猪脂肪细胞受盐酸克伦特洛刺激引发表达下调的EST序列.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 102051359 B (45)授权公告日 2013.07.31 CN 102051359 B *CN102051359B* (21)申请号 201010266988.8 (22)申请日 2010.08.31 C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) (73)专利权人 李宁 地址 100193 北京市海淀区圆明园西路 2 号 (72)发明人 李宁 张瑾 位治国 赵要风 (74)专利代理机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 代理人 王加岭 张庆敏 曹向英 等 . 浅谈盐酸克伦特罗检测技 术 .畜牧兽医科技信息 .2009,。

2、19 20. 吴兆良 . 猪肉瘦肉精检测方法的比较与运 用 .肉类工业 .2009,44 45. (54) 发明名称 猪脂肪细胞受盐酸克伦特洛刺激引发表达下 调的 EST 序列 (57) 摘要 本发明提供了猪脂肪细胞受盐酸克伦特洛刺 激引发表达下调的EST序列， 其具有Seq ID No.1 所示的核苷酸序列。利用该序列设计引物， 通过 定量 PCR 扩增得到饲喂普通饲料的正常猪体内 rpfat_15529基因的表达水平， 再通过定量PCR技 术检测样品猪体内该基因的表达情况， 从而确定 样品猪中是否残留有 CLB-HCL。另外， 本发明对于 前期饲喂 CLB-HCL 的猪中 CLB-HCL 。

3、的检测具有显 著的效果。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 李岚 权利要求书 1 页 说明书 3 页 序列表 2 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书3页 序列表2页 附图1页 (10)授权公告号 CN 102051359 B CN 102051359 B *CN102051359B* 1/1 页 2 1. 猪脂肪细胞受盐酸克伦特洛刺激引发表达下调的 EST 序列， 其特征在于， 其核苷酸 序列如 Seq ID No.1 所示。 2. 检 测 权 利 要 求 1 所 述 序 列 的 引 物，其 特 征 在 于，其 包 。

4、括 上 游 引 物 5 -CTTAACATTATTCTCAGAGCTGCG-3 和下游引物 5 -GTGGTAGAGAGCTGGATCACTAAG-3 。 3. 权利要求 1 所述序列在检测猪肉中残留的盐酸克伦特洛中的应用。 4. 如权利要求 3 所述的应用， 其特征在于， 具体方法包括 ： 1） 从普通饲料饲养的正常猪的组织中提取总 RNA， 利用 RT-PCR 技术合成 cDNA ； 2）设 计 引 物， 包 括 上 游 引 物 5 -CTTAACATTATTCTCAGAGCTGCG-3和 下 游 引 物 5 -GTGGTAGAGAGCTGGATCACTAAG-3 ， 通过荧光实时定量 P。

5、CR 技术得到正常猪的扩增曲线 ； 3） 从样品猪的组织中提取总 RNA， 利用 RT-PCR 技术合成 cDNA ； 4） 使用与步骤 2） 相同的引物进行荧光实时定量 PCR， 将得到的扩增曲线与步骤 2） 中得 到正常猪的扩增曲线做对照， 根据基因表达情况检测样品猪中是否有盐酸克伦特洛残留。 权 利 要 求 书 CN 102051359 B 2 1/3 页 3 猪脂肪细胞受盐酸克伦特洛刺激引发表达下调的 EST 序列 技术领域 0001 本发明属于食品检验领域， 具体地说， 涉及利用猪脂肪细胞受盐酸克伦特洛刺激 引发表达下调的 EST 序列检测猪肉中残留的盐酸克伦特洛。 背景技术 000。

6、2 药物盐酸克伦特洛 (Clenbuterol-HCL， CLB-HCL)， 俗称 “瘦肉精” ， 是一种 - 肾上 腺素受体激动剂 (beta-Adrenergic agonists)， 不仅可以提高畜禽的生长速度， 降低料肉 比， 还可以显著减少脂肪蓄积， 提高胴体瘦肉率。但是 CLB-HCL 在动物体内存在广泛的积累 性残留， 对食用者的安全造成潜在的危害， 急性中毒事件屡有发生。到目前为止， 没有任何 国家允许CLB-HCL作为生长促进剂用于食品动物的生产之中， 欧盟、 美国FDA及我国政府都 制定了严格的残留标准。但是由于 CLB-HCL 对动物生长的促进作用和降低胴体脂肪积蓄是 异。

7、常显著的， 出于经济效益的考虑， 少数养殖户在饲养肉猪的时候， 过分依赖 CLB-HCL， 结果 导致问题猪肉上市危害群众健康。 0003 目前主要利用抗体杂交技术检测猪肉中 CLB-HCL 的残留， 但能够检测到的一般都 是问题比较严重的猪肉， 而对于前期饲喂 CLB-HCL 的猪却很难检测出 CLB-HCL 的痕迹。通 过对饲喂 CLB-HCL 的猪和普通饲料饲养的猪的研究表明， 饲喂 CLB-HCL 可引起猪体内一些 关键基因的表达变化。 0004 表达序列标签(expressed sequence tags， ESTs)是指从不同组织来源的cDNA序 列， 这一概念首次由 Adams 。

8、等于 1991 年提出。近年来由此形成的技术路线被广泛应用于基 因识别、 绘制基因表达图谱、 寻找新基因等研究领域， 并且取得了显著成效。在通过 mRNA 差 异显示、 代表性差异分析等方法获得未知基因的 cDNA 部分序列后， 研究者都迫切希望克隆 到其全长 cDNA 序列， 以便对该基因的功能进行研究。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一种受到盐酸克伦特洛 (Clenbuterol-HCL， CLB-HCL) 刺激 引发表达下调的表达序列标签 (expressed sequence tags， ESTs)(rpfat_15529)。该序列 可以用于检测猪脂肪细胞是否受到盐酸克伦特洛的。

9、刺激， 从而检测猪肉中是否存在残留的 盐酸克伦特洛。 0006 为了实现本发明目的， 本发明提供猪脂肪细胞受盐酸克伦特洛刺激引发表达下调 的 EST 序列， 其具有 Seq ID No.1 所示的核苷酸序列。 0007 本 发 明 还 提 供 检 测 上 述 序 列 的 引 物，其 包 括 上 游 引 物 5 -CTTAACATTATTCTCAGAGCTGCG-3 和下游引物 5 -GTGGTAGAGAGCTGGATCACTAAG-3 。 0008 本发明进一步提供上述 EST 序列在检测猪肉中残留的盐酸克伦特洛中的应用。具 体方法包括 ： 0009 1) 从普通饲料饲养的正常猪的组织中提取总。

10、 RNA， 利用 RT-PCR 技术合成 cDNA ； 0010 2) 设计引物， 包括上游引物 5 -CTTAACATTATTCTCAGAGCTGCG-3和下游引物 说 明 书 CN 102051359 B 3 2/3 页 4 5 -GTGGTAGAGAGCTGGATCACTAAG-3 ， 通过荧光实时定量 PCR 技术得到正常猪的扩增曲线 ； 0011 3) 从样品猪的组织中提取总 RNA， 利用 RT-PCR 技术合成 cDNA ； 0012 4)使用与步骤2)相同的引物进行荧光实时定量PCR， 将得到的扩增曲线与步骤2) 中得到正常猪的扩增曲线做对照， 根据基因表达情况检测样品猪中是否。

11、有盐酸克伦特洛残 留。 0013 本发明首次提供了猪脂肪细胞受盐酸克伦特洛刺激引发表达下调的 EST 序列， 利用该序列设计引物， 通过定量 PCR 扩增得到正常猪体内 rpfat_15529 基因的表达水平， 再通过定量 PCR 技术检测样品猪体内该基因的表达情况， 从而确定样品猪中是否残留有 CLB-HCL。另外， 本发明对于前期饲喂 CLB-HCL 的猪中 CLB-HCL 的检测具有显著的效果。 附图说明 0014 图 1 为本发明实验组与对照组猪肉中 rpfat_15529 基因的表达差异 ( 定量 PCR 结 果 )。 具体实施方式 0015 以下实施例用于说明本发明， 但不用来限制。

12、本发明的范围。 0016 实施例 0017 一 . 总 RNA 的提取 0018 1、 取新鲜或 -70冻存的猪肉样品， 每 30 50mg 猪肉样品加入 1mlTRIzon， 匀浆 仪进行匀浆处理。样品体积一般不要超过 TRIzon 体积的 10。 0019 2. 将上述样品在 15 30放置 5 分钟， 使得核酸蛋白复合物完全分离。 0020 3.4， 12,000rpm 离心 10 分钟， 取上清。 0021 4. 向上清中加入氯仿， 每使用 1ml TRIzon 加入 0.2ml 氯仿， 盖好管盖， 剧烈振荡 15 秒， 室温放置 3 分钟。 0022 5.4， 12,000rpm 离。

13、心 10 15 分钟， 此时溶液分三层 ： 黄色的有机相， 中间层和 上层无色的水相， RNA 主要存在水相中， 把水相 ( 约 500l) 转移到一个新的无 Rnase 的离 心管中。 0023 6. 向得到的水相溶液中加入等体积的异丙醇， 混匀， 室温放置 20 30 分钟。 0024 7.4， 12,000rpm 离心 10 分钟， 弃上清。 0025 8. 用 75v/v乙醇 ( 无 RNase) 洗涤沉淀。每使用 1ml TRIzon 用 1ml 75v/v乙 醇对沉淀进行洗涤。 0026 9.4， 5,000rpm 离心 3 分钟。用枪头小心吸出上层液体， 保留沉淀。 0027 1。

14、0. 室温放置 2 3 分钟， 晾干， 加入 30 100l 无 RNase 的水， 充分溶解 RNA 后， 置于 -70保存。 0028 二 .cDNA 第一链的合成 0029 1. 在 PCR 管中依次加入 0030 Oligo(dT)18 2l 0031 10mM dNTP 2l 0032 RNA 4l( 约 3g) 说 明 书 CN 102051359 B 4 3/3 页 5 0033 DEPC 水 16l 0034 2. 于 70变性 5min， 迅速置于冰上， 静置 1min。 0035 3. 向上述 PCR 管中依次加入 0036 Superscript II 2l 0037 5。

15、 第一链合成缓冲液 8l 0038 RNasin 2l 0039 0.1M DTT 4l 0040 4. 混匀后， 稍微离心。 0041 5.42， 反应 50min。 0042 6.72， 反应 15min。 0043 7. 产物直接用于 PCR 反应或者置于 -20保存。 0044 三 . 引物合成 0045 通过生物软件设计引物， 包括上游引物 5 -CTTAACATTATTCTCAGAGCTGCG-3 和下游 引物 5 -GTGGTAGAGAGCTGGATCACTAAG-3 。 0046 四 . 利用定量 PCR 技术检测 rpfat_15529 的表达情况 0047 参照美国 ABI。

16、 公司定量 PCR Mix 试剂盒说明书操作。 0048 1. 标准曲线的制定 0049 以 GAPDH 作为内标基因绘制标准曲线。 0050 2. 按照下列反应体系在 96 孔板上加样 0051 SYBR Green Mix 7.5l 0052 上游引物 (10M) 0.3l 0053 下游引物 (10M) 0.3l 0054 cDNA 1.0l 0055 ddH2O 5.9l 0056 3. 采用 ABI7900HT 荧光实时定量 PCR 仪， 按下列条件进行反应 ： 55 5min ； 95 10min ； 95 15s， 60 1min， 40 个循环。 0057 4. 最后在 ABI。

17、7900HT 荧光实时定量 PCR 仪上 95 15s， 60 15s， 再次 95 15s 作熔解曲线， 每个样品、 阴性对照 ( 以水为模板 ) 及标准曲线各做 3 个重复。 0058 5.对实验结果进行统计分析， 如果实验样品猪(饲喂CLB-HCL)和对照样品猪(普 通饲料饲喂 ) 中该基因的表达量下调达 2 倍以上， 则表明该猪饲喂了 CLB-HCL。 0059 结果分析 ： 对 72 头实验组猪 ( 普通饲料中添加 25ppm CLB-HCL， 1 月龄猪， 连续饲 喂 3 个月 ) 和 18 头对照组猪 ( 普通饲料饲喂， 1 月龄猪， 连续饲喂 3 个月 ) 的研究结果表 明， 。

18、rpfat_15529 在实验组猪中的表达明显下调。平均下调倍数为 2.4 倍。 0060 虽然， 上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述， 但在 本发明基础上， 可以对之作一些修改或改进， 这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此， 在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进， 均属于本发明要求保护的范围。 说 明 书 CN 102051359 B 5 1/2 页 6 0001 0002 序 列 表 CN 102051359 B 6 2/2 页 7 序 列 表 CN 102051359 B 7 1/1 页 8 图 1 说 明 书 附 图 CN 102051359 B 8 。