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Casup2+/sup在提高CELI家族酶活性中的应用.pdf

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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510924543.7 (22)申请日 2015.12.14 C12N 9/22(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人中国科学院植物研究所地址 100093 北京市海淀区香山南辛村 20 号 (72)发明人刘春明姚学峰 (74)专利代理机构北京纪凯知识产权代理有限公司 11245 代理人关畅白艳 (54) 发明名称 Ca2+在提高 CELI 家族酶活性中的应用 (57) 摘要本发明公开了一种Ca2+在提高CELI酶活性中的应用。本发明的 Ca2+在酶切缓冲液中的浓度为 0.5-5。

2、0mM。本发明的方法更为灵敏， Ca2+的终浓度在 0.5-50mM 范围内都可以提高 CELI 酶检测灵敏度，对低丰度未知突变体的检测，如某癌症基因都有很好的检测效果，特别是 TILLING 技术平台检测诱变群体时，有明显优势，不仅仅简化了 PCR 纯化步骤，同时相应地提高了检测分辨率。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书1页说明书8页序列表8页附图2页 CN 106867980 A 2017.06.20 CN 106867980 A 1/1 页 2 1.Ca2+在促进 CELI 酶活性中的应用；或。

3、Ca2+在制备 CELI 酶酶切缓冲液或 CELI 酶酶切缓冲体系中的应用。 2.含有 Ca 2+的 CELI 酶酶切缓冲液，其特征在于：所述 Ca2+在所述 CELI 酶酶切缓冲液中的浓度为 0.5-50mM。 3.一种酶切反应体系，包括权利要求 2 所述的含有 Ca 2+的 CELI 酶酶切缓冲液和 CELI 酶。 4.一种 CELI 酶试剂盒，为如下 (1) 或 (2) ： (1) 权利要求 2 所述的酶切缓冲液； (2) 权利要求 2 所述的酶切缓冲液和 CELI 酶。 5.权利要求2所述的酶切缓冲液或权利要求3所述的酶切反应体系或权利要求4所述的试剂盒在促进 CELI。

4、酶切割含有错配位点 DNA 中的应用。 6.权利要求2所述的酶切缓冲液或权利要求3所述的酶切反应体系或权利要求4所述的试剂盒在检测待测 DNA 分子是否含有错配位点中的应用。 7.一种用 CELI 酶酶切含有错配位点 DNA 的方法，包括如下步骤：将含有错配位点 DNA 和野生型 DNA 在权利要求 3 所述的酶切反应体系中进行酶切反应，实现酶切；所述含有错配位点 DNA 和野生型 DNA 的质量比为 1 ： (1-24)。 8.根据权利要求 7 所述的方法，其特征在于：所述含有错配位点 DNA 和野生型 DNA 的质量比为 1:(12-24)。 9.根据权利要求 5 。

5、或 6 所述的应用或权利要求 7 或 8 所述的方法，其特征在于：所述错配位点的错配形式为 AA、 AG、 AC、 GG、 GT、 CC、 CT 和 / 或 TT。 10.权利要求 2 所述的酶切缓冲液或权利要求 3 所述的酶切反应体系或权利要求 4 所述的试剂盒或权利要求 7-9 中任一所述的方法在低丰度突变体检测中的应用。权利要求书 CN 106867980 A 2 1/8 页 3 Ca2+在提高 CELI 家族酶活性中的应用技术领域 0001 本发明涉及 Ca2+在提高 CELI 家族酶活性中的应用，属于生物技术领域。背景技术 0002 CELI 酶是一种单链、。

6、双链都特异识别的特异性核酸酶，等电点为 6.0-6.5，分子量大小为 43kDa(Yang et al,1999) ； CEL I 酶和 CEL II 酶都具有识别碱基错配的能力，其同源性为 49 ( 见图 5)(Yang et al,1999 ； Pimkin et al,2006)。传统理论认为该酶的催化活性只需要Mg2+和Zn 2+(Till et al,2004)，它可以识别八种错配形式的碱基(mismatches) 分别为 AA、 AG、 AC、 GG、 GT、 CC、 CT 和 TT(Oleykowski et al,1999 ； Oleykowski et al,。

7、1998)，因此被广泛应用于突变检测领域，如植物TILLING技术平台中(Till et al,2006)。该酶可以特异性切割错配碱基(Bing Yang et al,1999)。通过酶切扩增的目标检测片段并经琼脂糖或毛细管电泳分离检测，一般可方便获得突变位置和大小。因此，它是一种比较方便和经济的检测未知和已知突变位点的手段 (Yeung et al,2005)。 0003 目前 CELI 酶主要提取途径是从芹菜中提取，主要提取方法是通过硫酸铵沉淀法，得到粗提酶液 (Till et al,2006)。如果需要得到纯度更高的酶，需要经过刀豆体蛋白 A- 琼脂糖柱吸附，。

8、用 alpha- 甘露糖苷洗脱，但是得率较低 (Yang et al,1999)。因此，大部分 TILLING 突变体检测实验是用粗提酶来检测的，该粗提酶的主要成分即为 CELI(Yang et al,1999 ； Till et al,2006)。发明内容 0004 本发明的一个目的是提供 Ca2+的新用途。 0005 本发明提供了 Ca2+在促进 CELI 酶活性中的应用。 0006 上述应用中，所述 CELI 酶活性为切割错配位点。 0007 本发明还提供了 Ca2+在制备 CELI 酶酶切缓冲液或 CELI 酶酶切缓冲体系中的应用。 0008 本发明的另一个目的是提供含有。

9、 Ca2+的 CELI 酶酶切缓冲液。 0009 本发明提供的含有 Ca2+的 CELI 酶酶切缓冲液中，所述 Ca 2+在所述 CELI 酶酶切缓冲液中的浓度为 0.5-50mM。 0010 上述含有 Ca2+的 CELI 酶酶切缓冲液中，所述 Ca 2+在所述 CELI 酶酶切缓冲液中的浓度具体为 0.5mM、 5mM、 10mM、 15mM、 30mM 或 50mM ； 0011 上述含有 Ca2+的 CELI 酶酶切缓冲液中，所述含有 Ca 2+的 CELI 酶酶切缓冲液由 Ca2+、 BSA、 Triton X-100、 KCl 和 HEPES 缓冲液组成；所述 HEP。

10、ES 缓冲液为浓度为 0.1M、 pH 值为 7.5 的 HEPES 缓冲液。 0012 本发明还有一个目的是提供一种酶切反应体系。 0013 本发明提供的酶切反应体系包括上述含有 Ca2+的 CELI 酶酶切缓冲液和 CELI 酶。 0014 本发明还有一个目的是提供一种 CELI 酶试剂盒。说明书 CN 106867980 A 3 2/8 页 4 0015 本发明提供的 CELI 酶试剂盒为如下 (1) 或 (2) ： 0016 (1) 上述酶切缓冲液； 0017 (2) 上述酶切缓冲液和 CELI 酶。 0018 上述酶切缓冲液或上述酶切反应体系或上述试剂盒在促进 CELI 酶切。

11、割含有错配位点 DNA 中的应用也属于本发明的保护范围。 0019 上述酶切缓冲液或上述酶切反应体系或上述试剂盒在检测待测 DNA 分子是否含有错配位点中的应用也属于本发明的应用。 0020 本发明的最后一个目的是提供一种用 CELI 酶酶切含有错配位点 DNA 的方法。 0021 本发明提供的用CELI酶酶切含有错配位点DNA的方法包括如下步骤：将含有错配位点 DNA 和野生型 DNA 在上述酶切反应体系中进行酶切反应，实现酶切； 0022 所述含有错配位点 DNA 和野生型 DNA 的质量比为 1 ： (1-24)。 0023 上述方法中，所述含有错配位点 DNA 和野生型。

12、 DNA 的质量比为 1:(12-24)。 0024 上述应用或方法中，所述错配位点的错配形式为 AA、 AG、 AC、 GG、 GT、 CC、 CT 和 / 或 TT。 0025 上述酶切缓冲液或上述酶切反应体系或上述试剂盒或上述方法在低丰度未知突变体检测中的应用也属于本发明的保护范围。 0026 本发明发现了新的催化活性物质 Ca2+，通过实验证明： Ca2+可以进一步提高 CELI 酶活，特别是对低丰度突变的检测。比传统的酶切方法相比，本发明的方法更为灵敏， Ca2+ 的终浓度在 0.5-50mM 范围内都可以提高 CELI 酶的检测灵敏度，对低丰度未知突变体的检测，如。

13、某癌症基因都有很好的检测效果，特别是 TILLING 技术平台检测诱变群体时，有明显优势，不仅仅简化了 PCR 纯化步骤，同时相应地提高了检测分辨率。附图说明 0027 图 1 为 Ca2+对 CELI 酶切效果。 0028 图 2 为 Ca2+对 CELI 酶切效果。 0029 图 3 为 Ca2+对 CELI 酶切效果。 0030 图 4 为 Ca2+和 Mg 2+对 CELI 酶切效果。 0031 图 5 为 CELI 与 CELII 同源关系比较图。具体实施方式 0032 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。 0033 下述实施例中所用的材料、试剂。

14、等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 0034 Mutation Detection Kit-S100 试剂盒是美国环球基因公司的产品，产品目录号为 706025。 0035 Binding Buffer 是美国 zymoresearch 公司的产品； DNA Clean&ConcentratorTM- 25。 0036 实施例 1、 Ca2+在提高 CELI 酶活性中的应用 0037 一、待酶切 DNA 样品的制备 0038 1、 DNA 的合成说明书 CN 106867980 A 4 3/8 页 5 0039 人工合成序列表中序列 1 所示的 DNA 分子和序列表中序列。

15、2 所示的 DNA 分子，将其按 2:1 比例 ( 质量比 ) 混合，得到待 PCR 扩增的 DNA a0( 浓度为 1ng/ul) ；序列 2 为将序列 1 的第 544 位核苷酸由 G 突变为 A 后得到的 DNA 分子。 0040 人工合成序列表中序列 3 所示的 DNA 分子和序列表中序列 4 所示的 DNA 分子，将其按 2:1 比例 ( 质量比 ) 混合，得到待 PCR 扩增的 DNA a1( 浓度为 1ng/ul) ；序列 4 为将序列 3 的第 503 位核苷酸由 G 突变为 A 后得到的 DNA 分子。 0041 人工合成序列表中序列 3 所示的 DNA 。

16、分子和序列表中序列 5 所示的 DNA 分子，将其按 2:1 比例 ( 质量比 ) 混合，得到待 PCR 扩增的 DNA a2( 浓度为 1ng/ul) ；序列 5 为将序列 3 的第 389 位核苷酸由 G 突变为 A 后得到的 DNA 分子。 0042 人工合成序列表中序列 3 所示的 DNA 分子和序列表中序列 6 所示的 DNA 分子，将其按 2:1 比例 ( 质量比 ) 混合，得到待 PCR 扩增的 DNA a3( 浓度为 1ng/ul) ；序列 6 为将序列 3 的第 563 位核苷酸由 C 突变为 A 后得到的 DNA 分子。 0043 人工合成序列表中序列。

17、3 所示的 DNA 分子和序列表中序列 7 所示的 DNA 分子，将其按 2:1 比例 ( 质量比 ) 混合，得到待 PCR 扩增的 DNA a4( 浓度为 1ng/ul) ；序列 7 为将序列 3 的第 495 位核苷酸由 T 突变为 C 后得到的 DNA 分子。 0044 2、 PCR 扩增 0045 分别以上述待 PCR 扩增的 DNA a0、待 PCR 扩增的 DNA a1、待 PCR 扩增的 DNA a2、待 PCR扩增的DNA a3、待PCR扩增的DNA a4为模板，采用F和R引物对所述模板进行PCR扩增，扩增至 45 个热循环，然后进行 99变性 10mi。

18、n，降温至 70，每个循环降低 0.3， 69 个循环结束，分别得到PCR扩增产物a0即待酶切DNA样品a0、 PCR扩增产物a1即待酶切DNA样品 a1、 PCR 扩增产物 a2即待酶切 DNA 样品 a 2、 PCR 扩增产物 a3即待酶切 DNA 样品 a3、 PCR 扩增产物 a4即待酶切 DNA 样品 a 4。待扩增完毕后，用 1琼脂糖凝胶检测，检测条带是否特异，条带亮度是否达到要求。若条带较暗或不特异，需要重新扩增。引物序列如下： 0046 F ： ATGCACTTAACAGAGGAAATCTTG ； 0047 R ： TTACTTAATACTTTTCTTGTA。

19、GCCTTTA。 0048 以待 PCR 扩增的 DNA a0为模板， PCR 扩增得到大小为 791bp 的 PCR 扩增产物 a 0，对 PCR 扩增产物 a0进行测序。测序结果表明， PCR 扩增产物 a 0含有如序列表中序列 1 所示的 DNA 分子和将序列表中序列 1 的第 544 位核苷酸由 G 突变为 A 的异源双链 DNA 分子。 0049 以待 PCR 扩增的 DNA a1为模板， PCR 扩增得到大小为 1134bp 的 PCR 扩增产物 a 1，对 PCR 扩增产物 a1进行测序。测序结果表明， PCR 扩增产物 a 1含有如序列表中序列 2 所示的 DNA 分子。

20、( 野生型样品的 DNA) 和大小为 1134bp 的将序列表中序列 2 的第 503 位核苷酸由 G 突变为 A 的异源双链 DNA 分子 ( 点突 DNA 样品 a1)。 0050 以待 PCR 扩增的 DNA a2为模板， PCR 扩增得到的大小为 1134bp 的 PCR 扩增产物 a2，对 PCR 扩增产物 a2进行测序。测序结果表明， PCR 扩增产物 a2含有如序列表中序列 2 所示的 DNA 分子 ( 野生型样品的 DNA) 和大小为 1134bp 的将序列表中序列 2 的第 389 位核苷酸由 G 突变为 A 的异源双链 DNA 分子 ( 点突 DNA 样品 a2)。。

21、 0051 以待 PCR 扩增的 DNA a3为模板， PCR 扩增得到的大小为 1134bp 的 PCR 扩增产物 a3，对 PCR 扩增产物 a3进行测序。测序结果表明， PCR 扩增产物 a3含有如序列表中序列 2 所示的 DNA 分子 ( 野生型样品的 DNA) 和大小为 1134bp 的将序列表中序列 2 的第 563 位核苷说明书 CN 106867980 A 5 4/8 页 6 酸由 G 突变为 A 的异源双链 DNA 分子 ( 点突 DNA 样品 a3)。 0052 以待 PCR 扩增的 DNA a4为模板， PCR 扩增得到的大小为 1134bp 的 PCR 扩增产。

22、物 a4，对 PCR 扩增产物 a4进行测序。测序结果表明， PCR 扩增产物 a4含有如序列表中序列 2 所示的 DNA 分子 ( 野生型样品的 DNA) 和大小为 1134bp 的将序列表中序列 2 的第 495 位核苷酸由 G 突变为 A 的异源双链 DNA 分子 ( 点突 DNA 样品 a4)。 0053 PCR 扩增体系 (10ul) ： 10 倍 PCR 缓冲液 1.0ul、 dNTP 0.8ul、 Forward primer(10um)0.16ul、 Reverse primer(10um)0.16ul、 DNA 模板 1.0ul、聚合酶 0.1ul、 H20。

23、 6.78ul ； 0054 PCR 扩增热循环： 95 2min ； 94 10s， 60 30s， 72 1-3min ； 72 5min， 12 hold。 0055 异源错配双链形成： 99 10min ； 70 20s， -0.3 per cycle， 70cycles ； 12 10min。 0056 3、 PCR 产物纯化 0057 (1) 用在 1 倍体积的 PCR 扩增产物中加入 2 倍体积的 Binding Buffer，翻转充分混匀 ( 对小于 200bp 的 PCR 扩增产物，加入 5 倍体积的 Binding Buffer) 得到混合液。 0058 (2) 。

24、将所述混合液加入 DNA 纯化柱内 ( 如果溶液体积 700l，分次转移溶液 ) ；室温放置 1-2min 或更长时间。 0059 (3)13,000g 离心 1min，弃废液 ( 目的 DNA 长度 500bp 时，离心结束后将收集管中的溶液再次转入 DNA 纯化柱中，离心 )。 0060 (4) 在 DNA 纯化柱中加入 650ul Wash Buffer， 13,000g 离心 30 秒，弃废液，将 DNA 纯化柱放回收集管。 0061 (5) 重复步骤 (4)。 0062 (6)13,000g 离心 3min，以去除柱中残余乙醇。 0063 (7) 将纯化柱放入新的离。

25、心管中，向柱中加入在 60预热的 30-50l Elution Buffer 或 ddH2O，室温放置 1-2min 或更长时间。 0064 二、 CELI 酶的制备 0065 1、取 10kg 芹菜，放入榨汁机中，缓慢榨汁后，避免温度过热，在汁液中加入预冷匀浆缓冲液 ( 含 100mM Tris-HCl(pH 均为 7.7) 和 100uM PMSF)，得到混合液。 0066 2、将所述混合液 4下 14000rpm 离心 10min，弃沉淀，取上清液；向上清液中缓慢加入硫酸铵 ( 每 100ml 上清液加 25g 硫酸铵 )，分 10 次加入 ( 每 100。

26、ml 体积加入 14.4g 硫酸胺 )，待完全溶解后，低速搅拌 30min ； 14000rpm 离心 45min，弃沉淀，取上清液。 0067 3、向上清液中缓慢加入硫酸铵至 ( 每 100ml 上清液加 80g 硫酸铵 )，分十次加入 ( 每 100ml 体积加入 39.0g 固体硫酸铵 )。低速搅拌 30min 后， 14000rpm 离心 3min。弃上清，收集沉淀。 0068 4、用 1/10 体积的缓冲液 (0.1M Tris-HC1、 100uM PMSF ； pH 为 7.7) 溶解步骤 3 中得到的沉淀， 1000rpm 离心 20min，弃沉淀，取。

27、上清。 0069 5、把透析袋剪成适当长度的小段。用 1mmol/L EDTA(pH 8.0) 中将透析袋煮沸 5min。用超纯水清洗透析袋。将透析袋放入 10 倍蛋白质溶液以上体积的缓冲液 (0.1M Tris-HC1、 100uM PMSF ； pH 为 7.7) 中，透析过夜，透析 4-5 次至透析液无颜色为止。说明书 CN 106867980 A 6 5/8 页 7 0070 6、取 40ml 透析过的酶液经 ConA-Sapharose-4B 柱，用缓冲液 (0.1M Tris-HC1、 100uM PMSF ； pH为7.7)冲洗，经alpha-甘露糖苷洗脱后，。

28、经缓冲液(0.1M Tris-HC1、 100uM PMSF ； pH 为 7.7) 透析过夜，得到纯化后的 CELI 酶 ( 约 50mg)，分装 -80 度保存。 0071 三、酶切反应及其效果 0072 1、酶切缓冲液的配置 0073 酶切缓冲液配置分成如下 5 组： 0074 组 1 ： 10 倍 digestion buffer( 不含有 Mg2+缓冲液配置 ) ： 2ug/ml BSA、 0.02 Triton X-100(vol/vol)、 0.1M KCl、 0.1M HEPES(pH 7.5)、不同浓度的 CaCl2(0mM、 0.5mM、 5mM、 10mM、。

29、15mM、 30mM、 60mM) ； 0075 组2 ： 10倍digestion buffer(含有Mg2+缓冲液配置) ： 2ug/ml BSA、 0.02Triton X-100(vol/vol)、 0.1M KCl、 0.1M HEPES(pH 7.5)、 100mM MgCl2； 0076 组 3 ： 10 倍 digestion buffer( 不含有 Mg2+缓冲液配置 ) ： 2ug/ml BSA、 0.02 Triton X-100(vol/vol)、 0.1M KCl、 0.1M HEPES(pH 7.5)、 50mM CaCl2； 0077 2、酶切反应 0078 分。

30、别取 2ul 的待酶切 DNA 样品 a0、待酶切 DNA 样品 a1、待酶切 DNA 样品 a2、待酶切 DNA 样品 a3、待酶切 DNA 样品 a4作为酶切反应底物，用上述各组酶切缓冲液进行酶切反应，得到酶切产物 a0、酶切产物 a1、酶切产物 a2、酶切产物 a3、酶切产物 a4。 0079 CELI酶切反应体系(6ul) ： 10倍酶切缓冲液0.6ul、 CELI酶(0.3mg/ml)0.2ul、 PCR 扩增产物 2.0ul、纯水 3.2ul。 0080 若酶切产物a0含有791bp、 544bp和247bp的酶切片段，说明CELI酶可以有效的检测出待酶切。

31、 DNA 样品中的点突 DNA 样品；若酶切产物仅含有 791bp 的酶切片段，说明 CELI 酶无法检测出待酶切 DNA 样品中的点突 DNA 样品； 0081 若酶切产物 a1含有 1134bp、 503bp 和 631bp 的酶切片段，说明 CELI 酶可以有效的检测出待酶切 DNA 样品中的点突 DNA 样品；若酶切产物仅含有 1134bp 的酶切片段，说明 CELI 酶无法检测出待酶切 DNA 样品中的点突 DNA 样品； 0082 若酶切产物 a2含有 1134bp、 389bp 和 745bp 的酶切片段，说明 CELI 酶可以有效的检测出待酶切 DNA 。

32、样品中的点突 DNA 样品；若酶切产物仅含有 1134bp 的酶切片段，说明 CELI 酶无法检测出待酶切 DNA 样品中的点突 DNA 样品； 0083 若酶切产物 a3含有 1134bp、 563bp 和 571bp 的酶切片段，说明 CELI 酶可以有效的检测出待酶切 DNA 样品中的点突 DNA 样品；若酶切产物仅含有 1134bp 的酶切片段，说明 CELI 酶无法检测出待酶切 DNA 样品中的点突 DNA 样品； 0084 若酶切产物 a4含有 1134bp、 495bp 和 639bp 的酶切片段，说明 CELI 酶可以有效的检测出待酶切 DNA 样品中的。

33、点突 DNA 样品；若酶切产物仅含有 1134bp 的酶切片段，说明 CELI 酶无法检测出待酶切 DNA 样品中的点突 DNA 样品。 0085 3、毛细管电泳 0086 酶切反应结束后立即加入 2ul 的 0.225M 的 EDTA 终止反应 (15ul 体系应加入 3ul EDTA)，再补入 91ul 超纯水稀释样品，可直接上机 (FS 96，美国 AATI 公司 ) 进行毛细管电泳，毛细管电泳条件如表 1 所示。 0087 表 1、毛细管电泳条件说明书 CN 106867980 A 7 6/8 页 8 0088 0089 0090 4、 Ca2+对 CELI 。

34、酶酶切效果的影响 0091 酶切产物 a0经用毛细管分离的结果如图 1 所示 ( 其中泳道 1 和泳道 2 的酶切缓冲液为组 2 ；其余泳道的酶切缓冲液为组 1)。从图 1 可以看出：酶切产物分离得到 791bp、 544bp 和 247bp 的酶切片段，与目的酶切片段中错配位点一致，且浓度范围在 0.5-30mM 的 Ca2+的酶切效果好于 Mg 2+的酶切效果，说明浓度范围在 0.5-30mM 的 Ca2+的酶切效果均可提高 CELI 酶切活性。 0092 PCR 产物未纯化和纯化的酶切产物 a1、酶切产物 a2、酶切产物 a3、酶切产物 a4经用毛细管分离的结果分。

35、别如图 2 和图 3 所示：其中图 2 和图 3 的 1-8 泳道的酶切缓冲液为组 2 ；图 2 和图 3 的 9-12 泳道的酶切缓冲液为组 3。从图 2 和图 3 可以看出：酶切产物 a1含有 1134bp、 503bp 和 631bp 的酶切片段，酶切产物 a2含有 1134bp、 389bp 和 745bp 的酶切片段，酶切产物 a3含有 1134bp、 563bp 和 571bp 的酶切片段，酶切产物 a 4含有 1134bp、 495bp 和639bp的酶切片段，与目的酶切片段中错配位点一致，说明在PCR产物未纯化时Ca2+酶切效果要明显高于PCR产物纯化。

36、时Mg2+酶切效果，说明产物无需纯化，添加Ca 2+即可得到很好的酶切效果，节约了纯化成本和时间。 0093 实施例 2、 Ca2+在提高 CELI 酶活性中的应用 0094 一、待酶切 DNA 样品的制备 0095 1、 DNA 的合成 0096 人工合成序列表中序列 1 所示的 DNA 分子 ( 野生型 DNA 分子 ) 和序列表中序列 2 所示的 DNA 分子 ( 突变型 DNA 分子 )，序列 2 为将序列 1 的第 544 位核苷酸由 G 突变为 A 后得到的 DNA 分子。 0097 将序列 2 所示的 DNA 分子和序列 1 所示的 DNA 分子按 1:1 比例 (。

37、质量比 ) 混合，得到待 PCR 扩增的模板 1( 待 PCR 扩增的模板 1 的浓度， 150ng/ul)。 0098 将序列 2 所示的 DNA 分子和序列 1 所示的 DNA 分子按 1:12 比例 ( 质量比 ) 混合，得到待 PCR 扩增的模板 2( 待 PCR 扩增的模板 2 的浓度， 150ng/ul)。 0099 将序列 2 所示的 DNA 分子和序列 1 所示的 DNA 分子按 1:24 比例 ( 质量比 ) 混合，得到待 PCR 扩增的模板 3( 待 PCR 扩增的模板 3 的浓度， 150ng/ul)。 0100 将序列 2 所示的 DNA 分子和序列 1 所示的。

38、 DNA 分子按 1:48 比例 ( 质量比 ) 混合，得到待 PCR 扩增的模板 4( 待 PCR 扩增的模板 4 的浓度， 150ng/ul)。 0101 2、 PCR 扩增 0102 分别以上述待PCR扩增的模板1、待PCR扩增的模板2、待PCR扩增的模板3、待PCR 说明书 CN 106867980 A 8 7/8 页 9 扩增的模板 4 为模板，采用 F 和 R 引物对上述模板进行 PCR 扩增，扩增至 45 个热循环，然后进行99变性10min，降温至70，每个循环降低0.3， 69个循环结束，分别得到PCR扩增产物 1 即待酶切 DNA 样品 1、 P。

39、CR 扩增产物 2 即待酶切 DNA 样品 2、 PCR 扩增产物 3 即待酶切 DNA 样品 3、 PCR 扩增产物 4 即待酶切 DNA 样品 4。待扩增完毕后，用 1琼脂糖凝胶检测，检测条带是否特异，条带亮度是否达到要求。若条带较暗或不特异，需要重新扩增。引物序列如下： 0103 F ： ATGCACTTAACAGAGGAAATCTTG ； 0104 R ： TTACTTAATACTTTTCTTGTAGCCTTTA。 0105 以待 PCR 扩增的模板 1 为模板， PCR 扩增得到大小为 791bp 的 PCR 扩增产物 1，对 PCR 扩增产物 1 进行测序。测序结果表。

40、明， PCR 扩增产物 1 含有如序列表中序列 1 所示的 DNA 分子 ( 野生型样品的 DNA) 和将序列表中序列 1 的第 544 位核苷酸由 G 突变为 A 的异源双链 DNA 分子 ( 点突 DNA 样品 1)。 0106 以待 PCR 扩增的模板 2 为模板， PCR 扩增得到大小为 791bp 的 PCR 扩增产物 2，对 PCR 扩增产物 2 进行测序。测序结果表明， PCR 扩增产物 2 含有如序列表中序列 1 所示的 DNA 分子 ( 野生型样品的 DNA) 和大小为 791bp 的将序列表中序列 1 第 544 位核苷酸由 G 突变为 A 的异源双链 DNA 分子。

41、( 点突 DNA 样品 2)。 0107 以待 PCR 扩增的模板 3 为模板， PCR 扩增得到大小为 791bp 的 PCR 扩增产物 3，对 PCR 扩增产物 3 进行测序。测序结果表明， PCR 扩增产物 3 含有如序列表中序列 1 所示的 DNA 分子 ( 野生型样品的 DNA) 和将序列表中序列 3 的第 544 位核苷酸由 G 突变为 A 的异源双链 DNA 分子 ( 点突 DNA 样品 3)。 0108 以待 PCR 扩增的模板 4 为模板， PCR 扩增得到大小为 791bp 的 PCR 扩增产物 4，对 PCR 扩增产物 4 进行测序。测序结果表明， PCR 扩增产物。

42、 4 含有如序列表中序列 1 所示的 DNA 分子 ( 野生型样品的 DNA) 和大小为 791bp 的将序列表中序列 1 第 544 位核苷酸由 G 突变为 A 的异源双链 DNA 分子 ( 点突 DNA 样品 4)。 0109 PCR 扩增体系 (10ul) ： 10 倍 PCR 缓冲液 1.0ul、 dNTP 0.8ul、 Forward primer(10um)0.16ul、 Reverse primer(10um)0.16ul、 DNA 模板 1.0ul、聚合酶 0.1ul、 H20 6.78ul ； 0110 PCR 扩增热循环： 95 2min ； 94 10s，。

43、 60 30s， 72 1-3min ； 72 5min， 12 hold。 0111 异源错配双链形成： 99 10min ； 70 20s， -0.3 per cycle， 70cycles ； 12 10min。 0112 3、 PCR 扩增产物的纯化 0113 PCR 扩增产物的纯化的步骤同实施例 1 中的步骤 3。 0114 二、酶切反应及其效果 0115 1、酶切缓冲液的配置 0116 酶切缓冲液配置分成如下 2 组： 0117 组1 ： 10倍digestion buffer(含有Mg2+缓冲液配置) ： 2ug/ml BSA、 0.02Triton X-100(vol/。

44、vol)、 0.1M KCl、 0.1M HEPES(pH 7.5)、 100mM MgCl2； 0118 组2 ： 10倍digestion buffer(含有Ca2+缓冲液配置) ： 2ug/ml BSA、 0.02Triton 说明书 CN 106867980 A 9 8/8 页 10 X-100(vol/vol)、 0.1M KCl、 0.1M HEPES(pH 7.5)、 50mM CaCl2。 0119 2、酶切反应 0120 分别取2ul的待酶切DNA样品1、待酶切DNA样品2、待酶切DNA样品3、待酶切DNA 样品 4 作为酶切反应底物，分别用上述各组酶切缓冲液进。

45、行酶切反应，分别得到酶切产物 1、酶切产物 2、酶切产物 3、酶切产物 4。 0121 CELI 酶切反应体系 (6ul) ： 10 倍酶切缓冲液 0.6ul、实施例 1 中的步骤二制备的 CELI 酶 (0.3mg/ml)0.2ul、待酶切 DNA 样品 2.0ul、纯水 3.2ul。 0122 若酶切产物含有 791bp、 544bp 和 247bp 的酶切片段，说明 CELI 酶可以有效的检测出待酶切 DNA 样品中的点突 DNA 样品；若酶切产物仅含有 791bp 的酶切片段，说明 CELI 酶未检测出待酶切 DNA 样品中的点突 DNA 样品。 0123 3。

46、、毛细管电泳 0124 酶切反应结束后立即向酶切反应体系中加入 2ul 的 0.225M 的 EDTA 终止反应 (15ul 体系应加入 3ul EDTA)，再补入 91ul 超纯水稀释样品，可直接上机 (FS 96，美国 AATI 公司 ) 进行毛细管电泳，毛细管电泳条件如表 1 所示。 0125 表 1、毛细管电泳条件 0126 0127 4、不同浓度的突变 DNA 分子的 CELI 酶酶切效果 0128 用组 1 的酶切缓冲液进行酶切得到的酶切产物的电泳结果如图 4 的泳道 1-4 所示，用组 2 的酶切缓冲液进行酶切得到的酶切产物的电泳结果如图 4 的泳道 5-8 所。

47、示：从图中可以看出，用含有 Mg2+缓冲液的对含有不同浓度的突变 DNA 分子的待酶切 DNA 样品进行酶切，只有泳道 1( 突变 DNA 分子浓度为 1ng/ul) 中的酶切产物分离得到 791bp、 544bp 和 247bp 的酶切片段，说明用含有 Mg2+缓冲液的进行酶切，仅可以检测出浓度为 1ng/ul 的突变 DNA 分子；用含有 Ca2+缓冲液的对含有不同浓度的突变 DNA 分子的待酶切 DNA 样品进行酶切，泳道 1( 突变 DNA 分子浓度为 1ng/ul)、泳道 1( 突变 DNA 分子浓度为 0.08ng/ul) 和泳道 1( 突变 DNA 。

48、分子浓度为 0.04ng/ul) 中的酶切产物均分离得到 791bp、 544bp 和 247bp 的酶切片段，说明用含有Ca2+缓冲液的进行酶切，可以检测出浓度为0.04ng/ul的突变DNA分子。上述实验结果表明：和 Mg2+相比，含有 Ca 2+的酶切缓冲液可以检测较低浓度的突变 DNA 分子，说明 Ca2+可以促进 CELI 酶的活性。说明书 CN 106867980 A 10 1/8 页 11 0001 序列表 CN 106867980 A 11 2/8 页 12 0002 0003 序列表 CN 106867980 A 12 3/8 页 13 0004。

49、序列表 CN 106867980 A 13 4/8 页 14 0005 序列表 CN 106867980 A 14 5/8 页 15 0006 序列表 CN 106867980 A 15 6/8 页 16 0007 序列表 CN 106867980 A 16 7/8 页 17 0008 序列表 CN 106867980 A 17 8/8 页 18 序列表 CN 106867980 A 18 1/2 页 19 图 1 图 2 说明书附图 CN 106867980 A 19 2/2 页 20 图 3 图 4 图 5 说明书附图 CN 106867980 A 20 。

摘要
申请专利号：	CN201510924543.7	申请日：	20151214
公开号：	CN106867980A	公开日：	20170620
当前法律状态：		有效性：	审查中
法律详情：
IPC分类号：	C12N9/22,C12Q1/68	主分类号：	C12N9/22,C12Q1/68
申请人：	中国科学院植物研究所
发明人：	刘春明,姚学峰
地址：	100093 北京市海淀区香山南辛村20号
优先权：	CN201510924543A
专利代理机构：	北京纪凯知识产权代理有限公司	代理人：	关畅;白艳
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内容摘要

本发明公开了一种Ca2+在提高CELI酶活性中的应用。本发明的Ca2+在酶切缓冲液中的浓度为0.5-50mM。本发明的方法更为灵敏，Ca2+的终浓度在0.5-50mM范围内都可以提高CELI酶检测灵敏度，对低丰度未知突变体的检测，如某癌症基因都有很好的检测效果，特别是TILLING技术平台检测诱变群体时，有明显优势，不仅仅简化了PCR纯化步骤，同时相应地提高了检测分辨率。

权利要求书

1.Ca在促进CELI酶活性中的应用；或Ca在制备CELI酶酶切缓冲液或CELI酶酶切缓冲体系中的应用。 2.含有Ca的CELI酶酶切缓冲液，其特征在于：所述Ca在所述CELI酶酶切缓冲液中的浓度为0.5-50mM。 3.一种酶切反应体系，包括权利要求2所述的含有Ca的CELI酶酶切缓冲液和CELI酶。 4.一种CELI酶试剂盒，为如下(1)或(2)：(1)权利要求2所述的酶切缓冲液；(2)权利要求2所述的酶切缓冲液和CELI酶。 5.权利要求2所述的酶切缓冲液或权利要求3所述的酶切反应体系或权利要求4所述的试剂盒在促进CELI酶切割含有错配位点DNA中的应用。 6.权利要求2所述的酶切缓冲液或权利要求3所述的酶切反应体系或权利要求4所述的试剂盒在检测待测DNA分子是否含有错配位点中的应用。 7.一种用CELI酶酶切含有错配位点DNA的方法，包括如下步骤：将含有错配位点DNA和野生型DNA在权利要求3所述的酶切反应体系中进行酶切反应，实现酶切；所述含有错配位点DNA和野生型DNA的质量比为1：(1-24)。 8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述含有错配位点DNA和野生型DNA的质量比为1:(12-24)。 9.根据权利要求5或6所述的应用或权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述错配位点的错配形式为AA、AG、AC、GG、GT、CC、CT和/或TT。 10.权利要求2所述的酶切缓冲液或权利要求3所述的酶切反应体系或权利要求4所述的试剂盒或权利要求7-9中任一所述的方法在低丰度突变体检测中的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及Ca2+在提高CELI家族酶活性中的应用，属于生物技术领域。

背景技术

CELI酶是一种单链、双链都特异识别的特异性核酸酶，等电点为6.0-6.5，分子量大小为43kDa(Yang et al,1999)；CEL I酶和CEL II酶都具有识别碱基错配的能力，其同源性为49％(见图5)(Yang et al,1999；Pimkin et al,2006)。传统理论认为该酶的催化活性只需要Mg2+和Zn2+(Till et al,2004)，它可以识别八种错配形式的碱基(mismatches)分别为AA、AG、AC、GG、GT、CC、CT和TT(Oleykowski et al,1999；Oleykowski et al,1998)，因此被广泛应用于突变检测领域，如植物TILLING技术平台中(Till et al,2006)。该酶可以特异性切割错配碱基(Bing Yang et al,1999)。通过酶切扩增的目标检测片段并经琼脂糖或毛细管电泳分离检测，一般可方便获得突变位置和大小。因此，它是一种比较方便和经济的检测未知和已知突变位点的手段(Yeung et al,2005)。

目前CELI酶主要提取途径是从芹菜中提取，主要提取方法是通过硫酸铵沉淀法，得到粗提酶液(Till et al,2006)。如果需要得到纯度更高的酶，需要经过刀豆体蛋白A-琼脂糖柱吸附，用alpha-甘露糖苷洗脱，但是得率较低(Yang et al,1999)。因此，大部分TILLING突变体检测实验是用粗提酶来检测的，该粗提酶的主要成分即为CELI(Yang et al,1999；Till et al,2006)。

发明内容

本发明的一个目的是提供Ca2+的新用途。

本发明提供了Ca2+在促进CELI酶活性中的应用。

上述应用中，所述CELI酶活性为切割错配位点。

本发明还提供了Ca2+在制备CELI酶酶切缓冲液或CELI酶酶切缓冲体系中的应用。

本发明的另一个目的是提供含有Ca2+的CELI酶酶切缓冲液。

本发明提供的含有Ca2+的CELI酶酶切缓冲液中，所述Ca2+在所述CELI酶酶切缓冲液中的浓度为0.5-50mM。

上述含有Ca2+的CELI酶酶切缓冲液中，所述Ca2+在所述CELI酶酶切缓冲液中的浓度具体为0.5mM、5mM、10mM、15mM、30mM或50mM；

上述含有Ca2+的CELI酶酶切缓冲液中，所述含有Ca2+的CELI酶酶切缓冲液由Ca2+、BSA、Triton X-100、KCl和HEPES缓冲液组成；所述HEPES缓冲液为浓度为 0.1M、pH值为7.5的HEPES缓冲液。

本发明还有一个目的是提供一种酶切反应体系。

本发明提供的酶切反应体系包括上述含有Ca2+的CELI酶酶切缓冲液和CELI酶。

本发明还有一个目的是提供一种CELI酶试剂盒。

本发明提供的CELI酶试剂盒为如下(1)或(2)：

(1)上述酶切缓冲液；

(2)上述酶切缓冲液和CELI酶。

上述酶切缓冲液或上述酶切反应体系或上述试剂盒在促进CELI酶切割含有错配位点DNA中的应用也属于本发明的保护范围。

上述酶切缓冲液或上述酶切反应体系或上述试剂盒在检测待测DNA分子是否含有错配位点中的应用也属于本发明的应用。

本发明的最后一个目的是提供一种用CELI酶酶切含有错配位点DNA的方法。

本发明提供的用CELI酶酶切含有错配位点DNA的方法包括如下步骤：将含有错配位点DNA和野生型DNA在上述酶切反应体系中进行酶切反应，实现酶切；

所述含有错配位点DNA和野生型DNA的质量比为1：(1-24)。

上述方法中，所述含有错配位点DNA和野生型DNA的质量比为1:(12-24)。

上述应用或方法中，所述错配位点的错配形式为AA、AG、AC、GG、GT、CC、CT和/或TT。

上述酶切缓冲液或上述酶切反应体系或上述试剂盒或上述方法在低丰度未知突变体检测中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明发现了新的催化活性物质Ca2+，通过实验证明：Ca2+可以进一步提高CELI酶活，特别是对低丰度突变的检测。比传统的酶切方法相比，本发明的方法更为灵敏，Ca2+的终浓度在0.5-50mM范围内都可以提高CELI酶的检测灵敏度，对低丰度未知突变体的检测，如某癌症基因都有很好的检测效果，特别是TILLING技术平台检测诱变群体时，有明显优势，不仅仅简化了PCR纯化步骤，同时相应地提高了检测分辨率。

附图说明

图1为Ca2+对CELI酶切效果。

图2为Ca2+对CELI酶切效果。

图3为Ca2+对CELI酶切效果。

图4为Ca2+和Mg2+对CELI酶切效果。

图5为CELI与CELII同源关系比较图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

Mutation Detection Kit-S100试剂盒是美国环球基因公司的产品，产品目录号为706025。

Binding Buffer是美国zymoresearch公司的产品；DNA Clean&ConcentratorTM-25。

实施例1、Ca2+在提高CELI酶活性中的应用

一、待酶切DNA样品的制备

1、DNA的合成

人工合成序列表中序列1所示的DNA分子和序列表中序列2所示的DNA分子，将其按2:1比例(质量比)混合，得到待PCR扩增的DNA a0(浓度为1ng/ul)；序列2为将序列1的第544位核苷酸由G突变为A后得到的DNA分子。

人工合成序列表中序列3所示的DNA分子和序列表中序列4所示的DNA分子，将其按2:1比例(质量比)混合，得到待PCR扩增的DNA a1(浓度为1ng/ul)；序列4为将序列3的第503位核苷酸由G突变为A后得到的DNA分子。

人工合成序列表中序列3所示的DNA分子和序列表中序列5所示的DNA分子，将其按2:1比例(质量比)混合，得到待PCR扩增的DNA a2(浓度为1ng/ul)；序列5为将序列3的第389位核苷酸由G突变为A后得到的DNA分子。

人工合成序列表中序列3所示的DNA分子和序列表中序列6所示的DNA分子，将其按2:1比例(质量比)混合，得到待PCR扩增的DNA a3(浓度为1ng/ul)；序列6为将序列3的第563位核苷酸由C突变为A后得到的DNA分子。

人工合成序列表中序列3所示的DNA分子和序列表中序列7所示的DNA分子，将其按2:1比例(质量比)混合，得到待PCR扩增的DNA a4(浓度为1ng/ul)；序列7为将序列3的第495位核苷酸由T突变为C后得到的DNA分子。

2、PCR扩增

分别以上述待PCR扩增的DNA a0、待PCR扩增的DNA a1、待PCR扩增的DNA a2、待PCR扩增的DNA a3、待PCR扩增的DNA a4为模板，采用F和R引物对所述模板进行PCR扩增，扩增至45个热循环，然后进行99℃变性10min，降温至70℃，每个循环降低0.3℃，69个循环结束，分别得到PCR扩增产物a0即待酶切DNA样品a0、PCR扩增产物a1即待酶切DNA样品a1、PCR扩增产物a2即待酶切DNA样品a2、PCR扩增产物a3即待酶切DNA样品a3、PCR扩增产物a4即待酶切DNA样品a4。待扩增完毕后，用1％琼脂糖凝胶检测，检测条带是否特异，条带亮度是否达到要求。若条带较暗或不特异，需要重新扩增。引物序列如下：

F：ATGCACTTAACAGAGGAAATCTTG；

R：TTACTTAATACTTTTCTTGTAGCCTTTA。

以待PCR扩增的DNA a0为模板，PCR扩增得到大小为791bp的PCR扩增产物a0，对PCR扩增产物a0进行测序。测序结果表明，PCR扩增产物a0含有如序列表中序列1所示的DNA分子和将序列表中序列1的第544位核苷酸由G突变为A的异源双链DNA分子。

以待PCR扩增的DNA a1为模板，PCR扩增得到大小为1134bp的PCR扩增产物a1，对PCR扩增产物a1进行测序。测序结果表明，PCR扩增产物a1含有如序列表中序列2所示的DNA分子(野生型样品的DNA)和大小为1134bp的将序列表中序列2的第503位核苷酸由G突变为A的异源双链DNA分子(点突DNA样品a1)。

以待PCR扩增的DNA a2为模板，PCR扩增得到的大小为1134bp的PCR扩增产物a2，对PCR扩增产物a2进行测序。测序结果表明，PCR扩增产物a2含有如序列表中序列2所示的DNA分子(野生型样品的DNA)和大小为1134bp的将序列表中序列2的第389位核苷酸由G突变为A的异源双链DNA分子(点突DNA样品a2)。

以待PCR扩增的DNA a3为模板，PCR扩增得到的大小为1134bp的PCR扩增产物a3，对PCR扩增产物a3进行测序。测序结果表明，PCR扩增产物a3含有如序列表中序列2所示的DNA分子(野生型样品的DNA)和大小为1134bp的将序列表中序列2的第563位核苷酸由G突变为A的异源双链DNA分子(点突DNA样品a3)。

以待PCR扩增的DNA a4为模板，PCR扩增得到的大小为1134bp的PCR扩增产物a4，对PCR扩增产物a4进行测序。测序结果表明，PCR扩增产物a4含有如序列表中序列2所示的DNA分子(野生型样品的DNA)和大小为1134bp的将序列表中序列2的第495位核苷酸由G突变为A的异源双链DNA分子(点突DNA样品a4)。

PCR扩增体系(10ul)：10倍PCR缓冲液1.0ul、dNTP 0.8ul、Forward primer(10um)0.16ul、Reverse primer(10um)0.16ul、DNA模板1.0ul、聚合酶0.1ul、H20 6.78ul；

PCR扩增热循环：95℃ 2min；94℃ 10s，60℃ 30s，72℃ 1-3min；72℃ 5min，12℃hold。

异源错配双链形成：99℃ 10min；70℃ 20s，-0.3℃ per cycle，70cycles；12℃ 10min。

3、PCR产物纯化

(1)用在1倍体积的PCR扩增产物中加入2倍体积的Binding Buffer，翻转充分混匀(对小于200bp的PCR扩增产物，加入5倍体积的Binding Buffer)得到混合液。

(2)将所述混合液加入DNA纯化柱内(如果溶液体积>700μl，分次转移溶液)；室温放置1-2min或更长时间。

(3)13,000g离心1min，弃废液(目的DNA长度≤500bp时，离心结束后将收集管中的溶液再次转入DNA纯化柱中，离心)。

(4)在DNA纯化柱中加入650ul Wash Buffer，13,000g离心30秒，弃废液，将DNA纯化柱放回收集管。

(5)重复步骤(4)。

(6)13,000g离心3min，以去除柱中残余乙醇。

(7)将纯化柱放入新的离心管中，向柱中加入在60℃预热的30-50μl Elution Buffer或ddH2O，室温放置1-2min或更长时间。

二、CELI酶的制备

1、取10kg芹菜，放入榨汁机中，缓慢榨汁后，避免温度过热，在汁液中加入预冷匀浆缓冲液(含100mM Tris-HCl(pH均为7.7)和100uM PMSF)，得到混合液。

2、将所述混合液4℃下14000rpm离心10min，弃沉淀，取上清液；向上清液中缓慢加入硫酸铵(每100ml上清液加25g硫酸铵)，分10次加入(每100ml体积加入14.4g硫酸胺)，待完全溶解后，低速搅拌30min；14000rpm离心45min，弃沉淀，取上清液。

3、向上清液中缓慢加入硫酸铵至(每100ml上清液加80g硫酸铵)，分十次加入(每100ml体积加入39.0g固体硫酸铵)。低速搅拌30min后，14000rpm离心3min。弃上清，收集沉淀。

4、用1/10体积的缓冲液(0.1M Tris-HC1、100uM PMSF；pH为7.7)溶解步骤3中得到的沉淀，1000rpm离心20min，弃沉淀，取上清。

5、把透析袋剪成适当长度的小段。用1mmol/L EDTA(pH 8.0)中将透析袋煮沸5min。用超纯水清洗透析袋。将透析袋放入10倍蛋白质溶液以上体积的缓冲液(0.1M Tris-HC1、100uM PMSF；pH为7.7)中，透析过夜，透析4-5次至透析液无颜色为止。

6、取40ml透析过的酶液经ConA-Sapharose-4B柱，用缓冲液(0.1M Tris-HC1、100uM PMSF；pH为7.7)冲洗，经alpha-甘露糖苷洗脱后，经缓冲液(0.1M Tris-HC1、100uM PMSF；pH为7.7)透析过夜，得到纯化后的CELI酶(约50mg)，分装-80度保存。

三、酶切反应及其效果

1、酶切缓冲液的配置

酶切缓冲液配置分成如下5组：

组1：10倍digestion buffer(不含有Mg2+缓冲液配置)：2ug/ml BSA、0.02％Triton X-100(vol/vol)、0.1M KCl、0.1M HEPES(pH 7.5)、不同浓度的CaCl2(0mM、0.5mM、5mM、10mM、15mM、30mM、60mM)；

组2：10倍digestion buffer(含有Mg2+缓冲液配置)：2ug/ml BSA、0.02％Triton X-100(vol/vol)、0.1M KCl、0.1M HEPES(pH 7.5)、100mM MgCl2；

组3：10倍digestion buffer(不含有Mg2+缓冲液配置)：2ug/ml BSA、0.02％Triton X-100(vol/vol)、0.1M KCl、0.1M HEPES(pH 7.5)、50mM CaCl2；

2、酶切反应

分别取2ul的待酶切DNA样品a0、待酶切DNA样品a1、待酶切DNA样品a2、待酶切DNA样品a3、待酶切DNA样品a4作为酶切反应底物，用上述各组酶切缓冲液进行酶切反应，得到酶切产物a0、酶切产物a1、酶切产物a2、酶切产物a3、酶切产物a4。

CELI酶切反应体系(6ul)：10倍酶切缓冲液0.6ul、CELI酶(0.3mg/ml)0.2ul、PCR扩增产物2.0ul、纯水3.2ul。

若酶切产物a0含有791bp、544bp和247bp的酶切片段，说明CELI酶可以有效的检测出待酶切DNA样品中的点突DNA样品；若酶切产物仅含有791bp的酶切片段，说明CELI酶无法检测出待酶切DNA样品中的点突DNA样品；

若酶切产物a1含有1134bp、503bp和631bp的酶切片段，说明CELI酶可以有效的检测出待酶切DNA样品中的点突DNA样品；若酶切产物仅含有1134bp的酶切片段，说明CELI酶无法检测出待酶切DNA样品中的点突DNA样品；

若酶切产物a2含有1134bp、389bp和745bp的酶切片段，说明CELI酶可以有效的检测出待酶切DNA样品中的点突DNA样品；若酶切产物仅含有1134bp的酶切片段，说明CELI酶无法检测出待酶切DNA样品中的点突DNA样品；

若酶切产物a3含有1134bp、563bp和571bp的酶切片段，说明CELI酶可以有效的检测出待酶切DNA样品中的点突DNA样品；若酶切产物仅含有1134bp的酶切片段，说明CELI酶无法检测出待酶切DNA样品中的点突DNA样品；

若酶切产物a4含有1134bp、495bp和639bp的酶切片段，说明CELI酶可以有效的检测出待酶切DNA样品中的点突DNA样品；若酶切产物仅含有1134bp的酶切片段，说明CELI酶无法检测出待酶切DNA样品中的点突DNA样品。

3、毛细管电泳

酶切反应结束后立即加入2ul的0.225M的EDTA终止反应(15ul体系应加入3ul EDTA)，再补入91ul超纯水稀释样品，可直接上机(FS 96，美国AATI公司)进行毛细管电泳，毛细管电泳条件如表1所示。

表1、毛细管电泳条件

4、Ca2+对CELI酶酶切效果的影响

酶切产物a0经用毛细管分离的结果如图1所示(其中泳道1和泳道2的酶切缓冲液为组2；其余泳道的酶切缓冲液为组1)。从图1可以看出：酶切产物分离得到791bp、544bp和247bp的酶切片段，与目的酶切片段中错配位点一致，且浓度范围在0.5-30mM的Ca2+的酶切效果好于Mg2+的酶切效果，说明浓度范围在0.5-30mM的Ca2+的酶切效果均可提高CELI酶切活性。

PCR产物未纯化和纯化的酶切产物a1、酶切产物a2、酶切产物a3、酶切产物a4经用毛细管分离的结果分别如图2和图3所示：其中图2和图3的1-8泳道的酶切缓冲液为组2；图2和图3的9-12泳道的酶切缓冲液为组3。从图2和图3可以看出：酶切产物a1含有1134bp、503bp和631bp的酶切片段，酶切产物a2含有1134bp、389bp和745bp的酶切片段，酶切产物a3含有1134bp、563bp和571bp的酶切片段，酶切产物a4含有1134bp、495bp和639bp的酶切片段，与目的酶切片段中错配位点一致，说明在PCR产物未纯化时Ca2+酶切效果要明显高于PCR产物纯化时Mg2+酶切效果，说明产物无需纯化，添加Ca2+即可得到很好的酶切效果，节约了纯化成本和时间。

实施例2、Ca2+在提高CELI酶活性中的应用

一、待酶切DNA样品的制备

1、DNA的合成

人工合成序列表中序列1所示的DNA分子(野生型DNA分子)和序列表中序列2所示的DNA分子(突变型DNA分子)，序列2为将序列1的第544位核苷酸由G突变为A后得到的DNA分子。

将序列2所示的DNA分子和序列1所示的DNA分子按1:1比例(质量比)混合，得到待PCR扩增的模板1(待PCR扩增的模板1的浓度，150ng/ul)。

将序列2所示的DNA分子和序列1所示的DNA分子按1:12比例(质量比)混合，得到待PCR扩增的模板2(待PCR扩增的模板2的浓度，150ng/ul)。

将序列2所示的DNA分子和序列1所示的DNA分子按1:24比例(质量比)混合，得到待PCR扩增的模板3(待PCR扩增的模板3的浓度，150ng/ul)。

将序列2所示的DNA分子和序列1所示的DNA分子按1:48比例(质量比)混合，得到待PCR扩增的模板4(待PCR扩增的模板4的浓度，150ng/ul)。

2、PCR扩增

分别以上述待PCR扩增的模板1、待PCR扩增的模板2、待PCR扩增的模板3、待PCR扩增的模板4为模板，采用F和R引物对上述模板进行PCR扩增，扩增至45个热循环，然后进行99℃变性10min，降温至70℃，每个循环降低0.3℃，69个循环结束，分别得到PCR扩增产物1即待酶切DNA样品1、PCR扩增产物2即待酶切DNA样品2、PCR扩增产物3即待酶切DNA样品3、PCR扩增产物4即待酶切DNA样品4。待扩增完毕后，用1％琼脂糖凝胶检测，检测条带是否特异，条带亮度是否达到要求。若条带较暗或不特异，需要重新扩增。引物序列如下：

F：ATGCACTTAACAGAGGAAATCTTG；

R：TTACTTAATACTTTTCTTGTAGCCTTTA。

以待PCR扩增的模板1为模板，PCR扩增得到大小为791bp的PCR扩增产物1，对PCR扩增产物1进行测序。测序结果表明，PCR扩增产物1含有如序列表中序列1所示的DNA分子(野生型样品的DNA)和将序列表中序列1的第544位核苷酸由G突变为A的异源双链DNA分子(点突DNA样品1)。

以待PCR扩增的模板2为模板，PCR扩增得到大小为791bp的PCR扩增产物2，对PCR扩增产物2进行测序。测序结果表明，PCR扩增产物2含有如序列表中序列1所示的DNA分子(野生型样品的DNA)和大小为791bp的将序列表中序列1第544位核苷酸由G突变为A的异源双链DNA分子(点突DNA样品2)。

以待PCR扩增的模板3为模板，PCR扩增得到大小为791bp的PCR扩增产物3，对PCR扩增产物3进行测序。测序结果表明，PCR扩增产物3含有如序列表中序列1所示的DNA分子(野生型样品的DNA)和将序列表中序列3的第544位核苷酸由G突变为A的异源双链DNA分子(点突DNA样品3)。

以待PCR扩增的模板4为模板，PCR扩增得到大小为791bp的PCR扩增产物4，对PCR扩增产物4进行测序。测序结果表明，PCR扩增产物4含有如序列表中序列1所示的DNA分子(野生型样品的DNA)和大小为791bp的将序列表中序列1第544位核苷酸由G突变为A的异源双链DNA分子(点突DNA样品4)。

PCR扩增体系(10ul)：10倍PCR缓冲液1.0ul、dNTP 0.8ul、Forward primer(10um)0.16ul、Reverse primer(10um)0.16ul、DNA模板1.0ul、聚合酶0.1ul、H20 6.78ul；

PCR扩增热循环：95℃ 2min；94℃ 10s，60℃ 30s，72℃ 1-3min；72℃ 5min，12℃ hold。

异源错配双链形成：99℃ 10min；70℃ 20s，-0.3℃ per cycle，70cycles；12℃ 10min。

3、PCR扩增产物的纯化

PCR扩增产物的纯化的步骤同实施例1中的步骤3。

二、酶切反应及其效果

1、酶切缓冲液的配置

酶切缓冲液配置分成如下2组：

组1：10倍digestion buffer(含有Mg2+缓冲液配置)：2ug/ml BSA、0.02％Triton X-100(vol/vol)、0.1M KCl、0.1M HEPES(pH 7.5)、100mM MgCl2；

组2：10倍digestion buffer(含有Ca2+缓冲液配置)：2ug/ml BSA、0.02％Triton X-100(vol/vol)、0.1M KCl、0.1M HEPES(pH 7.5)、50mM CaCl2。

2、酶切反应

分别取2ul的待酶切DNA样品1、待酶切DNA样品2、待酶切DNA样品3、待酶切DNA样品4作为酶切反应底物，分别用上述各组酶切缓冲液进行酶切反应，分别得到酶切产物1、酶切产物2、酶切产物3、酶切产物4。

CELI酶切反应体系(6ul)：10倍酶切缓冲液0.6ul、实施例1中的步骤二制备的CELI酶(0.3mg/ml)0.2ul、待酶切DNA样品2.0ul、纯水3.2ul。

若酶切产物含有791bp、544bp和247bp的酶切片段，说明CELI酶可以有效的检测出待酶切DNA样品中的点突DNA样品；若酶切产物仅含有791bp的酶切片段，说明CELI酶未检测出待酶切DNA样品中的点突DNA样品。

3、毛细管电泳

酶切反应结束后立即向酶切反应体系中加入2ul的0.225M的EDTA终止反应(15ul体系应加入3ul EDTA)，再补入91ul超纯水稀释样品，可直接上机(FS 96，美国AATI公司)进行毛细管电泳，毛细管电泳条件如表1所示。

表1、毛细管电泳条件

4、不同浓度的突变DNA分子的CELI酶酶切效果

用组1的酶切缓冲液进行酶切得到的酶切产物的电泳结果如图4的泳道1-4所示，用组2的酶切缓冲液进行酶切得到的酶切产物的电泳结果如图4的泳道5-8所示：从图中可以看出，用含有Mg2+缓冲液的对含有不同浓度的突变DNA分子的待酶切DNA样品进行酶切，只有泳道1(突变DNA分子浓度为1ng/ul)中的酶切产物分离得到791bp、544bp和247bp的酶切片段，说明用含有Mg2+缓冲液的进行酶切，仅可以检测出浓度为1ng/ul的突变DNA分子；用含有Ca2+缓冲液的对含有不同浓度的突变DNA分子的待酶切DNA样品进行酶切，泳道1(突变DNA分子浓度为1ng/ul)、泳道1(突变DNA分子浓度为0.08ng/ul)和泳道1(突变DNA分子浓度为0.04ng/ul)中的酶切产物均分离得到791bp、544bp和247bp的酶切片段，说明用含有Ca2+缓冲液的进行酶切，可以检测出浓度为0.04ng/ul的突变DNA分子。上述实验结果表明：和Mg2+相比，含有Ca2+的酶切缓冲液可以检测较低浓度的突变DNA分子，说明Ca2+可以促进CELI酶的活性。