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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410271188.3 (22)申请日 2014.06.17 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104004692 A (43)申请公布日 2014.08.27 (83)生物保藏信息 CCTCC NO:M 2013373 2013.08.08 (73)专利权人 江南大学 地址 214122 江苏省无锡市蠡湖大道1800 号 (72)发明人 徐岩吴群郅岩 (74)专利代理机构 北京爱普纳杰专利代理事务 所(特殊普通合伙) 11419 代理人 何自刚王玉松 (51。
2、)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C12G 3/02(2006.01) C12R 1/125(2006.01) (56)对比文件 EP 2662363 A1,2013.11.13,全文. CN 102834504 A,2012.12.19,全文. CN 101724014 A,2010.06.09,全文. 李宝庆 等.枯草芽孢杆菌BAB-1产脂肽类及 挥发性物质的分离和鉴定. 中国农业科学 .2010,第43卷(第17期),摘要、 第3552页右栏倒 数第1段. 杨丽莉 等.枯草芽孢杆菌抗菌脂肽对嗜水 气单胞菌抑菌效果. 食品科学 .2011,第32卷 (第01期),19。
3、3-198. 审查员 彭海航 (54)发明名称 一种枯草芽孢杆菌及其在控制白酒中土臭 味的应用 (57)摘要 本发明公开了一种新型枯草芽孢杆菌， 从高 温酿酒大曲中分离得到一株枯草芽孢杆菌， 2013 年8月12日保藏在中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)， 保藏编号为CCTCCNO:M2013373。 通过 向白酒酿造中添加一定量短小芽孢杆菌控制白 酒中土臭味的产生。 该菌株能够合成抗菌脂肽类 活性物质， 抑制白酒酿造过程中产土臭素链霉菌 的生长和土臭素的合成， 从根本上控制浓、 清、 酱 等不同香型白酒中的土臭味。 权利要求书1页 说明书6页 附图2页 CN 104004692 B 20。
4、16.09.07 CN 104004692 B 1.一种枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)BS-1， 分离自高温酿酒大曲， 2013年8月12 日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)， 保藏编号为CCTCC:M2013373。 2.一种利用权利要求1所述的枯草芽孢杆菌控制白酒中土臭味的方法， 其特征是通过 向白酒酿造过程中添加一定量的枯草芽孢杆菌以控制白酒中土臭味。 3.权利要求2所述方法， 其特征在于所述枯草芽孢杆菌可以菌液或固体菌剂形式添加 至酿造大曲中。 4.权利要求2或3所述的方法， 其特征在于所述枯草芽孢杆菌的用量为大曲中链霉菌总 量的1至100， 能降低酿造大曲。
5、中链霉菌含量至47-100， 降低白酒中土臭素浓度 20-100。 权利要求书 1/1 页 2 CN 104004692 B 2 一种枯草芽孢杆菌及其在控制白酒中土臭味的应用 技术领域 0001 本发明属于食品微生物技术领域， 具体涉及一株抑制白酒中土臭味的枯草芽孢杆 菌的分离筛选及控制白酒中土臭味的方法。 背景技术 0002 白酒是我国特有的一种蒸馏酒， 并深得消费者喜爱。 独特的开放式多菌种固态发 酵， 以及固态蒸馏模式赋予白酒独特的香味。 白酒中的土臭味使白酒的香气和质量大打折 扣， 优级品率降低， 白酒生产企业每年因此而蒙受多达上亿元的巨大经济损失。 0003 现有的包括物理吸附在内的。
6、技术手段， 虽然能够在一定程度上去除大曲中的土臭 味， 但此方法不仅耗时费力成本高， 且能够同时非特异性地吸附有益香气成分， 对白酒的香 气和质量带来负面影响。 因此这种方法有重大缺陷且难以大规模应用。 0004 已有研究表明， 土臭素是白酒中土臭味的化学来源， 酿酒大曲中的链霉菌是土臭 素的主要产生菌。 通过一定手段控制大曲中产土臭素的链霉菌的数量应该是控制白酒中土 臭味的根本方法。 通过添加化学合成类抗生素来去除大曲中的链霉菌进而防止土臭味产生 的方法并不能应用于实际生产过程。 这是因为添加抗生素一方面造成食品安全上的巨大风 险， 另一方面抗生素也能破坏大曲中的有益产酒产香功能微生物的微生。
7、态结构， 进而影响 白酒的香气和质量。 因而， 目前尚未有一种既能去除白酒生产中的土臭味， 又能保留白酒中 的有益香气成分， 维持大曲中有益功能产酒产香微生物的微生态结构的方法。 0005 来源于土壤、 植物叶子及果实表面等天然环境的诸多芽孢杆菌， 例如枯草芽孢杆 菌( B .subtilis )， 解淀粉芽孢杆菌( B .amyloliquefaciens )， 地衣芽孢杆菌 (B.licheniformis)和短小芽孢杆菌(B.pumilus)， 能够产生系列抗菌脂肽， 具有抑制多种 植物病原微生物及人类病原微生物的效果。 许多研究者对芽孢杆菌产生的脂肽产生了浓厚 的兴趣， 包括其优秀的表。
8、面活性功能， 生物防治及抗生素疗效方面的特征， 以及在抗血栓、 抗肿瘤方面的药效功能。 我们首次从高温酿造大曲中分离了产抗菌脂肽的枯草芽孢杆菌 B.subtilisBS-1， 发现其能够有效抑制白酒酿造过程中以Streptomycesalbus为代表的 产土臭素链霉菌的生长以及土臭素的形成。 发明内容 0006 针对现有的技术难点及存在的问题， 本发明从酿酒高温大曲中分离、 筛选获得一 株产抗菌脂肽的枯草芽孢杆菌。 与其它环境中分离的枯草芽孢杆菌相比， 高温大曲中分离 得到的枯草芽孢杆菌能耐高温： 45-60， 耐酸： pH3.05.0， 耐乙醇： 012， 能够在白酒 酿造过程中的胁迫条件(。
9、制曲最高温度达5060； 发酵酒醅pH3.54.0之间； 乙醇最高达 7左右)下生存并发挥功能。 对该菌株对白酒酿造中产土臭味链霉菌的拮抗能力和抑制土 臭素合成能力开展了一系列研究。 0007 本发明从高温酿酒大曲中分离筛选获得一株对土臭素产生菌具有很好拮抗作用 的微生物菌株， 经16SrRNA分析和其他形态学分析， 确定该菌株为枯草芽孢杆菌， 并命名为 说明书 1/6 页 3 CN 104004692 B 3 枯草芽孢杆菌(B.subtilis)BS-1。 该菌株已于2013年8月12日送交湖北省武汉市武汉大学 内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏， 保藏编号为CCTCCNO:M20。
10、13373。 试验表明分 离的枯草芽孢杆菌BS-1， 能够抑制产土臭味链霉菌的生长且抑制土臭素合成， 同时又对大 曲中的有益功能产酒产香微生物的生长没有影响。 0008 分离得到的枯草芽孢杆菌BS-1， 与白酒酿造过程中产土臭素的链霉菌混合培养 时， 能有效抑制产土臭素链霉菌的生长， 对土臭素的产生有显著抑制作用。 0009 从该枯草芽孢杆菌的培养物中获得具有抗菌活性物质1， 被表征为抗菌脂肽 surfactin系列物质。 具有如说明书所示的质谱图谱， 且有如下结构： 0010 0011 抗菌脂肽surfactin及同系物能显著抑制白酒酿造过程中产土臭素链霉菌的生 长， 且对土臭素的合成有显著。
11、的抑制作用。 0012 从该枯草芽孢杆菌的培养物中获得具有抗菌活性物质2， 被表征为抗菌脂肽 fengyciA和fengycinB系列物质。 具有如说明书所示的质谱图谱， 有如下结构： 0013 0014 抗菌脂肽fengycinA和fengycinB及同系物能显著抑制白酒酿造过程中产土臭 素链霉菌的生长， 且对土臭素的合成有显著的抑制作用。 0015 本发明枯草芽孢杆菌在白酒生产中以菌液或固体菌剂形式添加至酿造大曲中， 添 加的菌体总量为大曲中链霉菌总量的1至100。 0016 具体制备步骤如下所述： 0017 1.细菌的分离筛选与鉴定： 从高温大曲中分离出具有拮抗产土臭素链霉菌的细 菌。 。
12、对检测到的具有显著抗菌活性的细菌进行16SrRNA和形态鉴定。 确定我们分离得到的 是一株枯草芽孢杆菌， 16SrRNA的同源性为98。 0018 2.抗菌活性物质的分离纯化及有效成分鉴定： 对上述获得的枯草芽孢杆菌培养2 天后发酵液用有机溶剂萃取(见实施例1)提取抗菌活性物质， 将萃取后液体真空旋转蒸发 说明书 2/6 页 4 CN 104004692 B 4 浓缩(见实施例1)， 并溶于少量的无菌蒸馏水中。 用HPLC进一步分离纯化， 利用洗脱曲线各 峰值的组分进行抗菌活性检测。 用UPLC/ESI-TOF-MASS鉴定抗菌物质。 0019 3.对分离得到的枯草芽孢杆菌菌株拮抗产土臭素链霉。
13、菌生长及土臭素产生的应 用检测。 将上述分离得到的枯草芽孢杆菌菌株与产土臭素的链霉菌菌株按照不同比例接种 马铃薯-葡萄糖液体培养基， 30恒温摇床下200rpm培养50h。 用qPCR鉴定混合培养中的链 霉菌含量； 用顶空固相微萃取气相色谱质谱联用技术(HS-SPME-GC-MS)检测混合培养体系 中土臭素的含量(见实施例2)。 0020 4.对步骤2提取的抗菌活性物质拮抗产土臭素链霉菌的生长及土臭素产生的应用 检测。 将提取得到的抗菌活性物质加入到接种有产土臭素链霉菌菌株的马铃薯-葡萄糖液 体培养基中， 30恒温摇床下200rpm培养50h。 用qPCR鉴定混合培养中的链霉菌含量； 用顶 空。
14、固相微萃取气相色谱质谱联用技术(HS-SPME-GC-MS)检测混合培养体系中土臭素的含量 (见实施例3)。 0021 实施结果 0022 通过16SrRNA分析确定我们分离的菌株为枯草芽孢杆菌， 同源性98。 该菌对白 酒生产过程中的土臭素产生菌S.albus， S.fradiae， S.radiopugnans， S.sampsonii， 都有明 显的抗菌效果。 我们成功的分离到了该菌株的抗菌成分， 经质谱鉴定推测为surfactin和 fengycin。 0023 将分离得到的枯草芽孢杆菌菌株按一定比例添加到产土臭素的链霉菌的培养基 中， 共同培养一定时间， 经qPCR和HS-SPME-。
15、GC-MS检测分析， 枯草芽孢杆菌能显著抑制链霉 菌的生长及土臭素的产生。 0024 将HPLC分离得到的抗菌活性物质加入到产土臭素的链霉菌的培养基中， 培养一定 时间， 经qPCR和HS-SPME-GC-MS检测分析， 抗菌活性物质能显著拮抗产土臭素链霉菌的生长 及土臭素的产生。 0025 本发明提供的枯草芽孢杆菌来源于高温酿造大曲， 能产生两种抗菌脂肽， 可降低 酿造大曲中链霉菌含量最高至100， 降低白酒中土臭素浓度最高至100。 附图说明 0026 图1是枯草芽孢杆菌在PDA平板上表现的抗链霉菌活性。 0027 图中PDA平板上涂布了80 l链霉菌孢子(1108孢子/ml)， 平板中央。
16、滴加2 l过夜 培养的枯草芽孢杆菌培养液。 在枯草芽孢杆菌的菌落周围形成了明显的抑菌圈。 0028 图2是枯草芽孢杆菌发酵液经甲醇萃取后的活性组分HPLC液相色谱图， 共收集得 到6个组分。 0029 图3是分离提取得到的脂肽在PDA平板上表现的抗链霉菌活性。 0030 图中PDA平板上涂布了80 l链霉菌孢子(1108孢子/ml)。 Control号牛津杯中分 别加入纯甲醇作为对照， 16牛津杯为HPLC分离得到的个出峰组分。 与空白对照相比， 3， 4， 5， 6号组分表现出抗链霉菌活性。 0031 图4是surfactin的ESI-TOF-MASS图谱。 0032 图5是fengycin。
17、A的ESI-TOF-MASS图谱。 0033 图6是fengycinB的ESI-TOF-MASS图谱。 说明书 3/6 页 5 CN 104004692 B 5 具体实施方式： 0034 实施例1 0035 1.枯草芽孢杆菌BS-1的筛选分离： 0036 用无菌铲刀取1g不同阶段和不同曲饼位置的大曲曲粉于5ml的无菌塑料离心管 中。 向离心管中加入5ml的生理盐水(0.9氯化钠溶液)， 漩涡震荡2分钟， 静置10分钟后吸 取2 l点种涂布有链霉菌S.albus， S.fradiae， S.radiopugnans， S.sampsonii孢子的PDA平 板中央(含200g马铃薯煮出液， 20g。
18、葡萄糖， 加蒸馏水定容至1L， 加15g琼脂)于30恒温培养 箱培养72h， 检测平板中央的抑菌圈的大小。 选取抑菌圈最大的菌落在PDA平板上划线分离 出单菌种， 分别点种涂布有有链霉菌S.albus， S.fradiae， S.radiopugnans， S.sampsonii孢 子的PDA平板中央， 观察抑菌圈的大小。 对检测到的显著抑菌活性的细菌进行16SrRNA和形 态鉴定。 以LB液体培养基(含10g胰蛋白胨， 10g氯化钠， 5g酵母粉)， 30-37过夜培养分离 得到的细菌， 用常规细菌基因组提取方法提取基因组DNA。 以测定16SrRNA的通用引物(由 上海生工生物工程技术有限。
19、公司合成)进行PCR反应。 1琼脂糖凝胶电泳检测扩增出大小 为1.5kb左右的DNA片段， 送交上海生工生物技术有限公司进行序列测定后在NCBI中经 Blast比较分析确定为枯草芽孢杆菌。 0037 2.枯草芽孢杆菌BS-1无菌发酵液的制备： 0038 接种保存的枯草芽孢杆菌到100ml灭菌的LB培养基中， 37， 200rpm培养过夜。 然 后接种1ml新鲜培养物到含有1L新鲜LB培养基的2L三角瓶中， 30或37， 200rpm培养48h。 然后8000g离心10min收集上清， 用0.22微米的滤膜过滤除菌后得到无菌发酵液4保存备 用。 0039 3.枯草芽孢杆菌BS-1无菌发酵液抗菌活。
20、性物质的纯化： 0040 将得到的枯草芽孢杆菌的无菌发酵液用等体积的乙醇:三氯甲烷(1:1)萃取10- 15h。 有机相经真空旋转蒸发仪(BUCHI， RotavaporR-210)60蒸干， 再用少量蒸馏水溶解。 溶解后得到的溶液经0.22微米的滤膜过滤后， 采用HPLC纯化； 285nm紫外检测； 流动相为 0.1甲酸溶液和甲醇， 得到如图2的液相色谱图。 从HPLC色谱图上可以看到共有6个组分。 从6个组分中分别取200 l， 加到涂布有Streptomycesalbus孢子的PDA平板中的牛津杯内， 30恒温培养箱培养72h， 观察各组分的抑菌情况。 结果如图3， 表明组分3-6均有抑。
21、菌活性， 且组分3的抑菌活性最佳。 0041 4.UPLC/ESI-TOF-MASS鉴定抗菌物质 0042 分别对HPLC收集到的具有抑菌活性的组分3-6进行超高效液相色谱飞行时间质谱 联用技术(UPLC/ESI-TOF-MASS)分析。 UPLC采用UPLCTMBEHC18(100mm2.1mm， 1.7 m)色谱 柱， 以甲醇和水作为流动相， 进行线性梯度洗脱。 质谱采用正离子模式， 离子扫描范围50 1500m/z。 采用Masslynx4.1软件对数据进行采集和分析。 结果见图4-6， 分离的抑菌物质分 子量为1008及同系物， 推测为surfactin； 分子量1463及同系物， 推。
22、测为fengycinA； 分子量 1491及同系物为fengycinB。 0043 实施例2： 枯草芽孢杆菌BS-1抑制链霉菌生长及土臭素产生的应用检测 0044 1.枯草芽孢杆菌BS-1与产土臭素链霉菌Streptomycesalbus的混合培养 0045 将分离得到的枯草芽孢杆菌BS-1与产土臭素的链霉菌菌株S.albus按照1:10000, 说明书 4/6 页 6 CN 104004692 B 6 1:1000,1:100,1:10,1:1的比例(对应地， 枯草芽孢杆菌菌株的接种量分别为0.1， 1， 1， 10， 100)接种马铃薯-葡萄糖液体培养基， 30恒温摇床200rpm培养50。
23、h。 发酵结束 后， 取1ml菌液离心后收集菌体， 做混合培养下链霉菌菌株Streptomycesalbus的生物量测 定。 剩余发酵液10000g离心除去菌体， 经0.22 m微孔滤膜过滤除菌后， 得到无菌发酵液， 4 保藏备用。 0046 2.qPCR检测混合培养体系中链霉菌Streptomycesalbus生物量 0047 采用绝对定量的方法检测混合体系中Streptomycesalbus生物量。 0048 按照用常规细菌基因组提取方法提取纯培养链霉菌S.albus(空白对照组)基因组 DNA， 并用NanoDrop1000(NanoDropTechnologies， Wilmingto。
24、n， DE， USA)测定基因组浓度， 计算基因组拷贝数。 按照10倍梯度稀释， 得到一系列浓度梯度的Streptomycesalbus基因 组DNA作为qPCR模板， 制作基因组拷贝数与qPCRCt值的标准曲线。 20 lqPCR体系包括： SsoFastEvaGreenSupermix10 l(Bio-Rad)， 引物各0.4 l， ddH2O8.2 l， 模板1 l； 扩增程 序为98预变性2min， 39个循环的98变性5s， 6015s。 应用Bio-RadCFXManager2.1进 行数据采集和处理， 得到基因组拷贝数与qPCRCt值的标准曲线。 0049 按照用常规细菌基因组提。
25、取方法提取不同枯草芽孢杆菌接种量的链霉菌S.albus 基因组DNA， 稀释100倍作为qPCR模板。 20 lqPCR体系包括： SsoFastEvaGreenupermix10 l(Bio-Rad)， 引物各0.4 l， ddH2O8.2 l， 模板1 l； 扩增程序为98预变性2min， 39个循环的 98变性5s， 6015s， 39循环。 应用Bio-RadCFXManager2.1进行数据采集和处理， 根据 qPCRCt值和基因组拷贝数与qPCRCt值的标准曲线计算不同枯草芽孢杆菌接种量的链霉 菌S.albus基因组拷贝数， 并进行绝对定量， 结果见表1。 从结果可以看出添加1， 。
26、10， 100的枯草芽孢杆菌能有效抑制链霉菌的生长。 0050 表1不同接种量的B.subtilis对S.albus的抑制作用 0051 B.subtilis接种量S.albus抑制率 0(对照)0 147 1088 100100 0052 3.混合培养对S.albus产土臭素的影响 0053 混合培养的无菌发酵液中的土臭素含量采用HS-SPME-GC-MS方法进行定量。 定量 结果见表2。 结果表明添加不同比例的枯草芽孢杆菌能有效抑制土臭素的产生。 0054 表2不同接种量的B.subtilis对S.albus产土臭素的影响 0055 B.subtilis接种量土臭素抑制率 0(对照)0 1。
27、50 1078 100100 0056 实施例3： 枯草芽孢杆菌BS-1抗菌活性组分拮抗产土臭素链霉菌及土臭素产生的 说明书 5/6 页 7 CN 104004692 B 7 应用检测 0057 1.添加枯草芽孢杆菌抗菌活性组分的产土臭素链霉菌S.albus的培养 0058 将HPLC分离得到的抗菌活性组分3， 4和组分5， 6分别添加到产土臭素的链霉菌菌 株S.albus的马铃薯-葡萄糖液体培养基中， 30恒温摇床下200rpm培养50h， 对照组为添加 等体积的甲醇。 发酵结束后， 取1ml菌液离心后收集菌体， 做链霉菌菌株S.albus的生物量测 定。 剩余发酵液10000g离心除去菌体。
28、， 经0.22 m微孔滤膜过滤除菌后， 得到无菌发酵液， 4 保藏备用。 0059 2.qPCR检测链霉菌S.albus生物量 0060 qPCRCt值和基因组拷贝数的标准曲线的制作方法同实施例2 0061 按照用常规细菌基因组提取方法提取不同枯草芽孢杆菌接种量的链霉菌S.albus 基因组DNA， 稀释100倍作为qPCR模板。 20 lqPCR体系包括： SsoFastEvaGreenSupermix10 l(Bio-Rad)， 引物各0.4 l， ddH2O8.2 l， 模板1 l； 扩增程序为98预变性2min， 39个循环 的98变性5s， 6015s， 39循环。 应用Bio-Ra。
29、dCFXManager2.1进行数据采集和处理， 根据 qPCRCt值和基因组拷贝数的标准曲线得到不同枯草芽孢杆菌接种量的链霉菌S.albus基 因组拷贝数， 结果如表3， 表明添加抑菌组分能够有效抑制链霉菌S.albus的生长。 0062 表3抑菌组分对S.albus的抑制作用 0063 抑菌组分S.albus抑制率 对照0 Surfactin63 Fengycin56 0064 3.抗菌活性组分对S.albus产土臭素的影响 0065 添加抗菌活性组分的发酵液中土臭素含量采用HS-SPME-GC-MS方法进行定量， 结 果如表4， 结果表明添加抑菌组分能够有效抑制土臭素的合成。 0066 表4抑菌组分对对S.albus产土臭素的影响 0067 抑菌组分土臭素抑制率 对照0 Surfactin100 Fengycin96 说明书 6/6 页 8 CN 104004692 B 8 图1 图2 图3 说明书附图 1/2 页 9 CN 104004692 B 9 图4 图5 图6 说明书附图 2/2 页 10 CN 104004692 B 10 。