检测甲苯类有机污染物的微生物细胞传感器.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102021219 A (43)申请公布日 2011.04.20 CN 102021219 A *CN102021219A* (21)申请号 200910093242.9 (22)申请日 2009.09.23 C12Q 1/02(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12N 15/70(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (71)申请人 中国科学院生态环境研究中心 地址 100085 北京市海淀区双清路 18 号 (72)发明人 庄国强 于清 呼庆 (54) 发明名称 检测甲苯类有机污染物的微生物细胞传感器 (57) 摘要 本发。

2、明检测甲苯类有机污染物的微生物细胞 传感器及其检测方法涉及一种利用恶臭假单胞菌 降解基因的调控序列及调控蛋白基因跟商业化报 告基因质粒序列， 构建检测甲苯类有机污染物的 微生物细胞传感器以及检测方法。细菌宿主为大 肠杆菌， 使用于甲苯类有机物的检测。 对甲苯的最 低检测浓度为40微摩尔/升， 最高浓度为1000微 摩尔 / 升。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 3 页 CN 102021233 A1/2 页 2 1. 一种微生物传感器，由细菌作基本材料，通过基因工程手段构建用来检测甲苯类 有机污染物。 2. 根据权。

3、利要求 1 所述的微生生物传感器，其特征在于 ：细菌大肠杆菌。 3. 根据权利要求 1 所述的微生生物传感器，其特征在于 ：材料为商业化质粒 pEGMluc 4. 根据权利要求 1 所述的微生生物传感器，其特征在于 ：基因来源为商业化菌株恶 臭假单胞菌 ； 5. 根据权利要求 1 所述的生物吸附剂，其制备方法 ： a、扩增载体片断 ： 首先利用 DELNot-Spe I 引物以商业化质粒 pEGMluc 为模板扩增得到线性化片 断， DEL Not I-Spe I 上游 gcttGCGGCCGCAAGCTTGTCGACCTGCAGGCATGCA CTAGTTCTTCCGCTTCCTCGCTCA。

4、C ；DEL Not I-Spe I ：下游 ：GACTGAGCTC GGAAATTGTAAGCGTTAATAT ；分别用Not I与Spe I进行酶切处理，并进行纯化处理 ； b、扩增终止子片断 ； 利用下列引物 RRNB Spe I ：5 ：ATGGACTAGTATAAAACAGAATTTGCCTGGC 3RRNB NOT I ：5ATTAGCGGCCGCGAGTTTGTAGAAACGCAAAAAGG 3以大肠 杆菌基因组为模版进行扩增得到 RRNB 终止子序列片断，利用 Not I 与 Spe I 进行酶切处 理，并进行纯化处理 ； c、终止子载体重组质粒构建 ： 将上述两步构建好的片断。

5、按照摩尔比为一比三的比例混合后利用T4连接酶在16度下 进行连接 ；利用大肠杆菌作为宿主进行转化得到重组质粒一 ； d、利用PCR方法扩增恶臭假单胞菌中降解甲苯类有机物基因的调控序列以及调控蛋 白基因 ：将从美国菌种保藏管理中心购得的恶臭假单胞菌 ( 编号为 ：ATCC 33015) 接种 于#1271Broth ：苯甲酸钠培养基25mL中，30振荡培养24至48小时。 当细菌生长达到 对数生长期中期时，分别利用引物 ：Pu-Not I ATTAGCGGCCGCCCCGGGAAAGCGCGA TGAAC ；Pu-BamH I ：ACTGGGATCCTCACAGACTCCAGGCGTAACG ；。

6、XylR-Luc Xho I ：CGATCTCGAGATTTTAATGTGGGCTGCTTGGT ；XylR-Luc Sac I ：GTACGAGCTC TTTTCACACAACCTGGGGCG扩增恶臭假单胞菌中降解甲苯类有机物基因的调控序列以 及调控蛋白基因 ； e、含有降解甲苯类有机物基因的调控序列以及调控蛋白基因的重组质粒的构建 ；利 用相应引物的酶分别酶切上步操作得到的片断，回收纯化 ；利用相应的酶酶切重组质粒 一中 ；连入启动子 Pu 的质粒命名为质粒二 ；在质粒二的基础上连入调控蛋白基因 XylR 命名为质粒三 ； f、得到检测甲苯类有机污染物的微生物细胞传感器 利用商业化宿主感受。

7、态细胞为宿主，将质粒三转入宿主细胞得到甲苯类有机污染物 的微生物细胞传感器 g ：接种单菌落 ( 载体细胞空白同时接种 ) 于 50ml 三角瓶中 ；氨苄青霉素终浓度为 100ug/ml ；37 度过夜培养 h ：5ml 的 LB 培养基加入设定浓度的诱导物 ( 如二甲苯浓度 500um) ； 权 利 要 求 书 CN 102021219 A CN 102021233 A2/2 页 3 i ：菌体培养至 OD600 1.2 ； j ：稀释到 OD600 0.4，取 5ml 的稀释好的培养液加入第二步准备好的培养液中 ； 23 度诱导 ； k ：对于细菌，将 40l 未转化细胞 ( 载体细胞 )。

8、 与 50l 转化的培养物混合。 ( 细 胞浓度相同 ) 加入 10l 1M K2HPO4(PH 7.8)，20mM EDTA( 一个溶液 )。 用 -70 度冰 箱快速冷冻混合物 ( 冻融 )(10min)，然后将细胞转移至室温并置于室温水浴中 (23 度或 置于室温下平衡 30 分钟 )。 加入 300l 新鲜配制的裂解混合物 ( 见附录 )。 混合并于室 温孵育 10 分钟 ； l ：检测 ；每个九十六空板中加入 20ul 的裂解液后，加入 100ul 荧光素酶检测液，立 刻检测 ； m ：数据处理，得到数据与空白对照的差值，然后改差值乘以400得到即为每毫升菌 液对应的数值了 ； 6.。

9、 根据权利要求 4 所述的微生物细胞传感器的制备方法，其特征在于 ：所述蛋白胨 水液体培养基为 25mL ；所述振荡培养的温度为 37，酶切在 37条件下进行 ； 7. 根据权利要求 4 所述的微生物细胞传感器的制备方法，其特征在于 ：从美国普通 微生物菌种保藏管理中心购得的恶臭假单胞菌(编号为 ：ATCC33015)在含有苯甲酸钠的 培养基中经诱导，促进其甲苯类有机物降解基因表达。 8. 根据权利要求 4 所述的微生物细胞传感器的制备方法，其特征在于 ：微生物传感 器培养温度为 37，微生物传感器诱导温度为 23，检测数据采集利用发光检测仪检 测。 权 利 要 求 书 CN 10202121。

10、9 A CN 102021233 A1/3 页 4 检测甲苯类有机污染物的微生物细胞传感器 技术领域 0001 本发明涉及一种检测甲苯类有机污染物的微生物细胞传感器的构建方法及其检 测方法。 细菌为大肠杆菌。 该生物吸附剂用于检测环境中甲苯类有机污染物。 背景技术 0002 近年来，随着工业化和农业现代化进程的加快，大量使用合成物质和化学农药 等产品，人类不断向环境中排放大量污染物物质，这些都使人类的健康乃至生命受到威 胁。 甲苯类有机物的广泛使用，已经严重污染环境。 甲苯类的有机物已经被列为污染水 体，土壤的黑名单，必须进行检测控制。 0003 目前监测和检测污染物主要有两种方法 ：一是物理。

11、化学分析法。 其准确度和灵 敏度都很高，但需要成套昂贵的精密分析仪器和专业化实验室，并且这种方法在一些污 染物检测中无法实现 on-site 检测。 另一种方法是直接利用生物体对特定污染物的响应进 行检测，也就是近几年内引起关注的全细胞生物监测。 发明内容 0004 本发明检测甲苯类有机污染物的微生物细胞传感器提出了一种可以有效检测甲 苯类有机污染物的方法。 0005 本发明检测甲苯类有机污染物的微生物细胞传感器是利用恶臭假单胞菌中的能 够特异的降解甲苯类有机物基因的调控序列以及调控蛋白基因与商业化质粒中信号强度 高的 Luc 报告基因一起构建出的一种有效检测甲苯类有机污染物的微生物细胞传感器。

12、。 0006 本发明检测甲苯类有机污染物的微生物细胞传感器的具体操作步骤为 ： 0007 1、扩增载体片断 ： 0008 首先利用 DELNot-Spe I 引物以商业化质粒 pEGMluc 为模板扩增得到线性化片 断， DELNot I-Spe I 上游 gcttGCGGCCGCAAGCTTGTCGACCTGCAGGCATGCACTAGT TCTTCC 0009 G C T T C C T C G C T C A C ； D E L N o t I - S p e I ：下游 ： GACTGAGCTCGGAAATTGTAAGCGTTAATAT ；分别用 Not I 与 Spe I 进行酶切处。

13、理，并 进行纯化处理 ； 0010 2、扩增终止子片断 ； 0011 利用下列引物R R N B S p e I： 5： ATGGACTAGTATAAAACAGAATTTGCCTGGC 3RRNB NOT I ：5ATTAGCGGCCGC GAGTTTGTAGAAACGCAAAAAGG 3以大肠杆菌基因组为模版进行扩增得到RRNB终 止子序列片断，利用 Not I 与 Spe I 进行酶切处理，并进行纯化处理 ； 0012 3、终止子载体重组质粒构建 ： 0013 将上述两步构建好的片断按照摩尔比为一比三的比例混合后利用 T4 连接酶在 16 度下进行连接 ；利用大肠杆菌作为宿主进行转化得到重。

14、组质粒一 ； 说 明 书 CN 102021219 A CN 102021233 A2/3 页 5 0014 4、利用PCR方法扩增恶臭假单胞菌中降解甲苯类有机物基因的调控序列以及调 控蛋白基因 ： 0015 将从美国菌种保藏管理中心购得的恶臭假单胞菌 ( 编号为 ：ATCC 33015) 接 种于 #1271Broth ：苯甲酸钠培养基 25mL 中，30振荡培养 24 至 48 小时。 当细菌 生长达到对数生长期中期时，分别利用引物 ：Pu-Not IATTAGCGGCCGCCCCGGGAA AGCGCGATGAAC ；Pu-BamH I ：ACTGGGATCCTCACAGACTCCAGG。

15、CGTAACG ； XylR-Luc Xho I ：CGATCTCGAGATTTTAATGTGGGCTGCTTGGT ；XylR-Luc Sac I ： GTACGAGCTCTTTTCACACAACCTGGGGCG 扩增恶臭假单胞菌中降解甲苯类有机物基 因的调控序列以及调控蛋白基因 ； 0016 5、含有降解甲苯类有机物基因的调控序列以及调控蛋白基因的重组质粒的构 建 ； 0017 利用相应引物的酶分别酶切上步操作得到的片断，回收纯化 ；利用相应的酶酶 切重组质粒一中 ；连入启动子 Pu 的质粒命名为质粒二 ；在质粒二的基础上连入调控蛋白 基因 XylR 命名为质粒三 ； 0018 6、得到检。

16、测甲苯类有机污染物的微生物细胞传感器 0019 利用商业化宿主感受态细胞为宿主，将质粒三转入宿主细胞得到甲苯类有机污 染物的微生物细胞传感器 0020 以下通过具体实事例详细说明发明的实施，目的在于帮助读者更好地理解本发 明的实质，但不作为对本发明实施范围的限定。 0021 实施例 1 ：第一步 ：接种单菌落 ( 载体细胞空白同时接种 ) 于 50ml 三角瓶中 ； 氨苄青霉素终浓度为 100g/ml ；37 度过夜培养 0022 第二步 ：5ml 的 LB 培养基加入设定浓度的诱导物 ( 如二甲苯浓度 500m) ； 0023 第三步 ：菌体培养至 OD600 1.2 ； 0024 第四步 。

17、：稀释到OD6000.4，取5ml的稀释好的培养液加入第二步准备好的培 养液中 ；23 度诱导 ； 0025 第五步 ：对于细菌，将 40l 未转化细胞 ( 载体细胞 ) 与 50l 转化的培养物混 合。(细胞浓度相同)加入10l 1M K2HPO4(pH 7.8)，20mM EDTA(一个溶液)。用-70 度冰箱快速冷冻混合物(冻融)(10min)，然后将细胞转移至室温并置于室温水浴中(23度 或置于室温下平衡 30 分钟 )。 加入 300l 新鲜配制的裂解混合物 ( 见附录 )。 混合并于 室温孵育 10 分钟 ； 0026 第五步 ：检测 ；每个九十六空板中加入 20l 的裂解液后，加。

18、入 100l 荧光素 酶检测液，立刻检测 ； 0027 第六步 ：数据处理，得到数据与空白对照的差值，然后改差值乘以 400 得到即 为每毫升菌液对应的数值了 ；对甲苯的最低检测浓度为 40 微摩尔 / 升，最高浓度为 1000 微摩尔 / 升。 0028 10 毫升裂解混合物配方 ： 0029 5.5ml 水 0030 2ml 5CCLR 0031 加入 25mg BSA 说 明 书 CN 102021219 A CN 102021233 A3/3 页 6 0032 2.5ml 溶 菌 酶 混 合 液 ( 配 5ml 配 方 ：0.5ml 1M 1M K2HPO4(pH 7.8)，20mM EDTA+4.5ml 无菌水然后加入 25mg 溶菌酶 ) 混合均匀。 说 明 书 CN 102021219 A 。