一种促进脂肪酶催化猪油甲醇解的方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102051387 A (43)申请公布日 2011.05.11 CN 102051387 A *CN102051387A* (21)申请号 201010531729.3 (22)申请日 2010.10.28 C12P 7/62(2006.01) (71)申请人 大连工业大学 地址 116034 辽宁省大连市甘井子区轻工苑 1 号 (72)发明人 孙玉梅 张瑶瑶 曹方 (74)专利代理机构 大连东方专利代理有限责任 公司 21212 代理人 胡景波 (54) 发明名称 一种促进脂肪酶催化猪油甲醇解的方法 (57) 摘要 一种促进脂肪酶催化猪油甲醇解生成脂肪酸 甲酯的方。

2、法。采用能改变脂肪酶分子构象以及含 水量的以液态烷烃和磷酸缓冲液构成的反应介质 或以液态烷烃、 磷酸缓冲液和甘油构成的反应介 质， 在其中进行脂肪酶催化猪油甲醇解的反应 ； 所述的液态烷烃选取 C6液态烷烃， 所述的磷酸缓 冲液为pH接近中性的磷酸缓冲液。 所构成的反应 介质可用于脂肪酶催化猪油甲醇解， 猪油甲醇解 的转化率为不加介质的对照体系的1.24.8倍。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 1 页 CN 102051393 A1/1 页 2 1. 促进脂肪酶催化猪油甲醇解生成脂肪酸甲酯的方法， 其。

3、特征在于包括如下步骤 ： a、 脂肪酶液制备 ： 按 1g 6mL 的比例将脂肪酶加入 pH7.0、 0.05mol/LK2HPO4-KH2PO4的 磷酸缓冲液 ； b、 脂肪酶液存放 ： 于 4放置 24h ； c、 反应介质制备 ： 反应介质的制备采用下述或的方法 ； 按体积比为液态烷烃磷酸缓冲液 100 50 75， 在液态烷烃中加入磷酸缓冲 液， 搅拌混匀 ； 或者按体积比为液态烷烃磷酸缓冲液甘油10050755， 在液态烷烃中 加入磷酸缓冲液和甘油， 搅拌混匀 ； 在或中， 所述液态烷烃为 C6液态烷烃， 所述磷酸缓冲液为 pH 接近中性的磷酸缓冲 液 ； d、 猪油甲醇解 ： 将猪。

4、油、 甲醇和脂肪酶液按质量比为 1 3.7410-5 3.4710-4进 行混合， 加入占整个反应体系40vt70vt的反应介质， 密封后， 于38、 160rmp振荡反 应 ； 分别在反应 8h 和 16h 时再各加一次甲醇， 每次甲醇的加入量同样按照猪油和甲醇质量 比为 1 3.7410-5加入， 共反应 24h 结束反应。 2. 根据权利要求 1 所述促进脂肪酶催化猪油甲醇解生成脂肪酸甲酯的方法， 其特征在 于步骤 c 的反应介质制备中所述的液态烷烃为 C6液态直链烷烃或环烷烃， 所述的 pH 接近 中性的磷酸缓冲液为 pH6.8 或 pH7.0 的磷酸盐缓冲液。 3. 根据权利要求 1。

5、 或 2 所述促进脂肪酶催化猪油甲醇解生成脂肪酸甲酯的方法， 其特 征在于步骤 c 的反应介质制备中所述的 C6液态直链烷烃或环烷烃为正己烷或环己烷 ； 所述 的 pH6.8 或 pH7.0 的磷酸盐缓冲液为 30 70mmol/L 的磷酸盐缓冲液。 4. 根据权利要求 1 或 2 所述促进脂肪酶催化猪油甲醇解生成脂肪酸甲酯的方法， 其特 征在于所述的脂肪酶为深圳绿微康生物工程有限公司生产的产品名称为 LVK-F100 的脂肪 酶。 权 利 要 求 书 CN 102051387 A CN 102051393 A1/4 页 3 一种促进脂肪酶催化猪油甲醇解的方法 技术领域 0001 本发明属于酶。

6、化学领域， 涉及通过反应介质提高脂肪酶活性， 同时促进脂肪酶催 化猪油甲醇解的技术。 背景技术 0002 脂肪酶即三酰基甘油酰基水解酶， 以脂肪酶催化动植物油脂转酯化制备生物柴 油， 反应条件温和、 醇用量少、 甘油易回收、 无废物， 可以解决目前化学法生产生物柴油存在 的分离难、 耗能多等问题。 0003 脂肪酶是一种油水界面激活酶， 介质对酶促反应的影响极其重要。有人曾研究微 水环境、 叔丁醇、 正己烷、 石油醚以及缓冲液离子浓度等对酵母来源的脂肪酶催化甘油三酯 甲醇解或水解的影响 1-4。通过有机溶剂为反应介质， 改变脂肪酶分子的构象 4、 促进 酶与底物的结合， 改善酶的催化性能， 进。

7、而提高脂肪酶的经济性和实用性。 0004 参考文献 0005 1Jeong，G.T.Park D.H.Lipase-Catalyzed Transesterification of rapeseedoil for biodiesel production with tert-butanol，Appl Biochem Biotechnol， 2008， 148 ： 131-139 0006 2Nelson， L.A.Foglia， T.A.Marmer， W.N.Lipase-catalyzed production ofbiodieselJ.Am.Oil.Chem.Soc.， 1996， 73。

8、 ： 1191-1195 0007 3Lu， J.Chen， Y.W.Wang， F.Tan T.W.Effect of water on methanolysis ofglycerol trioleate catalyzed by immobilized lipase Candida sp.99-125 inorganic solvent systemJ.J Molecular Catalysis B ： Enzymatic， 2009， 56 ： 122-125 0008 4 王丹， 宋少芳， 刘爱荣， 于专妮， 黄锡荣， 李越中， 曲音波， 油包水微乳液介质中 脂肪酶催化 - 单硬脂酸甘。

9、油酯水解反应活性研究 . 山东大学学报 ( 理学版 )2002， 37 ： 527-531 发明内容 0009 本发明的目的旨在提高脂肪酶在猪油甲醇解反应体系中的活性， 进而促进脂肪酶 催化猪油甲醇解生成脂肪酸甲酯。 0010 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是 ： 提供一种促进脂肪酶催化猪油甲醇 解的方法， 通过采用液态烷烃、 甘油和磷酸缓冲液的混合液为反应介质， 提高脂肪酶在猪油 甲醇解反应体系中的催化活性。在猪油和甲醇的混合液中， 加入脂肪酶液和一定量的反应 介质， 控制适当的温度和搅拌转速， 即可实现猪油的甲醇解反应。其方法包括如下步骤 ： 0011 a、脂 肪 酶 液 制 备 ：。

10、 按 1g 6mL 的 比 例 将 脂 肪 酶 加 入 pH7.0、 0.05mol/ LK2HPO4-KH2PO4的磷酸缓冲液 ； 0012 b、 脂肪酶液存放 ： 于 4放置 24h ； 0013 c、 反应介质制备 ： 反应介质的制备采用下述或的方法 ； 说 明 书 CN 102051387 A CN 102051393 A2/4 页 4 0014 按体积比为液态烷烃磷酸缓冲液1005075， 在液态烷烃中加入磷酸缓 冲液， 搅拌混匀 ； 0015 或者按体积比为液态烷烃 ： 磷酸缓冲液甘油 100 50 75 5， 在液态烷 烃中加入磷酸缓冲液和甘油， 搅拌混匀 ； 0016 在或中，。

11、 所述液态烷烃为 C6液态烷烃， 所述磷酸缓冲液为 pH 接近中性的磷酸 缓冲液 ； 0017 d、 将猪油、 甲醇和脂肪酶液按质量比为 1 3.7410-5 3.4710-4进行混 合， 加入占整个反应体系 40vt 70vt的反应介质， 密封后， 于 38、 160rmp 振荡反 应 ； 分别在反应 8h 和 16h 时再各加一次甲醇， 每次甲醇的加入量为猪油和甲醇质量比为 1 3.7410-5， 共反应 24h 结束反应。 0018 优选的， 步骤 c 的反应介质制备中所述的液态烷烃为 C6液态直链烷烃或环烷烃， 所述的 pH 接近中性的磷酸缓冲液为 pH6.8 或 pH7.0 的磷酸盐。

12、缓冲液。 0019 更优选的， 步骤 c 的反应介质制备中所述的 C6液态直链烷烃或环烷烃为正己烷或 环己烷 ； 所述的 pH6.8 或 pH7.0 的磷酸盐缓冲液为 30 70mmol/L 的磷酸盐缓冲液。 0020 本发明的有益效果在于采用本发明所述的方法， 通过使用由有机溶剂中加入甘油 和缓冲液构成的反应介质， 即可提高脂肪酶在猪油甲醇解反应体系中的活性， 进而促进脂 肪酶催化猪油甲醇解生成脂肪酸甲酯。猪油甲醇解的转化率为对照的 1.2 4.8 倍 ( 以不 加相应介质的体系为对照 )， 改善了脂肪酶的使用性能。 0021 与现有技术相比较， 本方法的突出优点为 ： 操作简单， 能有效提。

13、高脂肪酶对猪油甲 醇解的催化活性， 具有推广利用价值。 0022 以下结合实施例和说明书附图对本发明作进一步说明。 附图说明 0023 图 1 为应用反应介质促进脂肪酶催化猪油甲醇解生成脂肪酸甲酯的工艺流程示 意图。 具体实施方式 0024 实施例 1 0025 a、 脂 肪 酶 液 制 备 ： 按 1g 6mL 的 比 例 将 脂 肪 酶 加 入 pH7.0、 0.05mol/L K2HPO4-KH2PO4的磷酸缓冲液 ； 所述的脂肪酶为深圳绿微康生物工程有限公司生产的产品名 称为 LVK-F100 的脂肪酶。 0026 b、 脂肪酶液存放 ： 于 4放置 24h ； 0027 c、 反应介。

14、质制备 ： 在正己烷或环己烷中加入 0.5 倍正己烷或环己烷体积的 50mmol/L、 pH6.8 的磷酸盐缓冲液， 搅拌混匀 ； 0028 d、 猪油甲醇解 ： 将猪油、 甲醇和脂肪酶液按质量比为13.7410-53.4710-4 进行混合， 加入占整个反应体系 40vt的反应介质， 密封后， 于 38、 160rmp 振荡反应。分 别在反应 8h 和 16h 时再各加入按猪油和甲醇质量比为 1 3.7410-5的甲醇一次， 共反应 24h 结束反应。 0029 甲醇解转化率测定 ： 将反应物倒入分液漏斗静置至分层， 分离出下层液体， 并洗涤 说 明 书 CN 102051387 A CN 。

15、102051393 A3/4 页 5 上层液体 3 次， 把直接分层和洗涤分层的下层液体混合均匀， 测定甲醇解转化率。 0030 以不添加正己烷和环己烷、 仅加磷酸缓冲液的体系为对照， 猪油甲醇解的转化率 为对照的 1.5 倍以上。 0031 以不加磷酸缓冲液、 仅加正己烷或环己烷的体系为对照， 猪油甲醇解的转化率为 对照的 4.4 倍以上。 0032 实施例 2 0033 a、 脂 肪 酶 液 制 备 ： 按 1g 6mL 的 比 例 将 脂 肪 酶 加 入 pH7.0、 0.05mol/L K2HPO4-KH2PO4的磷酸缓冲液 ； 所述的脂肪酶为深圳绿微康生物工程有限公司生产的产品名 称。

16、为 LVK-F100 的脂肪酶。 0034 b、 脂肪酶液存放 ： 于 4放置 24h ； 0035 c、 反应介质制备 ： 在正己烷中加入 0.75 倍正己烷体积的 50mmol/L、 pH6.8 的磷酸 盐缓冲液， 搅拌混匀 ； 0036 d、 猪油甲醇解 ： 将猪油、 甲醇和脂肪酶液按质量比为13.7410-53.4710-4 进行混合， 加入占整个反应体系 70vt的反应介质， 密封后， 于 38、 160rmp 振荡反应。分 别在反应 8h 和 16h 时再各加入按猪油和甲醇质量比为 1 3.7410-5的甲醇一次， 共反应 24h 结束反应。 0037 甲醇解转化率测定 ： 将反应。

17、物倒入分液漏斗静置至分层， 分离出下层液体， 并洗涤 上层液体 3 次， 把直接分层和洗涤分层的下层液体混合均匀， 测定甲醇解转化率。 0038 以不加磷酸缓冲液、 仅加正己烷的体系为对照， 猪油甲醇解的转化率为对照的 4.6 倍以上。 0039 实施例 3 0040 a、 脂 肪 酶 液 制 备 ： 按 1g 6mL 的 比 例 将 脂 肪 酶 加 入 pH7.0、 0.05mol/L K2HPO4-KH2PO4的磷酸缓冲液 ； 所述的脂肪酶为深圳绿微康生物工程有限公司生产的产品名 称为 LVK-F100 的脂肪酶。 0041 b、 脂肪酶液存放 ： 于 4放置 24h ； 0042 c、 。

18、反应介质制备 ： 在正己烷中加入0.5倍正己烷体积30mmol/L、 pH7.0的磷酸盐缓 冲液， 搅拌混匀。 0043 d、 猪油甲醇解 ： 将猪油、 甲醇和脂肪酶液按质量比为13.7410-53.4710-4 进行混合， 加入占整个反应体系 60vt的反应介质， 密封后， 于 38、 160rmp 振荡反应。分 别在反应 8h 和 16h 时再各加入按猪油和甲醇质量比为 1 3.7410-5的甲醇一次， 共反应 24h 结束反应。 0044 甲醇解转化率测定 ： 将反应物倒入分液漏斗静置至分层， 分离出下层液体， 并洗涤 上层液体 3 次， 把直接分层和洗涤分层的下层液体混合均匀， 测定甲。

19、醇解转化率。 0045 以不加正己烷和环己烷、 仅加磷酸缓冲液的体系为对照， 猪油甲醇解的转化率为 对照的 1.2 倍。 0046 以不加磷酸缓冲液、 仅加正己烷的体系为对照， 猪油甲醇解的转化率为对照的 4.8 倍。 以不加磷酸缓冲液、 仅加正己烷和去离子水的体系为对照， 猪油甲醇解的转化率为对照 的 3.7 倍。 0047 实施例 4 说 明 书 CN 102051387 A CN 102051393 A4/4 页 6 0048 a、 脂 肪 酶 液 制 备 ： 按 1g 6mL 的 比 例 将 脂 肪 酶 加 入 pH7.0、 0.05mol/L K2HPO4-KH2PO4的磷酸缓冲液 。

20、； 所述的脂肪酶为深圳绿微康生物工程有限公司生产的产品名 称为 LVK-F100 的脂肪酶。 0049 b、 脂肪酶液存放 ： 于 4放置 24h ； 0050 c、 反应介质制备 ： 在正己烷中加入0.5倍正己烷体积70mmol/L、 pH7.0的磷酸盐缓 冲液， 搅拌混匀。 0051 d、 猪油甲醇解 ： 将猪油、 甲醇和脂肪酶液按质量比为13.7410-53.4710-4 进行混合， 加入占整个反应体系 60vt的反应介质， 密封后， 于 38、 160rmp 振荡反应。分 别在反应 8h 和 16h 时再各加入按猪油和甲醇质量比为 1 3.7410-5的甲醇一次， 共反应 24h 结束。

21、反应。 0052 甲醇解转化率测定 ： 将反应物倒入分液漏斗静置至分层， 分离出下层液体， 并洗涤 上层液体 3 次， 把直接分层和洗涤分层的下层液体混合均匀， 测定甲醇解转化率。 0053 以不加磷酸缓冲液、 仅加正己烷和去离子水的体系为对照， 猪油甲醇解的转化率 为对照的 2.2 倍。 0054 实施例 5 0055 a、 脂 肪 酶 液 制 备 ： 按 1g 6mL 的 比 例 将 脂 肪 酶 加 入 pH7.0、 0.05mol/L K2HPO4-KH2PO4的磷酸缓冲液 ； 脂肪酶为深圳绿微康生物工程有限公司生产的产品名称为 LVK-F100 的脂肪酶。 0056 b、 脂肪酶液存放。

22、 ： 于 4放置 24h ； 0057 c、 反应介质制备 ： 按体积比为液态烷烃磷酸缓冲液甘油 100 50 75 5， 在液态烷烃中加入 70mmol/L、 pH6.8 的磷酸盐缓冲液和甘油， 搅拌混匀。 0058 d、 猪油甲醇解 ： 将猪油、 甲醇和脂肪酶液按质量比为13.7410-53.4710-4 进行混合， 加入占整个反应体系 60vt的反应介质， 密封后， 于 38、 160rmp 振荡反应。分 别在反应 8h 和 16h 时再各加入按猪油和甲醇质量比为 1 3.7410-5的甲醇一次， 共反应 24h 结束反应。 0059 e、 甲醇解转化率测定 ： 将反应物倒入分液漏斗静置至分层， 分离出下层液体， 并洗 涤上层液体 3 次， 把直接分层和洗涤分层的下层液体混合均匀， 测定甲醇解转化率。 0060 以不加甘油、 仅加正己烷或环己烷和磷酸缓冲液的体系为对照， 猪油甲醇解的转 化率为对照的 1.4 倍以上。 说 明 书 CN 102051387 A CN 102051393 A1/1 页 7 图 1 说 明 书 附 图 CN 102051387 A 。