具耐热性的果胶酶.pdf

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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510738362.5 (22)申请日 2015.11.02 C12N 9/88(2006.01) C12N 15/54(2006.01) C12N 15/63(2006.01) (71)申请人 东莞泛亚太生物科技有限公司 地址 523808 广东省东莞市松山湖科技产业 园区工业北路 3 号 (72)发明人 郭瑞庭 郑雅珊 黄建文 吴姿慧 赖惠琳 林正言 柯宗佑 (74)专利代理机构 隆天知识产权代理有限公司 72003 代理人 付文川 王芝艳 (54) 发明名称 具耐热性的果胶酶 (57) 摘要 本申请涉及一种具耐热性的果胶酶， 。

2、其 氨 基 酸 序 列 为 将 序 列 编 号 2 第 181 位 置 的 丝 氨 酸 (serine) 用 一 氨 基 酸 取 代 修 饰 的 序 列， 其中用于取代的该氨基酸选自苯丙氨酸 (phenylalanine)、 甲硫氨酸 (methionine) 以及 亮氨酸 (leucine)。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 序列表9页 附图4页 CN 106636045 A 2017.05.10 CN 106636045 A 1/1 页 2 1.一种果胶酶， 其氨基酸序列为将序列编号 2 第 181 位置的丝氨。

3、酸用一氨基酸取代修 饰的序列， 其中用于取代的该氨基酸选自苯丙氨酸、 甲硫氨酸以及亮氨酸。 2.如权利要求 1 所述的果胶酶， 其中编码该序列编号 2 的基因是从坎皮纳斯类芽孢杆 菌 (Paenibacillus campinasensis BL-11) 所分离出来的 PcPEL 基因。 3.如权利要求 1 所述的果胶酶， 其中该果胶酶是果胶裂解酶。 4.如权利要求 1 所述的果胶酶， 其中该果胶酶的氨基酸序列是序列编号 4 的氨基酸序 列。 5.如权利要求 1 所述的果胶酶， 其中该果胶酶的氨基酸序列是序列编号 6 的氨基酸序 列。 6.如权利要求 1 所述的果胶酶， 其中该果胶酶的氨基酸序。

4、列是序列编号 8 的氨基酸序 列。 7.一种编码如权利要求 1 所述的果胶酶的核酸分子。 8.一种重组质粒， 其包含如权利要求 7 所述的核酸分子。 9.一种如权利要求 1-6 任一项所述的果胶酶的用途， 其用于制造食品、 制酒、 造纸、 纺 织或制造饲料。 权 利 要 求 书 CN 106636045 A 2 1/4 页 3 具耐热性的果胶酶 技术领域 0001 本申请涉及一种果胶酶， 尤指一种具耐热性的果胶酶。 背景技术 0002 果胶 (Pectin) 是植物细胞壁中主要的组成之一， 绝大部分存在于初生细胞壁 (primary cell wall)以及中胶层(middle lamella。

5、)。 果胶物质是种复杂的异质多醣， 主要 是以 D- 半乳糖醛酸 (D-galacturonic acid)， 经由 -1,4- 糖苷键结组成其骨干。而此骨 干可被进一步地修饰， 像是甲基酯化 (methyl-esterification) 或取代成乙酰基 (acetyl groups)。果胶大致上可被分成三大类 ： 同质半乳醛酸聚醣 (homogalacturonan)、 木糖半乳 醛酸聚醣 (xylogalacturonan) 以及鼠李半乳醛酸聚醣 (rhamnogalacturonan)。第三种果 胶的结构最为复杂， 其由重复的鼠李糖 - 半乳糖醛酸组成其主链， 且有不同种的糖， 像是半。

6、 乳糖、 木糖以及阿拉伯糖 (arabinose) 形成其支链。 0003 由于这样复杂构成的果胶， 其完整的分解需要依靠好几种不同的果胶酶 (pectinases) 来共同作用。果胶酶在自然界中广泛地存在于许多不同的细菌、 酵 母、 真菌以及植物中， 大致上可分为三大种 ： 果胶水解酶 (hydrolases)、 果胶裂解酶 (lyases) 以及果胶酯酶 (esterases)。在这些果胶酶中， 果胶裂解酶 (pectate lyase ； endopolygalacturonate lyase ； EC 4.2.2.2) 是分解果胶过程中的关键酶种之一。它 可以透过反式消除机制 (tra。

7、nselimination mechanism) 任意地催化半乳醛酸聚糖中的 -1,4- 糖苷键结， 进而生成不饱和半乳醛酸寡糖的产物。 0004 长久以来， 果胶酶已经被广泛应用在食品以及制酒工业上。 近年来， 更延伸应用在 许多不同的工业上， 像是造纸、 纺织以及饲料中。 因为果胶酶在工业上具有极高的经济应用 价值， 许多研究不论是从大自然中筛选新基因或是改造现有的蛋白， 都企图想要找到更适 合于工业应用的果胶酶。 在许多提升工业酶的策略中， 根据蛋白结构分析， 进而逻辑性地设 计突变点是改造蛋白的主要方法之一。 而一个好的工业酶所要具备的理想条件之一就是高 耐热性， 因为高耐热性的酶通常。

8、具有较高的蛋白稳定性以及较佳性能的酶作用力， 故也较 有利于工业应用。 0005 因此， 本申请利用逻辑性的突变设计去增加果胶裂解酶的耐热性， 进而提升它在 工业上的应用价值。 发明内容 0006 本申请的目的在于改造现有果胶裂解酶， 利用结构分析及点突变技术， 有效提升 果胶裂解酶的耐热性， 藉以增加果胶裂解酶的工业应用价值。 0007 为达上述目的， 本申请的广义实施方式提供一种果胶酶， 其氨基酸序列为将序列 编号 2 第 181 位置的丝氨酸 (serine) 以一氨基酸取代修饰的序列， 其中用于取代的该氨基 酸选自苯丙氨酸 (phenylalanine)、 甲硫氨酸 (methioni。

9、ne) 以及亮氨酸 (leucine)。编码 该序列编号2的基因是从坎皮纳斯类芽孢杆菌(Paenibacillus campinasensis BL-11)所 说 明 书 CN 106636045 A 3 2/4 页 4 分离出来的 PcPEL 基因。该果胶酶是果胶裂解酶。 0008 在一个实施方式中， 该果胶酶的氨基酸序列是序列编号 4 的氨基酸序列。 0009 在个一实施方式中， 该果胶酶的氨基酸序列是序列编号 6 的氨基酸序列。 0010 在个一实施方式中， 该果胶酶的氨基酸序列是序列编号 8 的氨基酸序列。 0011 又， 该果胶酶的用途为用于制造食品、 制酒、 造纸、 纺织或制造饲料。

10、。 附图说明 0012 图 1 显示 PcPEL 的核苷酸序列以及氨基酸序列。 0013 图 2 显示 PcPEL 的蛋白结构。 0014 图 3 显示突变引物序列。 0015 图 4 显示 S181F 的核苷酸序列以及氨基酸序列。 0016 图 5 显示 S181M 的核苷酸序列以及氨基酸序列。 0017 图 6 显示 S181L 的核苷酸序列以及氨基酸序列。 0018 图 7 显示 PcPEL 原始蛋白及 S181F、 S181M、 S181L 三种突变蛋白的耐热性分析。 具体实施方式 0019 体现本申请特征与优点的一些典型实施例将在后段的说明中详细叙述。 应理解的 是本申请能够在不同的。

11、态样上具有各种的变化， 其均不脱离本申请的范围， 且其中的说明 及图示在本质上用作说明之用， 而非用以限制本申请。 0020 本 申 请 的 果 胶 裂 解 酶 (PcPEL) 是 从 嗜 碱 性 细 菌 坎 皮 纳 斯 类 芽 孢 杆 菌 (Paenibacillus campinasensis BL-11)菌株中所分离出来的基因。 根据先前文献中指出， 该果胶裂解酶的最适活性是在50以及pH 10的条件之下。 为了提升此果胶裂解酶的耐热 性， 本申请欲通过结构分析以及点突变技术(site-directed mutagenesis)对其进行改造。 因此， 本申请利用X-ray结晶学技术去解开。

12、PcPEL的蛋白三级结构， 进而阐明其详细的结构 信息。为了提升 PcPEL 的耐热性， 本申请根据其结构分析挑选位于活性区附近的第 181 个 氨基酸的丝氨酸 (serine)， 利用点突变技术， 分别单一突变成苯丙氨酸 (phenylalanine)、 甲硫氨酸 (methionine) 以及亮氨酸 (leucine)， 因而成功地提高其耐热性， 也进一步地增 加此果胶裂解酶的工业应用价值。 以下将详述本申请改造果胶裂解酶的方法及其所得到的 改良果胶裂解酶蛋白。 0021 首先， PcPEL 基因被构建在 pPICZA 的载体上， 其中如图 1 所示， PcPEL 基因包 含 858 个碱。

13、基 ( 不含终止密码子， 核苷酸序列以序列编号 1 标示 ) 以及 286 个氨基酸 ( 氨 基酸序列以序列编号 2 标示 )。线性化之后的质粒 DNA 接着被转化到毕赤酵母 (Pichia pastoris) 中， 再利用含有 0.1mg/ml zeocin 抗生素的 YPD 平板， 在 30中培养 2 天， 筛选 出成功转化的细胞。接着挑选菌落， 分别接种到 YPD 培养基中增生， 再进一步地将菌分离 出来， 转移到含有 0.5甲醇的 BMMY 培养基内， 进而诱导其目标蛋白的表达。经由离心步 骤， 收集含有表达出的目标蛋白的上清液。 为了后续的蛋白纯化步骤， 本申请利用含有25mM Tr。

14、is ； pH 7.5 的缓冲液进行两次透析。再利用 FPLC 系统以及 DEAE 纯化管柱， 纯化出 PcPEL 蛋白。最后， 为了后续的结晶实验， 纯化的蛋白再浓缩至 10mg/ml 的浓度。 0022 为了利用 X-ray 结晶学技术解析蛋白结构， 必须先得到蛋白晶体。本申请利用座 说 明 书 CN 106636045 A 4 3/4 页 5 滴式蒸气扩散法以及结晶试剂盒筛选出成功结晶的条件， 再进行调整之后， 得到适当的结 晶条件是在 0.1M Bis-Tris ； pH 6.5、 0.2M Lithium sulfate 以及 25 PEG3350 的环境中， 在室温下培养 2 天。。

15、而相位角问题则是通过分子置换法 (molecular replacement) 解开， 经由计算机运算之后， 得到 PcPEL 的蛋白结构。 0023 如图 2 所示， PcPEL 的蛋白结构属于典型 PL10 家族的 (/)3barrel 蛋白折叠。 本申请欲利用增加 PcPEL 蛋白的疏水性作用力 (hydrophobic interaction)， 来进一步提 升其耐热性。通过结构分析， 本申请挑选位于活性区附近第 181 位置的丝氨酸 (serine) 分 别突变成苯丙氨酸 (phenylalanine)、 甲硫氨酸 (methionine) 以及亮氨酸 (leucine)， 亦 即，。

16、 本申请利用点突变技术获得 PcPEL 的三种突变基因， 分别是 S181F、 S181M 以及 S181L。 0024 突变方式为利用 PCR 分别取得三种突变基因， 而当中所用到的突变引物列在图 3。 原始的模板 DNA 则利用限制酶 DpnI 移除掉。突变基因个别送入大肠杆菌内复制放大， 再通 过 DNA 测序， 确认突变的成功与否。最后， 突变基因分别送入毕赤酵母中表达出突变蛋白， 如同前述的蛋白表达步骤。 0025 三种突变基因的核苷酸序列以及氨基酸序列分别如图 4、 图 5 及图 6 所示。图 4 显 示 S181F 的突变序列， 其核苷酸序列以序列编号 3 标示， 氨基酸序列则以。

17、序列编号 4 标示。 图 5 显示 S181M 的突变序列， 其核苷酸序列以序列编号 5 标示， 氨基酸序列则以序列编号 6 标示。图 6 显示 S181L 的突变序列， 其核苷酸序列以序列编号 7 标示， 氨基酸序列则以序列 编号 8 标示。 0026 果胶裂解酶的活性测定是利用检测聚半乳糖醛酸(polygalacturonic acid)底物 在 C4 与 C5 之间的分解， 进而产生的不饱和键结， 被波长 235nm 所吸收。大致而言， 反应混 合物包含了0.5ml适当稀释的蛋白样本以及0.2聚半乳糖醛酸作为底物， 在含有0.6mM氯 化钙的 pH 9.4glycine-NaOH 缓冲液。

18、环境中于 45下作用 10 分钟。接着， 加入 3ml 30mM 的 磷酸以停止反应。最后， 检测在 OD235nm 波长的吸收值， 进而求出果胶裂解酶的活性。 0027 至于耐热性分析方面， 突变蛋白以及原始蛋白分别在 65、 68、 70以及 75 下作用 2 分钟。接着放在冰上 5 分钟降温， 再置于室温下 5 分钟回复。最后， 再检测高温处 理过的样本所剩余的酶活性。 0028 图 7 显示 PcPEL 原始蛋白及 S181F、 S181M、 S181L 三种突变蛋白的耐热性分析， 其 中未热处理的样本的果胶裂解酶活性设定为 100。由图 7 可知， S181F、 S181M 及 S1。

19、81L 三种突变蛋白的耐热性均高于原始蛋白 (wild type)。相较于未热处理的蛋白， 原始蛋白 在 68高温处理之下所剩余的活性还有约 50， 而三种突变蛋白在相同 68高温处理之 下则保留了 80的活性。此外， 在 70高温处理之下， 原始蛋白几乎失去全部的活性， 然而 三种突变蛋白还保留了约 40的活性。以上结果显示出， 这三种突变蛋白 S181F、 S181M 及 S181L 相较于原始蛋白， 具有较高的耐热性， 也表示具有较大潜力的工业应用价值。 0029 综上所述， 为了增加果胶裂解酶的工业应用价值， 本申请利用逻辑性的突变设计 去增加果胶裂解酶的耐热性， 根据 PcPEL 的。

20、结构分析并利用点突变技术， 将位于活性区附 近的第 181 个位置的丝氨酸 (serine) 分别单一突变成苯丙氨酸 (phenylalanine)、 甲硫氨 酸 (methionine) 以及亮氨酸 (leucine)， 而得到 S181F、 S181M 及 S181L 三种突变蛋白。由 耐热性分析结果可知， S181F、 S181M 及 S181L 三种突变蛋白的耐热性均高于原始蛋白， 故本 申请成功地设计出较具耐热性的 PcPEL 突变蛋白， 不但提高果胶裂解酶的耐热性， 也进一 说 明 书 CN 106636045 A 5 4/4 页 6 步地增加此果胶裂解酶的工业应用价值。 0030。

21、 尽管本发明已利用上述实施例进行了详细叙述而可由本领域技术人员任施匠思 而进行各种修饰， 但其均不超出如所附的申请专利范围所要保护的内容。 说 明 书 CN 106636045 A 6 1/9 页 7 0001 0002 序 列 表 CN 106636045 A 7 2/9 页 8 0003 序 列 表 CN 106636045 A 8 3/9 页 9 0004 序 列 表 CN 106636045 A 9 4/9 页 10 0005 序 列 表 CN 106636045 A 10 5/9 页 11 0006 序 列 表 CN 106636045 A 11 6/9 页 12 0007 序 列 。

22、表 CN 106636045 A 12 7/9 页 13 0008 序 列 表 CN 106636045 A 13 8/9 页 14 0009 序 列 表 CN 106636045 A 14 9/9 页 15 序 列 表 CN 106636045 A 15 1/4 页 16 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 106636045 A 16 2/4 页 17 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 106636045 A 17 3/4 页 18 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 106636045 A 18 4/4 页 19 图 7 说 明 书 附 图 CN 106636045 A 19 。