技术领域
本发明属于生物分离技术领域，特别是提供了一种生物磁性分离简便方法，适 用于各种生物学方面的分离。
背景技术
本发明涉及葡聚糖纳米磁性微球的制备方法，磁性微球粒径在50-100nm左右， 主要应用在核酸，蛋白质，细胞，免疫学测试方面的应用。
葡聚糖(dextran)，又名右旋糖苷，是具有线状主链的一类多糖，主要又1，6-a -D-吡喃糖苷连接在一起，本身及其在体内的降解产物(CO2、H2O)对人 体无毒，作为血液扩容剂在临床上应用已有五十多年的历史，另外。葡聚糖分子在弱 酸或弱碱的环境下都能稳定存在(JANES KA，CALVO P，ALON SO MJ，Polusaccharide colloidal parti cles as delivery systems for macromo lecules[J].Adv Drug Deliv Rev，2001，47 (1)：83-97.)，结构中含有大量的“OH”，能与某些大分子形成紧密的连 接。近二十年间，人们发现葡聚糖和某些大分子偶联在一起后，表现出了一些意想 不到的效应。如和某些药物或蛋白质、酶等连接，可以增强药物或蛋白质在体内的 生物稳定性，延长半衰期，并降低其免疫原性.葡聚糖是天然多糖类层析介质，早 在20世纪中期就已经出现了，它具有理想介质的许多特性：高亲水性、粒径小、含 有较多的可活化羟基、不与生物大分子发生非特异性吸附，是迄今为止应用最广泛 的一种层析、疏水和离子交换色谱的介质之一。近年来，核酸，细胞，蛋白，免疫学测 试与纯化在生物学实际工作中起着一个重要的角色。随着重组DNA技术和细胞融合 技术的发展，各种生物活性物质如细胞、酶、抗体和核酸等的大量生产成为可能。 这些生物活性物质的附加价值极高，但在原料液中含量比较低。因此，低成本、高 效率纯化目的产物及有效除去有害物质，达到一个高纯度的分离产物是这些生物产 物分离纯化过程所追求的目标。从样品液中分离、提纯于检测各种核酸DNA、RNA、 蛋白质和细胞等是生命科学以及临床医学中一个重要的环节。实际样品液中的分离、 纯化在时间上和经费上都占相当大的比重，甚至占到80％以上。目前常用的分离方 法有沉淀法，离心法，离子交换法、各种色谱法等，这是有些方法需要比较昂贵的 仪器设备，有些方法尽管简单易行操作，但是分离效果差；有些方法操作复杂费时， 使它们在应用上受到了极大的限制。现代对样品制备的要求是能够实现自动化、小 型化；不使用或尽量少使用有毒试剂；速度快、高效；产物适于后续生物操作，成 本低等特点。20世纪80年代开始有学者将磁稳流化床用于生物产物的分离。磁稳 流化床是一种集成份分离过程、分离速度床、固定床和磁分离技术的优点集于一身， 既可以减少离心或者过滤等单元操作步骤、分离速度快、操作条件温和、过程效率 高、产物活性收率高、降低分离纯化的成本，生物分离中具有诱人的开发前景。磁 稳流化床的核心是磁性分离介质，因此适用于磁稳流化床的磁性分离介质的合成是 磁稳流化床操作实现的关键。
但是到目前为止商品化的产品主要集中在国外产品，虽然性能比较好，但是价格 昂贵，让一些研究机构和中小企业望而却步，而且磁性微球粒径主要集中在微米级， 粒径大，同时大部分磁性微球的所包被的有机层，有些包被一些糖类的物质但是由 于物理吸附或者通过简单的化学键连接而成，易脱落，并且粒经分布宽，不均匀 (Stefan Miltenyi.：High Gradient Magnetic Cell Separation With MACS.J Cytometry 11：231-238(1990)，这样对于有些分离受到限制，同时在蛋白包被过程 中过程中，常常使用使用溴化氰，然而溴化氰有剧毒，还有溴化氰活化后的基质上 的配基常常有泄漏现象(Clonis YD，Small DAP.High-performance dye-ligand Chromatograph.In Reactive in Protein and Enzyme Technology(M).London：Macmillan Press，1987.87-100)。
因此本发明的一个目的是制备了一种通过加入一种交联剂使在氧化铁外面包裹 一层结实的天然活性物质葡聚糖连接有免疫磁性微球，粒径小，粒径分布窄，具有天然 的生物活性，通用性强，价格低廉，偶联剂为无毒的化学偶联剂，活化性机制的配基完 善。
发明内容
本发明在于提供一种免疫纳米磁性葡聚糖微球的制备方法，实现了粒径窄，重复 性好，价格低廉，使免疫纳米葡聚糖磁性微球具有天然活性。
本发明工艺步骤如下：
1、共沉淀法制备纳米级的磁性氧化铁粒子0.05-0.6mol/L，所属的氧化铁为 Fe3O4或YFe2O3；
2、Fe2+离子∶Fe3+离子∶Ni2+离子为1∶(1.0-4.0)∶(0.2-0.8)摩尔比配成溶液1，放入 密闭反应瓶中，抽成真空，通入氮气进行保护，温度升温至30-60℃，按上述离子溶液 1∶氢氧化钠(0.5-5mol/L)溶液为1∶(0.2-1)体积比以4-20毫升/分钟速度将氢氧 化钠溶液滴加到上述离子溶液1中，在500-3000转/分钟搅拌下反应，氢氧化钠溶液 滴加后，温度升高到60-100℃，反应30-120分钟后，用去离子水清洗3-6遍，保 存在10-50mM磷酸盐缓冲液当中，2-8℃保存。
3、葡聚糖包裹磁性氧化铁粒子
(1)葡聚糖的活化：0.5-3g/ml葡聚糖的醋酸盐溶液2在100-500转/分钟搅拌 下，按葡聚糖醋酸溶液2∶高碘酸钠(0.05-0.3mol/L)溶液以1∶(0.08-0.5)体积比 向葡聚糖溶液2中添加高碘酸钠溶液，混合，20-25℃下避光反应30-70分钟，反应 结束后在2-8℃去离子水中透析20-24小时；将氧化的葡聚糖保存在去离子水中，2-8 ℃保存。
(2)纳米磁性葡聚糖微球：1体积的活化的50％葡聚糖和3-8体积50％未活化 的葡聚糖混合配成溶液3，按葡聚糖溶液3∶氧化铁((30-80mg/ml)磷酸盐溶液以 体积比1∶1的比例混合，100-500转/分钟搅拌，2-8℃反应24-50小时，按按葡聚 糖溶液3∶氧化铁(30-80mg/ml)磷酸盐溶液以体积比1∶(0.04-0.25)的比例混合， 混匀，2-8℃反应60-150分钟；将上述溶液在磷酸盐缓冲液中2-8℃透析20-24小时； 保存在磷酸盐缓液中，4℃贮存。
4、纳米磁性葡聚糖微球的蛋白的连接
(1)纳米磁性葡聚糖微球的活化：将纳米葡聚糖磁性微球抽干，配制成 0.1-0.5g/ml纳米葡聚糖磁性微球的氢氧化钠溶液中溶液，混合，按纳米葡聚糖磁性 微球溶液∶环氧氯丙烷以1∶0.08-0.4体积比混合，20-25℃反应6-10小时，丙酮、 去离子水润洗3-5次；保存在磷酸盐缓冲液当中，2-8℃保存。
(2)蛋白质的连接：30-100mg/ml纳米磁性葡聚糖微球与0.5-2mg/ml蛋白质量比40-60∶ 1连接，20-25℃下反应2-4小时，然后在磁板上进行分离，用磷酸盐缓冲液洗涤5次，磷酸盐 缓冲液保存，2-8℃贮存。
本发明使用了以下试剂为：
1.葡聚糖可以是以下试剂：葡聚糖T20，葡聚糖T40，葡聚糖T100(T代表不同 型号粒径的葡聚糖)；
2.氧化铁可以是Fe3O4或YFe2O3，
3.磷酸盐溶液浓度为10-50mM，pH值为7.0-7.5
4.醋酸盐溶液浓度为0.01-0.3M，pH值为5.0-6.0
本发明具有以下优点：
1.本方法首先合成一种纳米级磁性氧化铁，并且加入一种镍离子提高氧化铁呈 球形，粒径更小，粒径范围窄，磁性更强。
2.本方法采用化学方法在氧化铁外面包被了一层具有天然活性的葡聚糖，具有 天然活性，结实，牢固。
3.本方法采用了一种低毒性，长臂的环氧氯丙烷进行活化葡聚糖磁性微球，降 低了对环境的污染，提高了可操作性。
4.本方法提供了一种蛋白连接的通用方法，这样降低了试剂使用过程中的错误 率和使用上的方便。
5.本方法的建立可以为生物学方面的分离提供一种，粒径小，粒径分布窄，具有 天然的生物活性，通用性强，价格低廉的试剂。
改变不同的技术参数对免疫纳米磁性葡聚糖微球的影响如下
铁离子与亚铁离子的比例不变，改变铁离子和亚铁离子的浓度，对磁性葡聚糖复 合微球的磁响应性的影响：
恒定其他条件不变，铁离子和亚铁离子的比例不变，改变铁离子和亚铁离子的浓 度，制备磁性葡聚糖复合微球，在TM-VSM2050HGC的震动样品磁强计(VSM)上 进行测量，测定磁响应性，详见表一
表一铁离子与亚铁离子的比例不变，改变铁离子和亚铁离子的浓度，对磁性葡聚 糖复合微球的磁响应性的影响
铁离子/亚铁离子比 0.06 0.2 0.3 磁相应性emu/g 20 35 50
活化的葡聚糖与未活化的葡聚糖的比例对磁性葡聚糖微球粒径的影响：
恒定其他条件，改变活化的葡聚糖与未活化的葡聚糖的比例，制备的纳米磁性葡 聚糖微球。用HIACHI H-600STEM的透射电镜测定纳米磁性葡聚糖微球粒径，详见 下表二
表二改变活化的葡聚糖与未活化的葡聚糖的比例对磁性葡聚糖微球粒径的影 响
活化的葡聚糖/未活化的葡聚糖 1/3 1/4 1/5 1/6 粒径/nm 30.5 55.2 80.8 99.9
蛋白质的用量对100mg纳米磁性葡聚糖微球结合结合蛋白量的影响：
恒定其他条件，改变蛋白质的用量，制备磁性葡聚糖微球，然后测定上清蛋白浓 度，详见表三。
表三蛋白质的用量对100mg纳米磁性葡聚糖微球结合蛋白的量的影响，在 KLB ULTROSPEC II型紫外可见分光光度计上测试上清液，由此算出磁性微球结合蛋 白质的量，详见表三。
蛋白质mg 1 1.5 2 2.5 磁性微球结合蛋白质的量 mg/100mg 0.97 1.43 1.90 2.1
具体实施方式
实施例1：2g的硫酸铁和0.5g氯化亚铁的30毫升混匀液，并加入0.1克硫酸 镍，然后加热到50℃，2000转/分钟速度搅拌下以4-20毫升/分钟速度滴加10毫 升0.6mol/L的氢氧化钠溶液，氢氧化钠滴加完毕后，温度升高到80℃，反应1小时； 用去离子水清洗4次。保存在20mmol/L磷酸盐缓冲液当中，4℃保存。
实施例2：30g葡聚糖题40加入到30毫升0.1M醋酸盐缓冲液中溶解并混匀； 加入9ml的0.1mol/L高碘酸钠溶液，25℃避光反应1小时，反应结束后在4℃条件 下用去离子水中透析20小时；将氧化的葡聚糖保存在30ml去离子水中，向30毫 升40mg/ml氧化铁20mmol/ml磷酸盐缓冲液中慢慢滴入30ml的1体积的50％活 化的葡聚糖和5体积的50％未活化的葡聚糖混合物，500转搅拌，4℃反应48小时， 加入3ml的4mg/ml的硼氢化钠溶液，混匀，4℃反应2小时。将上述溶液用0.15M 磷酸盐缓冲液中4℃透析20小时。保存在磷酸盐缓液中，4℃贮存。
实施例3：将2g纳米葡聚糖磁性微球抽干，加入10ml的0.8mol/L氢氧化钠溶 液，混匀，加入1.5g环氧氯丙烷，混匀，25℃反应8小时，丙酮、去离子水润洗5 次，用25ml磷酸盐缓冲液将纳米磁性葡聚糖微球稀释成80mg/ml；加入0.04g的 0.5mg/m l蛋白质溶液，40℃反应8小时，磁板上进行分离，磷酸盐缓冲液洗涤5 次，磷酸盐缓冲液保存，4℃贮存。