一种链霉菌柠檬酸合酶基因及其编码蛋白.pdf

《一种链霉菌柠檬酸合酶基因及其编码蛋白.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种链霉菌柠檬酸合酶基因及其编码蛋白.pdf（8页完整版）》请在专利查询网上搜索。

1、(10)申请公布号 CN 102061300 A (43)申请公布日 2011.05.18 CN 102061300 A *CN102061300A* (21)申请号 201010562673.8 (22)申请日 2010.11.27 C12N 15/52(2006.01) C12N 9/00(2006.01) C12N 15/63(2006.01) C12N 15/82(2006.01) (71)申请人 安徽师范大学 地址 241000 安徽省芜湖市弋江区花津南路 安徽师范大学 (72)发明人 朱国萍 葛亚东 曹正宇 王鹏 宋平 (74)专利代理机构 芜湖安汇知识产权代理有限 公司 3410。

2、7 代理人 谢世红 (54) 发明名称 一种链霉菌柠檬酸合酶基因及其编码蛋白 (57) 摘要 本发明公开了一种链霉菌柠檬酸合酶基因及 其编码蛋白， 所述的基因具有 SEQ ID NO ： 1 所示 的基因序列。该基因的完整 ORF 长为 1290bp， 编 码一个429个氨基酸的多肽。 将 SdCS 与表达载体 pET-28b(+) 连接， 转化 E.coli Rosetta(DE3) 感 受态细胞， 经诱导表达、 纯化， 获得了可溶性融合 蛋白His6-SdCS。 柠檬酸合酶基因在转基因植物中 具有较高的应用价值， 可用于植物的基因改良。 通 过转入 SdCS 基因， 可提高农作物的产量以及。

3、对于 一些胁迫环境的耐受力。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 1 页 CN 102061305 A1/1 页 2 1. 一种链霉菌柠檬酸合酶基因， 其特征在于， 具有 SEQ ID NO ： 1 所示的基因序列。 2. 一种由权利要求 1 所述基因编码的蛋白， 其特征在于 ： 具有 SEQ ID NO ： 2 所示的氨 基酸序列。 3. 一种含有权利要求 1 所述基因的重组质粒及其构建方法。 4. 权利要求 1 所述链霉菌柠檬酸合酶基因在植物基因工程中的应用。 权 利 要 求 书 CN 1020613。

4、00 A CN 102061305 A1/5 页 3 一种链霉菌柠檬酸合酶基因及其编码蛋白 1 技术领域 0001 本发明属于基因工程技术领域， 涉及链霉菌柠檬酸合酶基因、 该基因编码的蛋白 以及该基因的应用。 2 背景技术 0002 柠檬酸合酶(citrate synthase， CS， EC 4.1.3.7)几乎存在于所有的生物体中， 是 细胞内多种代谢途径的关键限速酶及代谢变化的标志酶。CS 可催化草酰乙酸和乙酰辅酶 A 之间的缩合反应生成柠檬酸和辅酶 A。根据其在真核细胞中的定位不同， CS 可分为线粒体 CS(mCS)、 乙醛酸循环体 CS(gCS)、 过氧化物酶体 CS(pCS)。。

5、CS 具有多种同工酶， 这些同工酶 参与多种生理过程， 如线粒体能量代谢、 种子萌发和抗逆等。 近年来， 由于其在农业、 医学上 的应用价值， CS 受关注的程度日益升高。 0003 CS 的同工酶存在于不同的亚细胞结构中， 参与细胞内多个重要的生理代谢途径。 由于柠檬酸在植物代谢中起重要作用， 近年来关于利用 CS 基因进行转基因植物的研究逐 渐成为热点。 已有研究表明植物可以通过分泌柠檬酸活化土壤中难溶性无机磷来提高土壤 磷的可利用性。将 CS 基因导入粳稻和籼稻中， 通过筛选获得转基因阳性植株， 使 CS 在水稻 植株内超表达， 以加速根系大量合成和分泌柠檬酸， 可培育出耐低磷胁迫的转基。

6、因水稻植 株， 直接用于生产。另外， CS 等有机酸可与 Al3+络合形成稳定的复合物， 这些复合物对植物 的毒性较低甚至是无毒的， 所以提高有机酸合成酶基因的表达活性， 增加有机酸的合成与 分泌， 有利于增强植物的抗铝毒耐性。研究发现， 在紫花苜蓿中超表达 CS 基因， 转基因苜蓿 对酸性土壤以及铝毒的耐受力明显增强， 植株的产量显著提高。此外， 在果实的成熟过程 中， 有机酸的积累与 CS 的表达有关。在菠萝成熟过程中， 果实中有机酸 ( 主要是柠檬酸 ) 的含量与 CS 活性成极显著的正相关。这可为提高水果品质提供了理论依据。CS 基因能够 显著改变植物生长状态， 提高植物的产量以及对于。

7、一些胁迫环境的耐受力， 因此具有较高 的应用价值。 0004 链霉菌 (Streptomyces) 是一种重要的原核生物， 属于放线菌目革兰氏阳性土壤 细菌。菌丝呈分枝状， 好气腐生。链霉菌有 “大自然最全能的抗生素生产者” 的美誉。目前， 医学应用的抗生素中， 约有三分之二来源于链霉菌属。 同时， 链霉菌次级代谢物的种类繁多 且功能多样， 不仅有抗细菌、 抗真菌、 抗病毒和抗癌等作用， 而且代谢物具有免疫抑制剂、 降 血压和抗高胆固醇的性质。因此， 链霉菌是工业上获得次级代谢产物的重要来源。另外， 链 霉菌还可以产生多种可分解蛋白质、 木质素、 几丁质及纤维素的酵素， 分解自然界不易被其 它。

8、微生物分解的物质， 如促进废弃物的分解， 可以生产有机肥， 解决环境污染问题并提高废 弃物的价值等， 工业用途十分广泛。近年来， 随着有效的链霉菌表达系统的构建， 链霉菌分 子生物学研究发展迅速， 越来越引起人们重视。 3 发明内容 0005 本发明所要解决的第一个问题是提供一个目前尚未完成全基因组测序的链霉 说 明 书 CN 102061300 A CN 102061305 A2/5 页 4 菌淀粉酶链霉菌柠檬酸合酶基因 (SdCS)。其具有如序列表 SEQ ID NO ： 1 所示的基因 序列。 0006 本发明所要解决的第二个问题是提供上述基因所编码的蛋白质 SdCS 及其制备方 法， 。

9、其具有如序列表 SEQ ID NO ： 2 所示的氨基酸序列。 0007 本发明所要解决的第三个问题是提供含有淀粉酶链霉菌 SdCS 基因的重组质粒及 其构建方法。 0008 本发明所要解决的第四个问题是提供淀粉酶链霉菌 SdCS 基因在转基因植物中的 应用。 4 附图说明 0009 图 1 淀粉酶链霉菌基因组第一次克隆 PCR 结果电泳图。 0010 M ： DL-2000Marker ； 1， 2 ： PCR 扩增产物， 1563bp。 0011 图 2SdCS 基因 ORF 保守片段电泳图。 0012 M ： DL-2000Marker ； 1 ： PCR 扩增产物， 1290bp。 0。

10、013 图 3His6-SdCS 融合蛋白 SDS-PAGE 电泳和 Western blot 分析图 0014 (A)SDS-PAGE 电泳 (12 gel)。M ： protein molecular mass marker ； lane 1， 纯 化的 SdCS 融合蛋白 ； lane 2， pET-SdCS 重组质粒转化 Rosetta(DE3) 菌， 经 IPTG 诱导表达 后的上清蛋白， SdCS本身分子量约为45kDa ； lane 3， pET-SdCS重组质粒转化Rosetta(DE3) 菌， 未经 IPTG 诱导表达的上清蛋白 ； lane 4， pET-28b(+) 空载。

11、质粒转化 Rosetta(DE3) 菌， 诱导表达后的上清蛋白。 0015 (B)Western-blot 分析。lane 1， 纯化的 SdCS 融合蛋白 ； lane 2， 阴性对照， pET-28b(+) 空载质粒转化 Rosetta(DE3) 菌， 经 IPTG 诱导表达后的上清蛋白。箭头所示 SdCS 蛋白亚基条带所处的位置。 5 具体实施方式 0016 5.1 链霉菌 DNA 的提取、 同源引物的设计及 PCR 扩增 0017 用Genomic DNA Purification Kit(Promega 公 司 ) 抽 提 链 霉 菌 M1033( 山东省食品发酵工业研究院设计院 )。

12、 基因组 DNA。依据链霉菌属 CS 基因之间的 同源性， 设计一对引物 ： P1(5 -AAGTGGGGGATGGTAGAGACAGT-3 ) 和 P2(5 -CCTCACAGA CGCCCGGCCGGATC-3 )， 以淀粉酶链霉菌基因组 DNA 为模板， P1 和 P2 为引物， 使用高保真 PrimeHS DNA聚合酶进行PCR扩增， 扩增反应条件 ： 94预变性3min ； 9430sec， 60 45sec， 72 2min， 30 个循环 ； 72延伸 5min。 0018 引物 P1/P2 扩增产物经 1琼脂糖凝胶电泳检测， 结果见图 1。使用 DNA GelExtractio。

13、n Kit(Axygen)回收PCR产物。 将该DNA片段连接到pMD19-T载体(TaKaRa)， 阳性克隆送到上海生工生物工程公司进行测序， 得到一个 1563bp 的 DNA 片段。 0019 5.2 全长 SdCS 基因片段的获得 0020 将所得的序列进行核苷酸 BLAST 同源性比对发现， 该片段内包含一个完整的 ORF， 全长 1290bp， 如序列表 SEQ ID NO ： 1 所示。该 ORF 编码一个 429 个氨基酸的多肽， 如序列 表 SEQ ID NO ： 2 所示。所得 ORF 与该属已知的柠檬酸合酶基因的核苷酸序列同源性可达到 说 明 书 CN 102061300。

14、 A CN 102061305 A3/5 页 5 90以上 ； 氨基酸序列同源性也在 90以上。因此， 引物 P1/P2 扩增片段中包含的这个 ORF 应该是编码淀粉酶链霉菌 CS 的全基因。 0021 根据已经获得的 SdCS 基因的保守片段序列设计两个基因特异性引物 ： P3(5 -CT CCTGCCATATGAGCGACAACTCTGTAGTACTGC-3， 下划线位置为限制性内切酶 Nde I 酶切位点 ) 和 P4(5 -ATTAGTATGCGGCCGCTCAGCGCTCCTCGACGGGCACG-3， 下划线位置为 Not I 酶切位 点 )， PCR 扩增淀粉酶链霉菌 CS 的完。

15、整 ORF， 扩增反应条件 ： 94预变性 3min ； 94 30sec， 56 45sec， 72 1.5min， 30 个循环 ； 72延伸 5min。引物 P3/P4 的 PCR 扩增产物经 1的 琼脂糖凝胶电泳检测结果见图 2。 0022 5.3pET-SdCS 原核表达载体的构建及融合蛋白的诱导表达 0023 引物 P3/P4 的 PCR 扩增产物与载体 pET-28b(+) 分别经 Nde I 和 Not I 双酶 切 4 小时候后进行连接， 获得原核表达质粒 pET-SdCS。将 pET-SdCS 重组质粒转化至 E.coli Rosetta(DE3) 感受态细胞， 挑取单克隆。

16、于 5ml LB 液体培养基中， 37， 225rpm， 培 养 12h。取 1ml 菌液接种于 50ml 的 LB 液体培养基中扩大培养， 37， 225rpm， 振荡培养至 OD600 0.6-0.8， 加入 IPTG 至终浓度 0.5mM， 20诱导表达 18h。 0024 将诱导后的菌液于 4， 5,000rpm， 离心 5min， 收集菌体， 超声波破碎后 SDS-PAGE 检测， 发现重组蛋白 His6-SdCS 存在于可溶性的上清蛋白中 ( 图 3A)。Co2+离子亲和层析 (purification Kit， Clontech)纯化后的蛋白质用12SDS-PAGE分离鉴定， 在。

17、 分子量略大于 45kDa 的位置有一特异性的条带 ( 如图 3A)， 与通过氨基酸序列推测的 SdCS 的分子量大小 (47.8kDa) 基本一致 ； 另外， Western blot 结果显示， 也在略大于 45kDa 处有 一条特异性很强的条带， 说明纯化收集的蛋白质就是带有 His6-tag 的 SdCS( 图 3B)。柠檬 酸合酶基因在转基因植物中具有较高的应用价值， 可用于植物的基因改良。通过转入 SdCS 基因， 可提高农作物的产量以及对于一些胁迫环境的耐受力。 0025 SEQUENCE LISTING 0026 安徽师范大学 0027 一种链霉菌柠檬酸合酶基因及其编码蛋白 0。

18、028 1 0029 2 0030 PatentIn version 3.3 0031 1 0032 1290 0033 DNA 0034 淀粉酶链霉菌 (Streptomyces diastaticus) 0035 1 0036 gtgagcgaca actctgtagt actgcggtac gacggcagcg agtacaccta cccggtgatc 60 0037 gacagcaccg tcggtgacaa gggcttcgac atcgggaagc tccgcgccca gaccggtctg 120 0038 gtgacgctgg acagcggcta cggcaacacc gc。

19、cgcctaca aatccgcgat cacctatctc 180 0039 gacggcgagg ccggcatcct ccggtaccgc ggctacccga tcgagcagct ggccgagcgc 240 0040 tccaccttcc tggaggtcgc ctacctgctg atcaacggcg agctgccgac cgtcgaccag 300 0041 ctctccgcct tcaagggcga catcacgcag cacaccctgc tgcacgagga cgtcaagaac 360 说 明 书 CN 102061300 A CN 102061305 A4/5 页。

20、 6 0042 ttctaccggg gcttcccgcg cgacgcccac ccgatggcca tgctgtcctc ggtggtctcc 420 0043 gcgctgtcca cgttctacca ggacagccac aacccgttcg acgagcagca gcgcaacctc 480 0044 tccacgatcc gcctgctcgc caagctcccg actatcgcgg cctacgccta caagaagtcg 540 0045 gtcggccacc cgttcgtcta cccgcgcaac gacctcggct acgtcgagaa cttcctgcgc 6。

21、00 0046 atgaccttct ccgtcccggc gcaggagtac gacctcgacc cggtcgtcgt ctccgccctg 660 0047 gacaagctgc tgatcctgca cgcggaccac gagcagaact gctccacctc cacggtccgc 720 0048 ctggtcggct cctcgcaggc gaacatgttc gcctcgatct ccgccggcat caacgccctg 780 0049 tggggcccgc tccacggcgg cgccaaccag tcggtgctgg agatgctcga gggcatccgc 8。

22、40 0050 gacaacggcg gcgacgtcga cgccttcatc cgcaaggtga agaacaagga ggacggcgtc 900 0051 cgcctgatgg gcttcggcca ccgggtctac aagaacttcg acccgcgcgc caagatcatc 960 0052 aaggccgccg cgcacgacgt gctgtccgcc ctcggcaagt ccgacgagct gctggacatc 1020 0053 gcgctcaagc tggaggagca cgcgctctcc gacgactact tcgtctcgcg cagcctctac 。

23、1080 0054 ccgaacgtgg acttctacac cggtctgatc taccgggcca tgggcttccc gaccgagatg 1140 0055 ttcaccgttc tgttcgccct cggccgcctt ccgggctgga tcgcccagtg gcacgagatg 1200 0056 atcaaggagc cggggtcgcg gatcgggcgc ccgcggcaga tctacacggg tgtcgtcgag 1260 0057 cgggacttcg tgcccgtcga ggagcgctga 1290 0058 2 0059 429 0060 PRT。

24、 0061 淀粉酶链霉菌 (Streptomyces diastaticus) 0062 2 0063 Val Ser Asp Asn Ser Val Val Leu Arg Tyr Asp Gly Ser Glu Tyr Thr 0064 1 5 10 15 0065 Tyr Pro Val Ile Asp Ser Thr Val Gly Asp Lys Gly Phe Asp Ile Gly 0066 20 25 30 0067 Lys Leu Arg Ala Gln Thr Gly Leu Val Thr Leu Asp Ser Gly Tyr Gly 0068 35 40 45 006。

25、9 Asn Thr Ala Ala Tyr Lys Ser Ala Ile Thr Tyr Leu Asp Gly Glu Ala 0070 50 55 60 0071 Gly Ile Leu Arg Tyr Arg Gly Tyr Pro Ile Glu Gln Leu Ala Glu Arg 0072 65 70 75 80 0073 Ser Thr Phe Leu Glu Val Ala Tyr Leu Leu Ile Asn Gly Glu Leu Pro 0074 85 90 95 0075 Thr Val Asp Gln Leu Ser Ala Phe Lys Gly Asp Il。

26、e Thr Gln His Thr 0076 100 105 110 0077 Leu Leu His Glu Asp Val Lys Asn Phe Tyr Arg Gly Phe Pro Arg Asp 0078 115 120 125 0079 Ala His Pro Met Ala Met Leu Ser Ser Val Val Ser Ala Leu Ser Thr 0080 130 135 140 说 明 书 CN 102061300 A CN 102061305 A5/5 页 7 0081 Phe Tyr Gln Asp Ser His Asn Pro Phe Asp Glu G。

27、ln Gln Arg Asn Leu 0082 145 150 155 160 0083 Ser Thr Ile Arg Leu Leu Ala Lys Leu Pro Thr Ile Ala Ala Tyr Ala 0084 165 170 175 0085 Tyr Lys Lys Ser Val Gly His Pro Phe Val Tyr Pro Arg Asn Asp Leu 0086 180 185 190 0087 Gly Tyr Val Glu Asn Phe Leu Arg Met Thr Phe Ser Val Pro Ala Gln 0088 195 200 205 00。

28、89 Glu Tyr Asp Leu Asp Pro Val Val Val Ser Ala Leu His Lys Leu Leu 0090 210 215 220 0091 Ile Leu His Ala Asp His Glu Gln Asn Cys Ser Thr Ser Thr Val Arg 0092 225 230 235 240 0093 Leu Val Gly Ser Ser Gln Ala Asn Met Phe Ala Ser Ile Ser Ala Gly 0094 245 250 255 0095 Ile Asn Ala Leu Trp Gly Pro Leu His。

29、 Gly Gly Ala Asn Gln Ser Val 0096 260 265 270 0097 Leu Glu Met Leu Glu Gly Ile Arg Asp Asn Gly Gly Asp Val Asp Ala 0098 275 280 285 0099 Phe Ile Arg Lys Val Lys Asn Lys Glu Asp Gly Val Arg Leu Met Gly 0100 290 295 300 0101 Phe Gly His Arg Val Tyr Lys Asn Phe Asp Pro Arg Ala Lys Ile Ile 0102 305 310 。

30、315 320 0103 Lys Ala Ala Ala His Asp Val Leu Ser Ala Leu Gly Lys Ser Asp Glu 0104 325 330 335 0105 Leu Leu Asp Ile Ala Leu Lys Leu Glu Glu His Ala Leu Ser Asp Asp 0106 340 345 350 0107 Tyr Phe Val Ser Arg Ser Leu Tyr Pro Asn Val Asp Phe Tyr Thr Gly 0108 355 360 365 0109 Leu Ile Tyr Arg Ala Met Gly P。

31、he Pro Thr Glu Met Phe Thr Val Leu 0110 370 375 380 0111 Phe Ala Leu Gly Arg Leu Pro Gly Trp Ile Ala Gln Trp His Glu Met 0112 385 390 395 400 0113 Ile Lys Glu Pro Gly Ser Arg Ile Gly Arg Pro Arg Gln Ile Tyr Thr 0114 405 410 415 0115 Gly Val Val Glu Arg Asp Phe Val Pro Val Glu Glu Arg 0116 420 425 说 明 书 CN 102061300 A CN 102061305 A1/1 页 8 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102061300 A 。