATGATTGATGAACT

F4(down)：TATTTTCATATGGAACAAGATTTGTCTATA

(2)三孢布拉霉负菌的基因组DNA为模板，使用上述引物进行PCR扩增。

(3)对所得的PCR产物进行回收和纯化；

(4)将所得PCR产物通过质粒的构建转化到大肠杆菌进行扩增，再进行抽提测序。

本发明中从NCBI中寻找的三孢布拉霉正菌的crgA基因的碱基序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明第三目的是这样实现的,所述三孢布拉霉负菌的crgA基因的原核表达体系包括crgA基因，PMD-18T载体和大肠杆菌DH5ɑ。

本发明第四目的是这样实现的,将负菌crgA基因测序结果输入DNAMAN与三孢布拉霉正菌crgA基因序列进行比对。

本发明第五目的是这样实现的,将三孢布拉霉负菌crgA基因敲除，再测定菌内的类胡萝卜素结构基因的表达和类胡萝卜素的含量。

本发明提供的三孢布拉霉负菌的crgA基因具有重要的应用价值，而三孢布拉霉负菌是β-胡萝卜素和番茄红素的主要生产菌，因此在负菌中进行该基因的确定以及调控类胡萝卜素合成的研究具有重要的理论意义和潜在的经济价值。

附图说明

图1为验证crgA基因片段扩增电泳图，片段大小分别为：974bp、1243bp、1428bp、1019bp，图中M为DL2000DNA marker(大连宝生物)。

图2为将测序所得的三孢布拉霉负菌crgA基因与正菌crgA基因进行同源比对分析结果。

图3为crgA基因对三孢布拉霉产孢能力的影响。

图4为crgA对β-胡萝卜素合成关键酶基因表达以及类胡萝卜素产量的影响。

具体实施方式

下面进一步详细说明本发明，应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而不以任何形式限制本发明的范围。

实施例1三孢布拉霉基因组DNA的提取。

取培养好的三孢布拉霉负菌种子液，离心去上清后反复洗涤两次获得菌丝体，然后加入适量液氮研磨至白色粉末状，取少量提取DNA，操作参照真菌DNA抽提试剂盒说明书进行。

实施例2三孢布拉霉负菌crgA基因的分离克隆。

根据三孢布拉霉正菌crgA基因序列，分四段进行克隆并分别设计引物：

F1(up)：GGAAATTAAGCTATGCACCGCAGTATAGTC

F1(down)：AGGAAGGTTTGAACAGAAAACTCTTGTAGC

F2(up)：GGTAATGTATGTCGGTGTTGGTT

F2(down)：ACTCGGTTGAAGTGCGATTGTAT

F3(up)：AGTTAAAGCAATTCAAGCTTCGATTCTA

F3(down)：CTTTAAGAAATGCAACAAGTAGCAGGTG

F4(up)：ACAGACGACTGAAGAGATGATTGATGAACT

F4(down)：TATTTTCATATGGAACAAGATTTGTCTATA

PCR反应体系为50ul，包括：Ex Taq酶0.25uL，Ex Taq Buffer 5uL，dNTP Mix 4uL，从负菌中提取的模板小于1ug，上/下游引物(10uM)各1uL，ddH2O up to 50ul；PCR反应在扩增仪上进行，反应程序为：扩增条件：94℃预变性5min；30个循环：94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸1min；72℃后延伸10min。扩增反应完成后,进行电泳鉴定、回收和加A反应，结果如图1所示。

实施例3以PMD-18T质粒和大肠杆菌DH5ɑ为例说明原核表达体系的构建过程。

产物进行核酸电泳鉴定并割胶回收纯化,纯化回收后连接至pMD-18T载体构建重组克隆质粒,然后转化至大肠杆菌DH5α中扩增，挑取阳性转化子LB液体培养基(AMPr)37℃,220rpm培养10-12h,提取质粒后对质粒进行双酶切、验证,验证正确的进行序列测定。

实施例4为三孢布拉霉crgA基因的序列分析。

将三孢布拉霉负菌crgA基因测序结果输入至NCBI与三孢布拉霉正菌crgA基因序列进行比对。其比对结果如图2所示，由图可以确定三孢布拉霉负菌中同样含有crgA基因。

实施例5为三孢布拉霉crgA基因对其产孢能力影响分析。

根据上述得到的三孢布拉霉负菌crgA基因利用Split-marker法[4]对菌株进行crgA基因的敲除以及构建crgA基因回补菌株。首先制备三孢布拉霉的原生质体悬浮液，再加入split-marker敲除载体片段混合，涂布于麦汁培养基，待长出孢子后进行PCR验证。crgA基因的回补也采用Split-marker法，基因片段同时转化三孢布拉霉原生质体后涂布麦汁培养基，待长出孢子并传代4-5次，测序验证阳性即为crgA基因回补菌株C-ΔcrgA菌。三种菌株产孢子现象如图3所示。

实施例6为分析crgA基因对三孢布拉霉类胡萝卜素结构基因的表达和产类胡萝卜素的影响。

将培养不同时间的三孢布拉霉发酵液10000r/min离心3min收集菌丝体，取适量置于预冷的研钵中，加入液氮将菌丝体研磨至粉末状，之后按照总RNA提取试剂盒说明书进行提取。反转录按照AMV第一链cDNA合成试剂盒说明书进行，产物(cDNA)置于-20℃保存或直接用于下一步实验。将cDNA稀释至50ng/μL，按照说明书配制20μL反应体系：cDNA 2μL，Premix Ex-TaqⅡ10μL，引物(10μmol/L)0.8μL，ddH2O 6.4μL。反应程序：预变性95℃，30s；变性95℃，5s；退火55℃，20s；40个循环。tef1为真核生物的转录因子，其表达不受菌的状态和所处环境的影响，所以在该荧光定量PCR中，选用tef1为内参基因[5]。采用2-ΔΔCt法分析实验结果，计算基因表达差异倍数，所用引物见下表。结果如图4所示。

取培养不同时间的三孢布拉霉发酵液10000r/min离心5min，将获得的菌丝体置于真空干燥箱40℃干燥24h，取适量加入石油醚多次研磨至菌丝无色，收集提取液按20:1(石油醚：BHT，v/m)的比例加入BHT，然后置于-70℃或直接用于下一步实验。将提取液置于旋转蒸发仪，50℃蒸干并加入5mL乙腈重新溶解，取少量用0.22μm有机系滤膜过滤，HPLC法测定色素含量。其中，色谱柱为安捷伦TC-C18，流动相为80％乙腈、20％甲醇，检测波长450nm，流速0.1mL/min，进样量10μL，柱温为28℃。分析crgA基因对三孢布拉霉产类胡萝卜素的影响如图4所示。

参考文献：

[1]Navarro E,Ruiz-Pérez VL,Torres-Martínez S.Overexpression of the crgA gene abolishes light requirement for carotenoid biosynthesis in Mucor circinelloides.European Journal of Biochemistry 2000,267:800-807。

[2]Navarro E,A,Hansberg W,Torres-Martínez S,Garre V.A White Collar 1-like protein mediates opposite regulatory functions in Mucor circinelloides.Fungal Genetics and Biology 2013,52:42-52。

[3]Quiles-Rosillo MD,Ruiz-Vazquez RM,Torres-Martinez S,Garre V.Light induction of the carotenoid biosynthesis pathway in Blakeslea trispora.Fungal Genetics and Biology 2005,42:141-153。

[4]罗玮,巩尊洋,余晓斌.一种基因敲除载体及其构建方法和在三孢布拉霉中的应用.专利号20161026195.7。

[5]Schmidt AD,Thorsten H,Markus M,Liebmann B,Bollschweiler C,Brakhage AA.Analysis of mating-dependent transcription of Blakeslea trispora carotenoid biosynthesis genes carB and carRA by quantitative real-time PCR.Administration,2005,67(4):549-555。

SEQUENCE LISTING

SEQ ID NO.1

SEQ: 4293 bp;

Composition 1262 A; 935 C; 805 G; 1288 T; 3 OTHER

Percentage: 29.4% A; 21.8% C; 18.8% G; 30.0% T; 0.1%OTHER

Molecular Weight (kDa): ssDNA: 1322.54 dsDNA: 2646.23

COLOURS

sequence = 1

features = 0

ORIGIN

1 GGAAATTAAG CTATGCACCG CAGTATAGTC AAGATTATAC AGAAAAGAGG ATCTGCAGAG

61 AAAGCCAAGT TGCCGGAAGA CCTAAGAAGG CTTCTGAGCG AGTACATTCG TTCATTGTTG

121 CTATATGTAG CACAGAACCT TTTTGATAGC TTTGCCAAAA TTCAGACACA AGCCAAGGCC

181 TTTGGGTTTG ATACGTCCAA AGACACAATC ATCGGCTATC TAGCCCAGAA TGGCTTCCCA

241 TTCGATCTGG ACAGCTCATA GACCAAAGCT GACGGATAGA CCCAAGGCAA AACGACTGGA

301 TTGGGCACTT ACCCACACAA ACTGGACCAG TTACCAGTAG GAGGGTGTCA TCTGGTCGGA

361 TGAGTCTCGT TTCCGAGTGG AGAAACAACG ACTGTGACCT CCCCGGGTAA TCTGTAAGAA

421 GGGGGGACAC GCTAGAGGAG AGGAATATCC TCGAAACTAT CAAGTACGGT CATGTTATGG

481 GCATGTTTTT GGGCTAGCAG TTTTGGTCCC TTGGTGGCAG TTGGAGAGAA GATTGGCTGC

541 CGAAAAACAT ATCGTCCAAA ATGTGAAGGA ATTGGCAGCC CCTCATCCAT CAAGAATAGG

601 ACACTTTAGT CGAAAGTATG CCAAATAGAT GTGCAGCTGT CATAAAGGCC AAAGGCGGGC

661 GGGCATACAA GATACTAAAA AACCAATTTT CTTATTTTAT TTTAATAAAG AAGACACTTT

721 TTTTGATCTG TTTTGCATCA TGGACGTGTT TTGGCCATGC TTTCAAACTT TTGTTTTCAG

781 TTTGGATTTA ATTTAATTTC ACCGAAAGAC GCTTTGATAG GTAATGTATG TCGGTGTTGG

841 TTTTTGAATC GTGATAGGTG TAACTCGGAC ACTTCTCTTT TCTGATCGTG AAACTGTTGT

901 AAAGCCCAAG ACTATGAAAA TCAATTCCAA ACCAACTTTG TTTGGCTACA AGAGTTTTCT

961 GTTCAAACCT TCCTGATATA AAAGCGCTCT AAAAGTCCTT TCTGATCTCC CAAAAAAAAA

1021AGCCTACGTT TTGAGTAGCT CGATCCACTA ATAAAGAGCA AGAGAAGAGA CTCCTAAAAT

1081GACTGATTTA TCGCCAGGCT CAAATTTATA CACTTTTGGT AATTATCGAT CATGAAGAAA

1141GAGGATTTCC CTCAGAAGGG CGGGGTTGAT TTGTCGATCA CAAGATAAAT GATTAAGAAA

1201GAATGATAGC ATGACTACAA GGAAACCATT TTGACAATGA CGCAAAATTA ATTAAGCTTT

1261CTGATTCTCT CTCAAAAAAA AAAGGGGCTT TTTTAACGCT TGATCGATTC TTTTTTTTTT

1321TGGCCTTTTT TGTAAGATAA AGTTTTTTTT CTTTTGGGTT TTAAAATCAA AAAAACCAAA

1381AAGAACCCGG GTTTGTTATT TCAAAAATAT TAAATGCTAA AAATGGAGAA AATTGCTGAA

1441AAAGAAATTC AAGGTAAAAA TAAAAACCGA CGAAATTTTC AATTTTTTTT GGGCATAAAA

1501TAAATAAAAA TGAAGTCTTT TTTTTTTCCC TTTTTTTTAA ATAATTCCAT TTCCTTTTTT

1561TTTTCCCCTA ATTTTTTTTC CCTAAGGGGA ATTTTTTACC TTTTTTGGAA ATTTCCTTTT

1621TTTTTTTTTT TAAACCCAGG CCTTTTATTG ACTTTATTTT TTTTTTTTTT TTTTAGTTAA

1681AGCAATTCAA GGTTTGATTT TTTTGTTTCA ATTCCTTTTT TTCAAGGAAA AAAAATTTTT

1741GCTTCAATTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT CTTTTGAGAA TTATCAACAG TGCAAAGCAT

1801ACAACAACAT AAACGATCCC GCGACCAGGT CGACACTTTA TCTGTAGGAC AATTCAATTA

1861GAAGCAAAAG CAGATCGATG TATTTTCACC CTCTGTAGTT GTAGAAGCAT TCACTCGATG

1921TCCTTCTTGT CATGGCAAAT TGAATAAACC AACCACTTTG CCTTGTGGCT TTACAGCTTG

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4201AAGGGTGCTT ATGCTTCAAG AGAAACATAC CAAGATCGAA CAATTGCTCA AACAATTCTC

4261CAGTATAGAC AAATCTTGTT CCATATGAAA ATA

SEQ ID NO.2

SEQ DNAMAN1: 4261 bp;

Composition 1269 A; 891 C; 788 G; 1313 T; 0 OTHER

Percentage: 29.8% A; 20.9% C; 18.5% G; 30.8% T; 0.0%OTHER

Molecular Weight (kDa): ssDNA: 1313.10 dsDNA: 2626.45