兔小肠上皮细胞系及其制备方法.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 102212504 B (45)授权公告日 2012.12.19 CN 102212504 B *CN102212504B* (21)申请号 201110114926.X (22)申请日 2011.05.05 No.4784 2011.04.26 C12N 5/071(2010.01) C12R 1/91(2006.01) (73)专利权人 吉林农业大学 地址 130118 吉林省长春市净月开发区新城 大街 2888 号 (72)发明人 车东升 刘飞飞 穆成龙 孙泽威 秦贵信 杨连玉 张海全 赵元 鲍男 赵晗 程传锋 卢加成 张春 (74)专利代理机构 长春市东师专利。

2、事务所 22202 代理人 修雪静 (54) 发明名称 兔小肠上皮细胞系及其制备方法 (57) 摘要 本发明提供的兔小肠上皮细胞系， 取新生未 哺乳仔兔回肠段， 机械剪碎， 胶原酶 IV 消化， 获得 原代培养的兔小肠上皮细胞， 联合应用相差消化 法和相差贴壁法对兔小肠上皮细胞进行初步 ； 然 后应用单克隆方法进一步纯化， 得到的细胞株生 长状态良好， 稳定 ； 细胞形状规则， 成铺路石状， 角蛋白 8 鉴定结果为阳性 ； 经过继代培养， 筛选获 得的一株细胞系， 继代培养一直稳定。兔小肠上 皮细胞系， 来源于新生未哺乳的日本大耳白兔回 肠段， 保藏编号 ： CGMCC No.4784 ； 可。

3、用于肠道内 营养物质吸收通路， 抗营养物质的作用， 微生态营 养， 细胞间的信号转导以及隐窝 - 绒毛系统中各 种细胞增殖和分化机制等的研究。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 审查员 高宇 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 2 页 1/1 页 2 1. 兔小肠上皮细胞系， 其特征在于 ： 它来源于新生未哺乳日本大耳白兔回肠， 保藏编 号 ： CGMCC No.4784。 权 利 要 求 书 CN 102212504 B 2 1/3 页 3 兔小肠上皮细胞系及其制备方法。

4、 技术领域 0001 本发明属生物技术领域， 确切地说是兔小肠上皮细胞系及其制备方法。 背景技术 0002 小肠是体内营养物质选择性消化吸收的重要部位， 整个胃肠道的吸收 90发生在 小肠。 小肠粘膜上皮是高度动力学系统， 反映了重要的生物学现象， 如细胞的增殖、 迁移、 分 化和凋亡等。小肠上皮细胞 (Intestinal epithelial cells， IEC) 是肠道消化吸收的专 职细胞， 维持着整个绒毛上皮的代谢更新。 由于小肠粘膜上皮细胞表面密集大量的微绒毛， 有利于酶的活动及营养物质的吸收 ； 除此以外 IEC 还主要参与了肠道内外分泌和免疫屏障 等功能。肠上皮细胞是研究细胞增。

5、殖和分化调控机制及药物的转运和代谢的理想模型。因 此， 体外培养小肠上皮细胞对于研究 IEC 的生理功能、 营养物质的消化吸收机制、 药物作用 下的病理及生理改变都具有重要意义。 0003 目前， 尽管人和家禽小肠上皮细胞的培养已经获得成功， 但是国内未见有关兔肠 道细胞培养的详细报道， 国外对兔肠上皮细胞分离培养的研究也较少， 主要是关于结肠上 皮细胞的培养， 该细胞的转运特性， 酶的表达以及跨膜电阻等指标相对更能反映结肠细胞 而非小肠细胞。 发明内容 0004 本发明的目的是提供兔小肠上皮细胞系， 建立兔小肠上皮细胞体外培养模型， 用 于体外研究兔小肠营养机制及抗营养机制的研究。 0005。

6、 兔小肠上皮细胞系， 它来源于新生未哺乳日本大耳白仔兔回肠， 保藏编号 ： CGMCC No.4784。 0006 兔小肠上皮细胞系的制备方法 ： 0007 1) 取新生未哺乳日本大耳白仔兔断颈处死， 置于 75酒精中浸泡消毒 5min， 无菌 剖开腹腔， 取出回肠段并去除周边结缔组织， PBS 洗涤数次， 以除去肠内容物 ； 纵向剖开肠 道， 用 PBS 洗涤数次， 将肠段剪碎， 400g 离心 5min。弃上清， 胶原酶 IV 消化液重悬沉淀并转 移到 6 孔培养板内， 37， 饱和湿度， 5 CO2环境孵育过夜， 500g 离心 5min ； 弃上清， PBS 洗 涤 3 次， 细胞生长。

7、培养基 (DMEM/F12+5 FBS) 重悬细胞和组织， 并移至 6 孔板中 ； 37， 5 CO2， 饱和湿度环境培养 ； 0008 2) 采用相差消化法和相差贴壁法相结合的方法， 在细胞传代时先用胰酶消化后在 倒置显微镜下观察， 当大部分成纤维细胞变小漂浮上来， 吸去培养液， 用 PBS 清洗后再次用 胰酶 消化， 此时消化下来的细胞大部分是小肠上皮细胞 ； 在单细胞悬液接种后 1.5h 后将 上清转移到新的培养瓶中， 此瓶中大部分为上皮细胞 ； 如此反复几次， 以去除成纤维细胞， 得到纯化的兔小肠上皮细胞 ； 然后通过单克隆方式对上述纯化细胞进一步纯化。 0009 本发明提供的兔小肠上。

8、皮细胞系， 取新生未哺乳仔兔回肠段， 机械剪碎， 胶原酶 IV 消化， 获得原代培养的兔小肠上皮细胞， 联合应用相差消化法和相差贴壁法对兔小肠上皮 说 明 书 CN 102212504 B 3 2/3 页 4 细胞进行初步 ； 然后应用单克隆方法进一步纯化， 得到的细胞株生长状态良好， 稳定 ； 细胞 形状规则， 成铺路石状， 角蛋白 8 鉴定结果为阳性 ； 经过继代培养， 筛选获得的一株细胞系， 继代培养一直稳定。 免小肠上皮细胞系， 来源于新生未哺乳的日本大耳白兔回肠段， 保藏编 号 ： CGMCCNo.4784。 0010 小肠是营养物质消化吸收的主要场所， 小肠上皮细胞是吸收营养物质的。

9、主要功能 性细胞， 兔小肠上皮细胞体外培养模型的建立， 可用于肠道内营养物质吸收通路， 抗营养物 质的作用， 微生态营养， 细胞间的信号转导以及隐窝 - 绒毛系统中各种细胞增殖和分化机 制等的研究。 附图说明 0011 图 1 为胶原酶消化法分离得到的 IEC 照片 (100) ； 0012 图 2 为成纤维细胞与上皮细胞混杂生长照片 (100) ； 0013 图 3 为纯化的兔 IEC 照片 (100) ； 0014 图 4 为纯化的兔 IEC 照片 (400) ； 0015 图 5 为角蛋白 8 抗体鉴定阳性照片 (400) ； 0016 图 6 为角蛋白 8 抗体阴性对照片 (400) 。

10、； 0017 图 7 为原代培养新生仔兔 IEC 生长曲线图。 具体实施方式 0018 实施例 1 0019 实验动物新生未哺乳的日本大耳白兔， 购于吉林大学实验动物中心。 0020 仪器及试剂 0021 二氧化碳培养箱 (SELECTA， 西班牙 )， 倒置显微镜 (Olympus， 日本 )， 超净台 (SANYO， 日本 )， 高压蒸汽灭菌锅 (SANYO， 日本 )， 鼓风干燥箱 ( 上海申贤恒温设备厂 )， 96 孔细胞培养板 (COSTAR)DMEM/F12 培养基 (GIBCO)， 胎牛血清 (PAA)， 细胞角蛋白 8 单克隆 抗体， DAB 显色试剂盒购自武汉博士德公司， 谷。

11、氨酰胺， 胰蛋白酶均为 AMRESCO 产品， 胶原酶 IV， 青霉素， 链霉素均为 Sigma 产品。 0022 1) 兔 IEC 分离及培养 0023 新生未哺乳仔兔断颈处死， 置于 75酒精中浸泡消毒 5min， 无菌剖开腹腔， 取出 小肠回肠段并去除周边结缔组织， PBS 洗涤数次， 以除去肠内容物 ； 纵向剖开肠道， 用 PBS 洗 涤数次， 将肠段剪碎， 400g 离心 5min。弃上清， 胶原酶 IV 消化液重悬沉淀并转移到 6 孔培 养板内， 37， 饱和湿度， 5 CO2环境孵育过夜， 500g 离心 5min， 弃上清， PBS 洗涤 3 次， 细胞 生长培养基 (DMEM。

12、/F12+5 FBS) 重悬细胞和组织， 并移至 6 孔板中。37， 5 CO2， 饱和湿 度环境培养。成纤维细胞与上皮细胞混杂生长显微镜 (100) 下照片， 见图 2。 0024 2) 兔 IEC 的纯化 0025 采用相差消化法和相差贴壁法相结合的方法， 在细胞传代时先用胰酶消化后在倒 置显微镜下观察， 当大部分成纤维细胞变小漂浮上来， 吸去培养液， 用 PBS 清洗后再次用胰 酶消化， 此时消化下来的细胞大部分是小肠上皮细胞 ； 在单细胞悬液接种后 1.5h 后将上清 转移到新的培养瓶中， 此瓶中大部分为上皮细胞。如此反复几次， 以去除成纤维细胞， 得到 说 明 书 CN 102212。

13、504 B 4 3/3 页 5 纯化的小肠上皮细胞。在倒置显微镜下观察细胞在 2-3d 贴壁并有少量迁出， 6-8d 明显增 殖， 见图1， 9-11d细胞汇合成片。 纯化的IEC生长状态如图3， 上皮细胞呈多角形或卵圆形， 细胞紧密连接， 边界清晰。 0026 3) 单克隆继代筛选 0027 取初步纯化的细胞， 吸去培养液， 用 PBS 清洗后再次用胰酶消化， 细胞变圆时加入 生长培养基， 轻轻吹打， 使细胞脱落。取适量细胞悬液进行细胞计数。调整细胞浓度为 103 个 /ml。并用有限稀释法在 96 孔板中梯度稀释。直到获得单个细胞为止。37、 5 CO2、 饱和湿度培养并定期观察。选择单细。

14、胞生长的孔继续培养。获得一株单细胞生长集落， 并 进行继代培养。 0028 继代培养基组成 ： DMEM/F12+5 fetal bovine serum ； pH 7.04 ； 37。 0029 经继代培养后， 获得 1 株 (RIEC-311)， 经传代培养 50 代后生长状态仍然良好、 稳 定、 分裂速度快， 没发现退化和癌变现象， 照片如图 4， 并于 2011 年 04 月 26 日， 送交中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏， 保藏中心登记入册编号 ： CGMCC No.4784。 保藏单位地址 ： 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号中国科学院微生物研究所。 003。

15、0 实施例 2 采用 MTT 法进行生长曲线的测定。 0031 将生长状况良好的 IEC 悬液接种于 96 孔细胞培养板中， 接种密度为 1105个 / mL， 每孔 200L， 每天 6 个重复， 连续测定 7 天。每天向待测的每孔细胞中加入 20LMTT 溶 液， 继续培养 4h 后终止培养， 吸除培养液， 每孔加入 150LDMSO 震荡 10min， 用酶联免疫检 测仪测定 OD570值。空白调零孔中只加培养液， 不加细胞。IEC 生长曲线见图 7. 0032 实施例 3 细胞角蛋白 8 单克隆抗体鉴定 0033 将细胞爬片放入 4的多聚甲醛固定 1h， 然后 PBST 漂洗 3 次，。

16、 每次 5min。用柠 檬酸修复液修复 10min， 95， 3过氧化氢的水溶液处理 10min， 以消除内源性的过氧化物 酶， BSA封闭30min， 蒸馏水漂洗3次， 每次5min， 加入抗角蛋白抗体孵育30min。 加入羊抗鼠 IgG 抗体， 37孵育 30min。再加入显色剂， 显色 10min。其中每步骤结束后都用 PBST 漂洗 3 次， 每次 5min。纯化 IEC 用细胞角蛋白 8 单克隆抗体鉴定， 结果呈现阳性， 见图 5， 细胞呈 褐色排列， 该结果显示所获得的细胞是小肠上皮细胞。阴性对照组 IEC 没被染色， 见图 6。 说 明 书 CN 102212504 B 5 1/2 页 6 图 1 图 2 图 3 图 4 图 5图 6 说 明 书 附 图 CN 102212504 B 6 2/2 页 7 图 7 说 明 书 附 图 CN 102212504 B 7 。