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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201611147851.4 (22)申请日 2016.12.13 (71)申请人 昆药集团股份有限公司 地址 650106 云南省昆明市高新技术产业 开发区科医路166号 (72)发明人 宋立明黄照昌曾涛刘一丹 李鹏辉 (74)专利代理机构 北京集佳知识产权代理有限 公司 11227 代理人 赵青朵 (51)Int.Cl. C07D 493/20(2006.01) A61P 37/06(2006.01) A61P 29/00(2006.01) A61P 19/02(2006.0。
2、1) A61P 17/06(2006.01) (54)发明名称 青蒿琥酯衍生物、 其制备方法及其应用 (57)摘要 本发明提供了一种式(I)所示的化合物、 其 制备方法及其应用。 本发明提供的化合物为青蒿 琥酯衍生物， 对DTH小鼠耳肿胀度和脾指数的影 响与基质对照组相比， 透皮给药的式(I)所示的 化合物显著抑制DTH小鼠耳肿胀， 降低脾指数， 差 异有显著性意义， 提示实验条件下式(I)所示的 化合物显示出一定的免疫抑制效应， 能够有效下 调机体的细胞免疫应答， 且效果优于青蒿琥酯。 权利要求书1页 说明书5页 附图1页 CN 106588950 A 2017.04.26 CN 10658。
3、8950 A 1.式(I)所示的化合物： 2.式(I)所示的化合物的制备方法， 包括： 青蒿琥酯与精氨酸发生酰胺化反应， 得到(I)所示的化合物： 3.根据权利要求2所述的制备方法， 其特征在于， 具体包括： a)青蒿琥酯与N-羟基琥珀酰亚胺在缩合试剂条件下， 经酰胺化反应， 中间产物； b)碱性条件下， 所述中间产物与精氨酸发生取代反应， 得到式(I)所示的化合物。 4.根据权利要求3所述的制备方法， 其特征在于， 所述步骤a)中， 所述酰胺化反应的温 度为2535， 时间为6h12h。 5.根据权利要求3所述的制备方法， 其特征在于， 所述步骤b)中， 所述取代反应的温度 为3040， 时。
4、间为7h12h。 6.根据权利要求3所述的制备方法， 其特征在于， 所述步骤a)中， 所述青蒿琥酯与N-羟 基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:(1.22.0)。 7.根据权利要求3所述的制备方法， 其特征在于， 所述步骤b)中， 所述N， N二异丙基乙胺 与青蒿琥酯的摩尔比为(0.30.6):1。 8.根据权利要求3所述的制备方法， 其特征在于， 所述步骤a)中， 所述缩合试剂为EDC盐 酸盐； 所述步骤b)中， 所述碱性条件采用的碱为N， N二异丙基乙胺。 9.式(I)所示的化合物在制备治疗自身免疫系统疾病药物中的应用： 10.根据权利要求9所述的应用， 其特征在于， 所述自身免疫系统疾病选自类风湿。
5、性关 节炎或银屑病。 权利要求书 1/1 页 2 CN 106588950 A 2 青蒿琥酯衍生物、 其制备方法及其应用 技术领域 0001 本发明涉及药物合成技术领域， 尤其涉及一种青蒿琥酯衍生物、 其制备方法及其 应用。 背景技术 0002 免疫抑制剂是一类具有免疫抑制作用的药物， 主要功能为抑制机体异常的免疫反 应， 应用于自身免疫性疾病和过敏反应及器官移植(如心、 肝、 肾、 肺和骨髓移植等)后排斥 反应的治疗。 自身免疫性疾病是由于自身免疫应答过强或持续时间过长以至破坏自身正常 组织结构并引起的相应临床症状； 过敏反应即为机体抗原持续刺激或同一抗原再次刺激后 产生的一种以生理功能紊乱。
6、和组织损伤为主要表现的病理性免疫反应； 临床器官移植手术 后， 受者免疫系统可识别移植物抗原并产生应答， 移植物中免疫细胞也可以识别受者组织 抗原并产生免疫应答， 此为移植排斥反应。 这些症状都是机体 “不适当” 的免疫应答引起的， 而免疫抑制剂在一定程度上能够起到治疗的作用， 尤其是在器官移植排斥反应的预防和治 疗中起到了关键作用， 在临床上得到了广泛的应用。 0003 目前所有的免疫抑制剂可分为以下几种： 0004 (1)抗代谢类： 硫唑嘌呤(Aza)、 氨甲蝶呤、 霉酚酸酯(MMF)等； 0005 (2)烃化剂： 环磷酰胺等； 0006 (3)皮质固醇类： 强的松、 地赛米松等； 000。
7、7 (4)抗生素类： CsA、 FK506、 雷帕霉素等； 0008 (5)抗体类： 抗淋巴细胞球蛋白(ALG)、 单克隆T淋巴细胞抗体(OKT3)等； 0009 (6)中草药： 雷公藤多苷、 冬虫夏草制剂等。 0010 前三种为临床上已经使用的免疫抑制剂， 这些药物的疗效虽已被证实， 但只能改 善症状， 不能有效地从根本上控制疾病的发生和发展， 且毒副作用大， 不能长期持续应用。 抗体类免疫抑制剂可以专一作用于淋巴细胞， 但同时价格昂贵且带来严重的不良反应， 需 要进一步改进。 0011 青蒿琥酯(artesunate， AST)分子式C19H28O8， 结构式如式1： 0012 0013 。
8、其于1977年由中国科研人员首次合成， 鉴于青蒿琥酯对脑型疟疾有效， 而脑型疟 疾的发病机制与自身免疫有关， 因此人们推测青蒿琥酯除直接杀灭疟原虫外， 可能还具有 说明书 1/5 页 3 CN 106588950 A 3 免疫调节功能。 1997年余其斌等用青蒿琥酯治疗盘状红斑狼疮有效率高达94， 对系统性 红斑狼疮的有效率也达到80， 证明了青蒿琥酯的免疫调节作用。 0014 发明内容 0015 本发明的目的在于提供一种青蒿琥酯衍生物、 其制备方法及其应用， 本发明提供 的青蒿琥酯衍生物 0016 本发明提供了一种式(I)所示的化合物： 0017 0018 式(I)所示化合物为青蒿琥酯衍生物。
9、， 由青蒿琥酯与精氨酸发生酰胺化反应制备 得到。 0019 在一个实施例中， 其按照以下方法制备： 0020 a)青蒿琥酯与N-羟基琥珀酰亚胺在缩合试剂条件下， 经酰胺化反应， 中间产物； 0021 b)碱性条件下， 所述中间产物与精氨酸发生取代反应， 得到式(I)所示的化合物。 0022 本发明首先将青蒿琥酯和N-羟基琥珀酰亚胺在缩合试剂条件下进行酰胺化反应， 生成式(II)所示的中间产物： 0023 0024 其中， 所述缩合试剂为EDC盐酸盐； 所述酰胺化反应的温度为2535， 时间为6h 12h； 所述青蒿琥酯与N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:(1.22.0)。 0025 其中， 青蒿。
10、琥酯和N-氰基琥珀酰亚胺可以在搅拌的条件下进行酰胺化反应， 反应 介质可以为乙腈。 反应完毕后， 对得到的反应产物进行纯化， 具体为： 冷却、 第一洗涤、 萃取、 第二洗涤、 干燥。 反应完毕后， 将反应混合物减压旋干乙腈， 加入乙酸乙酯， 依次用水洗3次、 饱和氯化钠洗1次， 有机相用无水硫酸钠干燥； 布氏漏斗过滤偶， 减压旋蒸乙酸乙酯， 然后将 溶液加热回流， 缓慢加入石油醚析沉淀， 然后置于4冰箱析出晶体。 将析出的晶体用G3漏 斗过滤， 固体用无水乙醚洗2次， 油泵抽干后， 即可得到中间产物。 0026 得到中间产物后， 将其与精氨酸在碱性条件下进行取代反应， 得到式(I)所示化合 物。
11、， 反应过程如下： 说明书 2/5 页 4 CN 106588950 A 4 0027 0028 其中， 所述碱性条件采用的碱为N， N二异丙基乙胺； 所述取代反应的温度为3040 ， 时间为7h12h； 所述N， N二异丙基乙胺与青蒿琥酯的摩尔比为(0.30.6):1。 0029 其中， 中间产物和精氨酸可以在搅拌条件下进行取代反应， 反应介质可以为甲醇。 反应完毕后， 对得到的反应产物进行纯化， 具体为： 冷却， 过滤、 清洗、 结晶。 反应完毕后， 减 压旋干甲醇， 加入盐酸和乙酸乙酯进行萃取， 有机相用氯化钠洗涤后用无水硫酸钠干燥， 过 滤后减压干燥。 将得到的产品过200300目硅胶。
12、， 乙酸乙酯洗脱后得到式(I)所示化合物。 0030 本发明提供的化合物为青蒿琥酯衍生物， 可以用于制备治疗自身免疫系统疾病药 物。 实验结果表明， 式(I)所示化合物对DTH小鼠耳肿胀度和脾指数的影响与基质对照组相 比， 透皮给药的式(I)所示的化合物显著抑制DTH小鼠耳肿胀， 降低脾指数， 差异有显著性意 义， 提示实验条件下式(I)所示的化合物显示出一定的免疫抑制效应， 能够有效下调机体的 细胞免疫应答， 且效果优于青蒿琥酯。 因此， 本发明所述式I所示化合物具有明显的免疫抑 制作用， 可在制备治疗自身免疫系统疾病如类风湿性关节炎、 银屑病等疾病的药物中应用。 0031 本发明所述式I所。
13、示化合物可以和常规的辅料组合制成治疗自身免疫系统疾病如 类风湿性关节炎、 银屑病等疾病的药物， 包括口服液、 颗粒剂、 片剂、 丸剂、 散剂、 胶囊剂和滴 丸剂等。 0032 本发明还提供了一种药物制剂， 包括治疗有效量的本发明所述式I所示化合物和 药学上可接受的辅料。 本领域技术人员可将所述式I所示化合物直接或间接加入制备不同 剂型时所需的药学上可接受的各种常用辅料， 如填充剂、 崩解剂、 润滑剂、 粘合剂等， 以常规 药物制剂方法， 制成常用制剂如片剂、 胶囊剂、 注射液、 口服液、 颗粒剂、 丸剂、 散剂和滴丸剂 等。 其中， 填充剂如淀粉， 乳糖， 蔗糖， 葡萄糖， 甘露醇和硅酸； 崩。
14、解剂如琼脂， 碳酸钙， 土豆淀 粉或木薯淀粉， 海藻酸， 某些硅酸盐和碳酸钠， 低取代羟丙基纤维素； 润滑剂如滑石粉， 硬脂 酸钙， 硬脂酸镁， 固体聚乙二醇， 月桂硫酸钠； 粘合剂如羧甲基纤维素， 藻酸盐， 明胶， 聚乙烯 吡咯酮， 蔗糖和阿拉伯胶。 0033 本发明所述式I所示化合物是全新结构的化合物， 具有明显的免疫抑制作用， 可在 制备治疗自身免疫系统疾病如类风湿性关节炎、 银屑病等疾病的药物中运用。 另外， 本发明 提供的制备方法简单易行， 重现性好， 环境污染小， 可用于式I所示化合物的大量制备。 附图说明 0034 图1为本发明提供的化合物对小鼠耳肿胀度的影响； 0035 图2为。
15、本发明提供的化合物对小鼠脾指数的影响。 具体实施方式 0036 为了进一步说明本发明， 下面结合实施例对本发明提供的青蒿琥酯衍生物、 其制 备方法及其应用进行详细地描述， 但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。 0037 实施例1 说明书 3/5 页 5 CN 106588950 A 5 0038 0039 称取100g的青蒿琥酯(ART)置于2L圆底烧瓶中， 加入47.9g N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS)及80g EDC盐酸盐(EDC.HCl)， 加入乙腈1200ml， 控制内温30， 搅拌下反应过夜。 减压 旋干乙腈， 加入1000ml乙酸乙酯(EA)溶解， 每次用500ml水洗3次，。
16、 饱和氯化钠500ml洗涤一 次， 有机相用无水硫酸钠干燥1h。 0040 布氏漏斗过滤， 减压旋蒸EA至约250ml， 将溶液加热回流， 缓慢加入石油醚140ml至 刚好析出沉淀， 放入冰箱(4)过夜析出晶体。 0041 用G3漏斗过滤， 固体用无水乙醚150ml洗2次， 油泵抽干得固体青蒿琥酯琥珀酰亚 胺酯(ART-NHS)粗品113g， 直接进入下一步反应。 0042 实施例2 0043 0044 将LYS-OH 14.5g置于2L圆底烧瓶中， 加入1000ml甲醇(MeOH)， 搅拌1h， 加入实施例 1制备的ART-NHS粗品100g， 加入N， N二异丙基乙胺(DIEA)17.3m。
17、l， 控制内温35， 搅拌下反 应8h。 0045 减压旋干甲醇， 加入1N HCL 100ml， 水300ml， EA 1000ml萃取， 有机相用500ml 13的氯化钠溶液洗涤， 500ml饱和氯化钠洗， 有机相用无水硫酸钠干燥1h， 过滤， 减压干 燥。 过200-300目硅胶柱， EA洗脱得样品ART2-Lys-OH40g， 产率45， 纯度98.5(HPLC)。 0046 实施例3本发明所述化合物对小鼠迟发型超敏反应的抑制 0047 本发明通过实施例1制备的化合物ART2-Lys-OH对迟发型超敏反应小鼠耳及脾脏 生物功能的影响， 探讨化合物 的免疫调节机制， 以典型的细胞免疫反应。
18、迟发型超敏反 应(delayed-type hypersensitivity， DTH)为指标， 体内给药探讨化合物 的免疫调节功 能。 参照文献(Hirasaki Y ,Iwamura C ,Yamashita M ,et al .Repressor of GATA negatively regulates murine contact hypersensitivity through the inhibition of type-2allergic responses.Clin Immunol.2011； 139(3):267-276.)方法建立DTH小鼠 模型： 实验前1d小鼠腹部去毛约。
19、3cm。 开始日(第0日)和第1天于去毛部位涂0.5DNFB(以4 1丙酮橄榄油配制)40 L致敏。 第6天于左耳内外侧涂0.5DNFB 20 L激发。 0048 实验动物分组： 40只小鼠随机数字表法均分为4组， 正常对照组： 小鼠不造模， 不 进行任何干预。 青蒿琥酯干预组： 模型小鼠于诱发前0.5h和诱发后6h小鼠左耳外涂青蒿 琥酯乳膏(自制， 青蒿琥酯浓度为200mg/kg)进行干预。 化合物ART2-Lys-OH干预组： 模型 小鼠于诱发前0.5h和诱发后6h小鼠左耳外涂化合物 乳膏(自制， 化合物 浓度为200mg/kg) 进行干预。 基质对照组： 模型小鼠左耳外涂不含青蒿琥酯的乳。
20、膏基质(以排除基质对DTH 的影响)。 说明书 4/5 页 6 CN 106588950 A 6 0049 细胞悬液的制备： 小鼠眼球取血处死， 无菌分离小鼠脾脏， 200目筛网研磨过滤， 收 集细胞悬液， 洗涤3次(4， 250g， 5min)， 以RPMI1640完全培养基(含体积分数10热灭活 FCS， 100U/mL青霉素-链霉素)调细胞浓度为1109/L。 主要观察指标： 激发后48h颈椎脱 臼处死小鼠， 剪下左右耳壳， 用打孔器在相同部位取直径8mm耳片， 游标卡尺测厚度， 以耳片 厚度之差作为耳肿胀度。 取小鼠脾脏称质量， 以每10g小鼠的脾质量(mg)作为脾指数。 0050 统。
21、计学分析： 所有数据均用SPSS 13.0统计软件进行统计分析， 计量资料数据以x s表示， 采用单因素方差分析进行组间比较， P0.05被认为差异有显著性意义。 0051 结果参见图1和图2， 图1为本发明提供的化合物对小鼠耳肿胀度的影响， 图2为本 发明提供的化合物对小鼠脾指数的影响。 实验动物数量分析40只小鼠分组进行实验， 实验 过程中无动物脱失， 全部进入结果分析。 由图1和图2可知， 本发明提供给的化合物对DTH小 鼠耳肿胀度和脾指数的影响与基质对照组相比， 透皮给药的化合物显著抑制DTH小鼠耳肿 胀， 降低脾指数， 差异有显著性意义， 提示实验条件下化合物 显示出一定的免疫抑制效应， 能够有效下调机体的细胞免疫应答， 且效果优于青蒿琥酯。 0052 以上所述仅是本发明的优选实施方式， 应当指出， 对于本技术领域的普通技术人 员来说， 在不脱离本发明原理的前提下， 还可以做出若干改进和润饰， 这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。 说明书 5/5 页 7 CN 106588950 A 7 图1 图2 说明书附图 1/1 页 8 CN 106588950 A 8 。