技术领域
本发明涉及一种miRNA的检测产品以及miR-21、miR-191和miR-16作为乳 腺癌分子标记物的应用，属于生物技术领域。
背景技术
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，全世界每年约有200万新增乳腺癌患者； 我国近年乳腺癌发病率增长迅速，高出发达国家1-2个百分点，且具有年轻化、 家族聚集、遗传易感等特征。乳腺癌早早期时临床无症状，隐匿阶段平均为12 年，等到有明显症状时多已是中晚期。
应用分子指标来早期发现肿瘤是目前的研究热点，其中微小RNA(microRNA， miRNA)作为早期诊断的新一代肿瘤标志越来越引起临床应用的关注。miRNA是一 类高度保守，长度约在19－24个核苷酸的内源性非编码小分子单链RNA,能通 过与靶基因mRNA特异性的碱基互补配对,引起靶基因mRNA的降解或者抑制其翻 译,从而参与调控细胞增殖、分化及凋亡过程，一些miRNA作为原癌基因或抑癌 基因已被证实。Iorio等的研究(Cancer Res，2005，65(16)，7065-7070)首 次指出，miRNA在乳腺癌和正常的乳腺组织中的表达存在着明显的差异。Seongho 等的研究(Plos one，2011,6(2)，e16403)利用Illumina-Sol-exa深度测序 平台的基因检测技术在乳腺癌细胞株中鉴定的189种明显异常的miRNA，这些 miRNA均有不同程度的致癌潜能。miRNA对于早期癌症的诊断具有重要意义。 Mar-Aguilar F的研究(Asia Pac J Clin Oncol.2013，9(1):53-9)显示miRNA 的联合表达分析比起单个miRNA分析在预测乳腺癌中的优势：miR-125b和 miR-191的联合检测敏感度为100％，特异性为94％；miR-21和miR-191联合检测 敏感度为92％，特异性为100％。“miR-21、miR-155在乳腺癌血清和肿瘤组织中 表达水平相关性的研究”(卞国奉，2012，硕士论文)也指出血清中miR-21和 miR-155联合检测在乳腺癌早期诊断中的潜在价值。
血清中的miRNA含量远低于组织，需要一种非常灵敏且特异的检测方法； 又由于miRNA引物序列短，引物设计比较困难，没有针对性的软件可以直接利用， 故引物及体系均需筛选及优化过程。目前对miRNA的高通量筛查一般采用芯片技 术，成本高、特异性和灵敏度有限，且不能满足零散标本实时检测需求；对少数 miRNA的实时检测多采用Taqman探针法，部分已形成商业化试剂盒产品，但成本 和售价高昂。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测快速方便、准确率高，可以实现乳腺癌早期诊 断的miRNA检测试剂盒，以及提供miR-21、miR-191和miR-16联合使用作为乳 腺癌分子标记物的应用。
本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：miR-21、miR-191、 miR-16和miR-39联合使用在制备乳腺癌miRNA检测试剂盒中的应用，其中miR-39 作为内参。
基于上述应用本发明提出的具体技术方案是：一种乳腺癌miRNA检测试剂盒， 其检测体系包括反转录反应体系、RCR反应体系和内参体系，所述RCR反应体系 中包括分别针对miR-21、miR-191和miR-16的正向引物和反向通用引物；所述 内参体系包括内参miRNA-39和针对miR-39的正向引物；针对所述miR-21的正 向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；针对所述miR-191的正向引物的核苷 酸序列如SEQ ID No.2所示；针对所述miR-16的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；针对所述miR-39的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所 述反向通用引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
用于配制所述RCR反应体系的试剂包括SYBR Green混合液、正向引物液、 反向通用引物液和纯水；用于配制所述反转录反应体系的试剂包括多聚腺苷酸聚 合酶、反转录酶混合液、反转录缓冲液和无核酸酶纯水。
上述RCR反应体系的总体积为10μl；其中，所述SYBR Green混合液的体积 是5μl，所述正向引物液的体积是1μl，所述反向通用引物液的体积是1μl，所述 DNA模板1μl,其余是纯水；所述正向引物液的使用浓度为2μM，所述反向通用引 物液的使用浓度为2μM；所述DNA模板是所述反转录反应体系反应后的产物稀释 五倍获得的。
上述反转录反应体系的总体积为12.5μl；其中，所述多聚腺苷酸聚合酶的体 积是0.5μl，所述反转录酶混合液的体积是0.5μl，所述反转录缓冲液的体积是 2.5μl，所述miRNA样品的加入量是20ng，其余是无核酸酶纯水；所述多聚腺苷 酸聚合酶的使用浓度为2.5U/μl；所述miRNA样品中含有内参miRNA-39。
上述内参miRNA-39是在抽提miRNA样品过程中加入的体积为2μl的内参 miRNA-39液，所述内参miRNA-39的使用浓度为0.2μM。
本发明具有积极的效果：
(1)miR-21、miR-191和miR-16作为组合分子标记物，经过大数据临床验 证实验，在乳腺癌的辅助诊断指标方面具有突出优势。这三个分子标记物首次应 用于乳腺癌miRNA检测试剂盒的开发，该乳腺癌miRNA检测试剂盒运用实时荧光 定量PCR方法，可以实现早期乳腺癌的辅助诊断，提高患者的生存率。
(2)本发明的乳腺癌miRNA检测试剂盒选择了miR-21、miR-191和miR-16 这三个miRNA标记物进行组合，开发成检测试剂盒，检测快速方便、检测灵敏度、 特异度高、成本低，可以满足绝大多数肿瘤病人的检测需求，应用范围极广，经 临床验证预测准确率高。
(3)本发明的乳腺癌miRNA检测试剂盒针对血清中作为定量反应的内参， 不同样本中差异很大的因素，特别引入稳定的外源RNA序列miR-39(来源于线虫) 作为内参对照RNA，并优化设计了针对miR-39的内参正向引物，极大提高了进行 miRNA检测时相对定量的准确度。
附图说明
图1是采用本发明的试剂盒检测样本的miR-21的熔解曲线图；
图2是采用本发明的试剂盒检测样本的miR-191的熔解曲线图；
图3是采用本发明的试剂盒检测样本的miR-16的熔解曲线图；
图4是采用本发明的试剂盒检测样本的miR-39的熔解曲线图；
图5是采用本发明的试剂盒分别进行miR-21、miR-191和miR-16单指标及 三个指标联合检测的ROC曲线图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例 只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域 的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。下 述实施例中，若非特意表明，所用的试剂均为分析纯，所用试剂均可从商业渠道 获得。文中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编 著的科学出版社2002年出版的《分子克隆实验指南》一书中所述的条件，或按 照制造商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本 领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及 材料皆可应用于本发明中。
实施例1
一、试剂盒的组成。
本实施例的乳腺癌miRNA检测试剂盒，包括用于配制反转录反应体系的试剂、 用于配制PCR体系的试剂和用于配制内参体系的试剂。
1、内参体系：
用于配制内参体系的试剂包括内参miRNA-39液和针对miR-39的正向引物 液。内参miRNA-39液为现虫cel-miR-39(Accession Number：AJ487564)溶液， 由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成，封装在一个小瓶中，配制的浓度为20μM， 共10μl，使用浓度为0.2μM；针对miR-39的正向引物液封装在一个小瓶中，体 积是100μl，使用浓度为2μM。如表1所示。
表1内参体系组分表
组分 体积 使用浓度 内参miRNA-39液 10μl 0.2μM miR-39正向引物 100μl 2μM
2、反转录反应体系：
用于配制反转录反应体系的试剂包括多聚腺苷酸聚合酶(polyA polymerase， 供应商：GeneCopoeia，商品号：Cat#A02030B)、反转录酶混合液(RTase Mix， 供应商：GeneCopoeia，商品号：Cat#C02020B)、反转录缓冲液(5×PAP/RT buffer， 供应商：GeneCopoeia，商品号：Cat#C02022B)和无核酸酶纯水(RNase and DNase free H2O，供应商：GeneCopoeia，商品号：Cat#C10230A)。用于配制反转录反应 体系的试剂逐瓶封装，使用时按一定的比例配制成反转录反应体系，反转录反应 体系为12.5μl/次，封装的体积是100次的用量，如表2所示。
表2反转录反应体系组分表
组分 体积 使用浓度 polyA polymerase 50μl 2.5U/μl RTase Mix 50μl 原商品浓度 5×PAP/RT buffer 250μl 原商品浓度 RNase and DNase free H2O 1000μl —
3、PCR反应体系：
用于配制PCR反应体系的试剂包括SYBR Green混合液(2×SYBR Green Mix， 供应商：杭州博日科技有限公司，商品号：Cat#B254C1)、正向引物液(F primer， 人工合成)、反向通用引物液(Universal Adaptor PCR Primer，人工合成)和 纯水(H2O)。用于配制PCR反应体系的试剂逐瓶封装，使用时按一定的比例配制 成PCR反应体系，PCR反应体系为10μl/次，封装的体积是100次的用量，如表3 所示。
表3PCR反应体系组分表
组分 体积 使用浓度 2×SYBR Green Mix 500μl 原商品浓度 各F primer 各100μl 2μM Universal Adaptor PCR Primer 100μl 2μM H2O 1000μl —
用于配制PCR反应体系的正向引物分别为针对miR-21的正向引物、针对 miR-191的正向引物、针对miR-16的正向引物、针对miR-39的正向引物。用于 配制PCR反应体系的三种正向引物分开逐瓶封装。配制PCR反应体系的正向引物、 内参正向引物和反向通用引物的核苷酸序列，如表4所示，由上海生工生物工程 有限公司合成。
表4正向引物和反向通用引物特征表
二、试剂盒的使用方法。
本实施例的miRNA检测试剂盒的具体检测步骤如下：
1、miRNA的提取。
采用北京艾德莱生物科技有限公司的RN24-BLOODmisi全血(液体样本)微 小RNA快速提取试剂盒(RN24)进行miRNA提取。首先按照说明书第一步：每0.25ml 液体样品加入0.75ml的裂解缓冲液(Lysis buffer)；然后按照说明书第二步： 将样品剧烈震荡混匀，在15～30℃条件下孵育5分钟以使核蛋白体完全分解； 之后在样本溶液中加入2μl使用浓度为0.2μM内参miRNA-39液，作为反应内参； 接着按照说明书第三步及以后的步骤进行。
提取miRNA样本后通过测定浓度和OD260/OD280的比值控制样本质量，最终 加入反转录反应体系中的样本OD260/OD280的比值在1.8～2.0之间的可获得最 优反应结果。
2、反转录反应。
(1)反转录反应体系：取0.5μl的polyA polymerase、0.5μl的RTase Mix 和2.5μl的5×PAP/RT buffer进行混合；再加入抽提的miRNA样本，miRNA样 本的加入量控制为20ng；最后加入适量的RNase and DNase free H2O，使得反转 录的反应总体积为12.5μl。如表5所示。
表5反转录反应体系表
组分 加入量 polyA polymerase 0.5μl RTase Mix 0.5μl 5×PAP/RT buffer 2.5μl miRNA样本 20ng Rnase and DNase free H2O 补水至总体积为12.5μl
(2)反转录程序：37℃，1h；85℃，5min。所得cDNA 4℃冷藏待用，作为 下一步反应的模板。
3、荧光定量PCR反应。
(1)荧光定量PCR反应体系：取5μl的2×SYBR Green Mix、1μl的其中一 种F primer、1μl的Universal Adaptor PCR Primer和1μl的模板cDNA进行混 合，最后加入适量的H2O使得PCR反应总体积为10μl。其中，模板cDNA是将反 转录的产物稀释5倍获得的。如表6所示。
表6荧光定量PCR反应体系表
组分 加入量 2×SYBR Green Mix 5μl F primer 1μl Universal Adaptor PCR Primer 1μl cDNA模板 1μl Rnase and DNase free H2O 补水至总体积为10μl
(2)荧光定量PCR反应及溶解曲线分析程序：
1)95℃，10min；
2)95℃，30s；
3)58℃，30s；
4)72℃，30s；
5)重复第2)步到第4)步40个循环；
6)95℃，15s；
7)58℃，60s；
8)95℃，15s。
(3)反应结果
采用本实施例的乳腺癌miRNA检测试剂盒进行miR-21、miR-191和miR-16 的检测，对应引物扩增特异性较好，均为单峰。图1为检测样本的miR-21的熔 解曲线图；图2为检测样本的miR-191的熔解曲线图；图3为检测样本的miR-16 的熔解曲线图；图4为检测样本的miR-39的熔解曲线图。
4、试剂盒的判断标准。
通过Logistic回归方程拟合两个指标发现，拟合后的灵敏度和特异性均高于 单独指标。通过数据分析，得到判断公式(回归方程)为：
Y＝0.017AmiR-21+0.0863*BmiR-191-0.037*CmiR-16-6.924。
其中AmiR-21是miR-21的表达量(2-△△CT值)，BmiR-191是miR-191的表达量 (2-△△CT值)，CmiR-16是miR-16的表达量(2-△△CT值)。
当Y值≥0.5490时，即预测概率值大于或等于0.5490时判为阳性(即预测 为乳腺癌患者)；反之为阴性。
应用例1
采用实施例1的乳腺癌miRNA检测试剂盒，对35例乳腺癌病人及41例健康人 (对照)血清中的miRNA进行检测，检测miR-21、miR-191和miR-16的表达量(2-△△CT值)。对检测结果采用SPSS17.0进行回归分析，miR-21、miR-191和miR-16 各单个检测指标预测结果及miR-21、miR-191和miR-16的联合预测结果参见图5及 表7。
如表7所示，各指标及联合指标P值均<0.05，说明各检测指标均与乳腺癌预 测显著相关。miR-21、miR-191和miR-16的联合预测准确率达到97％，高于单个检 测指标的预测率，也高于miR-21和miR-191联合检测的预测率。由回归分析还得 到采用本试剂盒进行三指标联合检测验证，其敏感度为93％，特异度为100％，均 高于单个指标及两两组合的指标，其中miR-21和miR-191联合检测敏感度为88％， 故三指标联合检测具有明显的优势。
表7ROC曲线下的面积
a.在非参数假设下，
b.零假设：实面积＝0.5。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发 明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上 还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以 穷举。而这些属于本发明的精神所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明 的保护范围之中。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海赛安生物医药科技有限公司
<120> 一种乳腺癌miRNA检测试剂盒及其miRNA的应用
<130> 无
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
tagcttatca gactgatgtt g 21
<210> 2
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
atgtggatgt ttacgt 16
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
cacgtaaata ttggcg 16
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
gggtcaccgg gggtaaatca g 21
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
gtagcgtatc gttgacagca 20