酵母双杂交质粒的构建方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102061307 A (43)申请公布日 2011.05.18 CN 102061307 A *CN102061307A* (21)申请号 201010553950.9 (22)申请日 2010.11.23 C12N 15/81(2006.01) (71)申请人 上海交通大学 地址 200240 上海市闵行区东川路 800 号 (72)发明人 华修国 沈权 崔立 张文 (74)专利代理机构 上海交达专利事务所 31201 代理人 王锡麟 王桂忠 (54) 发明名称 酵母双杂交质粒的构建方法 (57) 摘要 一种生物工程技术领域的酵母双杂交质粒的 构建方法， 以戊型肝。

2、炎病毒基因组 RNA 为模板设 计引物并采用 RT-nPCR 方法扩增 ； 将扩增产物进 行双酶切， 将双酶切得到的如Seq ID No.1所示的 DNA 片段插入 pSOS 质粒得到重组载体 ； 制备酵母 感受态细胞， 在酵母感受态细胞中加入重组载体 以及肝 cDNA 文库质粒 DNA， 经培养后筛选阳性酵 母克隆 ； 提取阳性酵母克隆中的质粒并转入大肠 杆菌感受态细胞， 筛选文库质粒后得到酵母双杂 交质粒。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 CN 102061312 A1/1 页 2 1. 一种酵母双杂交。

3、质粒的构建方法， 其特征在于， 包括以下步骤 ： 步骤一， 以戊型肝炎病毒基因组 RNA 为模板设计引物并采用 RT-nPCR 方法扩增 ； 步骤二， 将步骤一所得扩增产物进行双酶切， 将双酶切得到的如 Seq ID No.1 所示的 DNA 片段插入 pSOS 质粒得到重组载体 ； 步骤三， 制备酵母感受态细胞， 在酵母感受态细胞中加入步骤二所得重组载体以及肝 cDNA 文库质粒 DNA， 经培养后筛选阳性酵母克隆 ； 步骤四， 提取阳性酵母克隆中的质粒并转入大肠杆菌感受态细胞， 筛选文库质粒后得 到酵母双杂交质粒。 2. 根据权利要求 1 所述的酵母双杂交质粒的构建方法， 其特征是， 所述。

4、的引物为 ： 上游引物 ： 5 -CAGGATCCCCGACAGAATTGATTTCGTC-3 ； 下游引物 ： 5 -CAGTCGACAGGGGCGAGGACACCAACG-3 。 3. 根据权利要求 1 所述的酵母双杂交质粒的构建方法， 其特征是， 所述的双酶切是指 ： BamH I 和 Sal I。 4. 根据权利要求 1 所述的酵母双杂交质粒的构建方法， 其特征是， 所述的肝 cDNA 文库 质粒 DNA 是指 ： 肝 cDNA 文库购自 Stratagene 公司， 扩增后提取质粒 DNA。 5. 根据权利要求 1 所述的酵母双杂交质粒的构建方法， 其特征是， 所述的培养是指 ： 在。

5、 22-25的室温下培养 5 天。 6. 根据权利要求 1 所述的酵母双杂交质粒的构建方法， 其特征是， 所述的筛选是指 ： 利 用温度和营养缺陷的方法将阳性克隆选出。 权 利 要 求 书 CN 102061307 A CN 102061312 A1/5 页 3 酵母双杂交质粒的构建方法 技术领域 0001 本发明涉及一种生物工程技术领域的方法， 具体是一种酵母双杂交质粒的构建方 法。 背景技术 0002 戊型肝炎 (HepatitisE， HE) 是由戊型肝炎病毒 (Hepatitis E Virus， HEV) 引 起的一种人和多种动物的人兽共患病， 一般经粪一口途径传播。人 HE 在发展。

6、中国家和地 区发病率达 80以上， 致死率为 1左右， 怀孕期为 6 8 月的孕妇， 其死亡率可达 20 (Balayan et al， 1983)。戊型肝炎病毒不但可以感染人类， 在其他动物中也广泛存和与 传播。人们相继在猪、 羊、 老鼠等动物中检测到戊肝病毒 (Clayson， et al， 1995 ； Lazizi， 1999 ； Usmanov， 1994)。HEV 是一个近似球形的二十面体颗粒， 形似杯状， 无包膜， 表面粗 糙， 有纤突， 平均直径为 27 34nm。根据病毒颗粒大小和形态以及表面特征曾将其归为杯 状病毒科 (Caliciviridae)， ICTV 第 8 次报。

7、告建议将 HEV 暂归为戊型肝炎病毒科 (family Hepeviridae)， 并为唯一的戊型肝炎病毒属 (genus Hepevirus) 成员。 0003 酵母双杂交系统 (yeast two-hybrid system) 是用于研究蛋白质之间相互作用 的一种崭新的、 有效的遗传学方法， 由 Field 和 Song 于 1989 年首创。该系统的建立基于 对真核生物调控转录起始过程的认识。参与这一过程的转录激活因子在结构上是组件 式的 (modular)， 往往由两个 ( 或两个以上 ) 相对独立的结构域组成， 即 DNA 结合结构域 (binding domain， BD) 和转录。

8、活化结构域 (activation domain， AD)。两个结构域建立空 间联系是转录激活的关键， 而单独作用无法激活转录过程。分别将拟研究的靶 (prey) 蛋白 基因与编码 AD 的序列结合， 诱饵 (bait) 蛋白基因与编码 BD 的序列结合， 形成两段融合基 因。当两段融合基因通过载体质粒转入同一酵母细胞表达时， 分别生成融合蛋白 prey-AD 与bait-BD。 借助诱饵蛋白与靶蛋白在核内的相互作用， 分离的AD与BD在空间上得以接近， 形成完整的有活性的转录因子， 进而与上游激活序列 (upstream activating sequence， UAS) 结合， 激活相应报。

9、告基因 (report gene) 转录。反之， 报告基因的表达与否， 可判断靶 蛋白与诱饵蛋白之间是否相互作用。通过简单的酵母遗传分析， 对报告基因进行检测， 即 可实现对蛋白间相互作用的分析。该系统自间世以来， 广泛地应用于研究蛋白 - 蛋白间的 相互作用、 蛋白与其它分子相互作用， 筛选未知蛋白， 研究蛋白的功能等领域。但是该系统 也有其致命缺陷 ： 融合蛋白必须转运至核内才能激活报告基因转录。对于那些有自激活作 用的不适用于双杂交筛选的诱饵蛋白， 以及大量的非核内蛋白质如细胞外分泌蛋白、 膜受 体蛋白等的研究， 该方法有很大的局限性。于是 Aronheim 等 (1997) 构建了 S。

10、os 蛋白招募 系统 (Sos Recruitment system)， 把蛋白质相互作用的场所从核内转移到了酵母的细胞膜 上， 通过应用2个蛋白相互作用后对Ras信号通路的恢复作用而取代传统的转录激活机制， 克服了传统双杂交系统的一些缺点。 0004 SOS 蛋白招募系统的基本原理如下 ： 在正常情况下， 当有生长信号刺激时， 酵母的 Ras 鸟苷酸交换因子 (Ras guanyl nucleotide exchange factor， RGEF)cdc25 会富集到细 说 明 书 CN 102061307 A CN 102061312 A2/5 页 4 胞膜上， 此时 cdc25 能够促使。

11、 Ras 蛋白的 GDP 与 GTP 的交换， 激活下游的信号， 使酵母细胞 生长。在酵母温度敏感缺陷株 cdc25H 中， cdc25 由于突变丧失了上述功能， 使得此菌株只 能在 25下生长， 而在限制温度 37无法生长。如人为地引入正常的 GEF(SOS 蛋白 )， 并 使得 GEF 与 Ras 蛋白足够接近， 则可弥补这一缺陷。将待测蛋白 X 与哺乳动物细胞的鸟苷 酸交换因子 (GEF)Sos 蛋白融合， 将 Y 蛋白与锚定于酵母细胞膜上的 Src 信号蛋白融合， 使 它们共表达于一个 cdc25H 基因敏感型突变的酵母菌株内。Y 被定位在细胞膜上， 蛋白 X 与 Y 发生相互作用使 。

12、SOS 因子作用于细胞膜上 Ras 蛋白， 激活了 Ras 途径， 从而细胞能在 37 生长。 0005 经对现有技术的文献检索发现， 张莉， 黄健在 海洋湖沼通报 2006 年第 1 期 酵母 双杂交系统的改进与研究进展 中提出， 传统的双杂交系统有着无法克服的的缺点 ： 不能适 用于所有蛋白。不少蛋白需要经过内质网等细胞器进行翻译后加工修饰才会有生物活性， 在传统的双杂交方法中， 这些蛋白经过修饰后可能会无法进入细胞核， 或者这些蛋白根本 就无法被翻译后修饰， 所以用传统的双杂交方法来研究这些蛋白的相互作用是不合适的。 而且， 有一些蛋白相互作用可能只存在于细胞质的环境中， 进入细胞核后，。

13、 这些相互作用可 能就不复存在了， 传统的双杂交方法同样不能用于这些蛋白。 发明内容 0006 本发明的目的在于克服现有技术的不足， 提供一种酵母双杂交质粒的构建方法， 将戊型肝炎病毒外壳蛋白基因亚克隆入诱饵载体中， 利用 Sos 蛋白招募系统筛选与戊型肝 炎病毒相互作用蛋白。克服了传统酵母双杂交技术的局限性， 为戊型肝炎病毒相互作用蛋 白包括受体的鉴定提供了新的途径。 0007 本发明通过以下技术方案实现， 本发明包括以下步骤 ： 0008 步骤一， 以戊型肝炎病毒基因组 RNA 为模板设计引物并采用 RT-nPCR 方法扩增 ； 0009 所述的引物具体为 ： 0010 上游引物 ： 5 。

14、-CAGGATCCCCGACAGAATTGATTTCGTC-3 ； 0011 下游引物 ： 5 -CAGTCGACAGGGGCGAGGACACCAACG-3 。 0012 步骤二， 将步骤一所得扩增产物进行双酶切， 将双酶切得到的如SEQ ID NO.1所示 的 DNA 片段插入 pSOS 质粒得到重组载体 ； 0013 步骤三， 制备酵母感受态细胞， 在酵母感受态细胞中加入步骤二所得重组载体以 及肝 cDNA 文库质粒 DNA， 经培养后筛选阳性酵母克隆 ； 0014 所述的肝 cDNA 文库质粒 DNA 是指 ： 肝 cDNA 文库购自 Stratagene 公司， 扩增后提 取质粒 DN。

15、A。 0015 所述的培养是指 ： 在 22-25的室温下培养 5 天。 0016 所述的筛选是指 ： 利用温度和营养缺陷的方法将阳性克隆选出。 0017 步骤四， 提取阳性酵母克隆中的质粒并转入大肠杆菌感受态细胞， 筛选文库质粒 后得到酵母双杂交质粒。 0018 本发明根据 Genbank 中注册的戊型肝炎病毒基因 4 型 ORF2aa492-606 序列设计引 物， 以戊型肝炎病毒基因组 RNA 为模板， 用 RT-nPCR 方法扩增， 并将 PCR 产物经双酶切， 插入 经双酶切处理的 pSOS 质粒载体中， 经酶切和测序鉴定， 构建了诱饵载体， 并用酵母双杂交 说 明 书 CN 102。

16、061307 A CN 102061312 A3/5 页 5 方法筛选肝细胞中与之相互作用的蛋白。 具体实施方式 0019 下面对本发明的实施例作详细说明， 本实施例在以本发明技术方案为前提下进行 实施， 给出了详细的实施方式和具体的操作过程， 但本发明的保护范围不限于下述的实施 例。 0020 以下实施例中所涉及的戊型肝炎病毒基因 4 型毒株均已记载于以下文献中 ： 0021 Shen Q， Zhang W， Cao X， Mou J， Cui L， Hua X. Cloning of full genome sequence of hepatitis E virus of Shanghai。

17、 swine isolate using RACE method J.Virol J.2007Oct 9 ； 4 ： 98Huang F， Zhang W， Gong G， Yuan C， Yan Y， Yang S， Cui L， Zhu J， Yang Z， Hua X.Experimental infection of Balb/c nude mice with Hepatitis E virus J.BMC Infect Dis.2009Jun 13 ； 9 ： 93.。 0022 以下实施例中所涉及的菌种 DH5a 购自天根生物公司 ； 0023 CytoTrapTM双杂交系统购自 。

18、Stratagene 公司， 其中包括酵母菌株 cdc25H， pSos、 pMyr 等载体 ； 0024 培养基等购自 BD clone tech 公司。 0025 步骤一， 引物的设计与合成是根据已知序列， 使用 Oligo 软件设计 ORF2aa492-606 引物， 游引物加上 BamH I 酶切位点， 下游引物加上 Sal I 酶切位点。 0026 引物序列为 ： 0027 Bait5S ： 5-CAggatccCCGACAGAATTGATTTCGTC-3(BamH I 酶切位点 ) ； 0028 Bait5X ： 5-CAgtcgacAGGGGCGAGGACACCAACG-3(Sa。

19、l I 酶切位点 )。 0029 步骤二， 戊型肝炎病毒目的片段的获得 0030 使用 Trizol 分离液 (Invitrogen) 提取 HEV 基因组 RNA， 按下列组成配制反转 录反应液合成第一链 cDNA ： MgCl22l， 10RT Buffer 1l， dNTP Mixture 1l， Rnase inhibitor 0.25l， AMV Reverse Transcriptase 0.5l， Bait5X primer 0.5l， RNA 4.75l， 总共 10l。 0031 按以下条件进行反转录 ： 30 10min， 42 30min， 99 5min， 5 5min。

20、。 0032 然 后 进 行 PCR 反 应，反 应 体 系 如 下 ： cNDA 5l， 10LA PCR Buffer II(Mg2+plus)5l，dNTP Mixture( 各 2.5mM)4l，Bait5S(20pmol/l)0.5l， Bait5X(20pmol/l)0.5l， TaKaRa LA Taq(5U/l)0.5l， 灭菌蒸馏水 34.5l， 总共 50l。反应条件 ： 94 3min， (94 30s， 55 30s， 72 5min)25cycle， 4 forever。 0033 PCR 结束后， PCR 产物经 l琼脂糖凝胶电泳鉴定。将 PCR 扩增产物纯化后双酶。

21、切 以备连接之用。 0034 步骤三， pSOS 载体的准备 0035 取0.5l pSOS质粒转化入100l感受态大肠杆菌DH5a细胞后， 提取pSOS质粒， 对其进行双酶切。 0036 步骤四， pSOS-bait5 质粒的构建 0037 按照基因片段载体片段31的量进行连接反应， pSOS(BamH I/Sal I)3l， bait5(BamH I/Sal I)9.5l， 10Ligase Buffer1.5l， T4DNA Ligase1l， 总共 15l， 说 明 书 CN 102061307 A CN 102061312 A4/5 页 6 16连接过夜 ； 然后取全部连接液转化入 。

22、200l 感受态细胞中， 提取质粒后分别采用酶切 法和测序法鉴定， 将双酶切鉴定为阳性的克隆送上海生工测序， 测序结果为目的片段。 0038 将含有 pSOS-bait5 质粒的甘油菌液接入 3ml 含 Amp-LB 培养基中， 37 250rpm 过 夜培养， 至 OD600约 0.6。将上述培养液加入 200ml 含 AmpLB 培养基中， 37剧烈震荡培养 5h ； 提取质粒。 0039 步骤五， 文库质粒的准备 0040 将文库菌液铺在 20 个 15cmLB-Camr培养皿中， 使每个板含有大约 20000 30000 克隆。37过夜培养。加入 6mlLB 培养基， 使用无菌玻棒将克。

23、隆轻轻刮起。两外加入 6mlLB 培养基， 将剩余克隆也刮起。将上述菌液都收集在两个无菌烧杯中， 一个中加入 0.2 体积的 80甘油， 混匀， 分装入 1.5mlEP 管中。另一个直接用于提取质粒 DNA。 0041 步骤六， 诱饵载体的自激活检验 0042 酵母感受态细胞制备 0043 从 -80取出 cdc25H 酵母细胞， 划线到 YPAD 平板上， 22 25培养直到克隆长 出。挑取单个克隆入含有 1mlYPAD 液体培养基的 1.5ml 离心管中， 剧烈震荡使克隆分散均 匀。 将上述菌液转入含有50mlYPAD液体培养基的250ml烧杯， 2225250rpm培养12 16h。测量。

24、 OD600， OD600必须 1， 如果小于 1 继续培养直到 OD600 1， 将上述培养液转入含有 300mlYPAD 液体培养基的 1L 烧杯中， 室温 250rpm 培养约 3h。测量 OD600， OD600必须 0.7。 取 75ul 培养基涂 YPAD 平板， 封口膜封口后于 37培养 4 6d， 长出 20 个酵母回复突变克 隆30个 ； 涂了number 1剩余转化液的150mm SD/glucose(-UL)平板没有克隆长出， 该酵 母可以用于接下来的实验。 0044 室温 1000g 离心 10min 收集酵母细胞， 弃上清。用 50ml 无菌水重悬沉淀， 室温 100。

25、0g离心10min。 弃上清后用50mlLiSORB重悬沉淀， 室温静置30min。 将400ml 20mg/ml的 鲑鱼精DNA于沸水中孵育10min， 之后加入600ml LiSORB， 颠倒混匀， 冷却至室温。 30min室 温静置结束后， 室温 1000g 离心 10min 沉淀细胞， 使用 300ul LiSORB 重悬沉淀。加入 600ul 准备好的鲑鱼精 DNA 混合物， 轻轻颠倒混匀。加入 5.4ml PEG/LiOAc 溶液和 530ulDMSO， 使 用枪头轻轻混匀。取 500ul 到一个 1.5mlEP 管中， 其余以 100ul 分装到其他 1.5mlEP 管中， 然后。

26、转化。结果显示该载体无自激活活性， 可以用与酵母双杂交筛选。 0045 步骤七， pSOS-bait5 与肝 cDNA 文库共转化 0046 在新鲜制备的 10ml 感受态酵母细胞 cdc25H 中加入 40ug pSOS-bait5 和 40ug 肝 cDNA 文库质粒 DNA， 另加入 200ul 1.4M - 巯基乙醇。在另外一个 500ul 感受态酵母 细胞 cdc25H 中加入 2ug pSOS 和 2ug 肝 cDNA 文库质粒 DNA， 作为阴性对照。将转化液处 理后， 涂板， 22 25倒置培养 48h， 将 SD/glucose(-UL) 培养板上的克隆通过滤纸影印到 SD/。

27、galactose(-UL) 培养板上， 于 37培养， 6 天后， 从板 SD/galactose(-UL) 上挑取克隆。 为了在相互作用实验前抑制 GAL1 启动子的活性， 将 SD/galactose(-UL) 板上的克隆挑到 SD/glucose(-UL) 培养板上， 于 22 25培养 48h。将挑过克隆的 SD/galactose(-UL) 板 重新于 37培养， 因为有些克隆可能会出现得晚一些。培养 48h 后， 将该板上克隆挑取到 2 个 SD/glucose(-UL) 和 1 个 SD/galactose(-UL) 板上， 将 1 个 SD/glucose(-UL) 和 1 。

28、个 SD/ galactose(-UL) 板置于 37培养约 48h， 另一个 SD/glucose(-UL) 板置于 22 25。培 养 48h 后， 评鉴结果。37在 SD/galactose(-UL) 长出克隆， 而 SD/glucose(-UL) 没有长出 说 明 书 CN 102061307 A CN 102061312 A5/5 页 7 克隆的即为有相互作用 ( 阳性克隆 )。通过两轮双杂交筛选， 共筛到 3 个阳性酵母克隆。 0047 步骤八， 阳性酵母克隆中的肝脏 cDNA 质粒提取与测序 0048 挑取阳性酵母克隆入 5ml SD/glucose(-UL) 中， 22 25、。

29、 250rpm 震荡培养约 3d(OD600 1.0)， 然后提取酵母质粒。取上述阳性酵母质粒 10ul 转化入 100ul 感受态细胞 DH5， 涂Camr抗性LB平板筛选文库质粒。 每个板上挑取2个克隆， 提取质粒后送上海生工 测序， 测序结果显示， 它们为重复克隆。 测序后GenBank blast显示该序列与Homo sapiens cytochromeP450， family2， subfamily C， polypeptide 8(CYP2C8)， transcript variant Hp1-1， 同源性达到 93以上。 0049 采用本方法筛选到阳性克隆1个为CYP2C8蛋白基因， 为戊型肝炎病毒相互作用蛋 白的研究提供了基础 ； 本结果没有假阳性结果产生， 提高了筛选的效率， 简化了实验步骤。 说 明 书 CN 102061307 A 。