技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体属于微生物快速检测领域，尤其涉及一种厌氧菌测试片及其制作方法。
背景技术
目前，我国厌氧菌检测主要采用国标法，接种好的样品于厌氧箱或者厌氧盒中培养。此方法需要检测者做大量的准备工作，包括刷洗器皿、配制培养基、灭菌、处置废弃物等，且对仪器设备要求高，需要厌氧设备进行培养，此外还对操作者的技能、经验有较高要求。由于检测环节多，易污染，检测结果的准确性不易控制。
测试片以其制作工艺简单，操作简便，结果准确，检测时间短等优点赢得了广大检测人员的青睐。测试片不需要做实验前的准备工作，节省了劳动力。直接吸取样液滴加于测试片上培养检测，省去生化鉴定环节，对操作者要求低，结果重复性好。
目前市场上的厌氧菌测试片只有美国3M公司的乳酸菌测试片，一种是6406菌落总数测试片用于乳酸菌测试，但需要检测者事先准备MRS培养液作为稀释液，且需要厌氧培养；另一种是2016年8月推出的6461乳酸菌测试片，此测试片在培养基中添加还原剂，不需要厌氧设备，但准确性与常规相比差距较大，已于2016年年底停止销售。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种厌氧菌测试片及其制作方法。
本发明提供的厌氧菌测试片，该厌氧菌测试片包括粘附有吸氧剂的吸氧薄膜和覆盖在所述吸氧薄膜上的粘附有显色培养体系的培养薄膜。
所述吸氧薄膜的材质由防水不透气胶带，吸氧剂和防水透气胶带组成。
粘附有吸氧剂的吸氧薄膜按照包括如下步骤的方法制备：将吸氧剂粘附到防水不透气胶带的胶面，再将防水透气胶带粘附在吸氧剂的表面，形成粘附有吸氧剂的吸氧薄膜。
胶带的胶面的胶为聚丙烯酸压敏胶。
粘附有显色培养体系的培养薄膜的材质由显色培养基，冷水可溶性凝胶和防水不透气胶带组成。
粘附有显色培养体系的培养薄膜按照包括如下步骤的方法制备：将冷水可溶性凝胶和微生物显色培养基混合后，得到显色培养体系，再将所述显色培养体系粘附到所述防水不透气胶带的表面，形成粘附有显色培养体系的培养薄膜。
胶带的胶面的胶为聚丙烯酸压敏胶。
所述吸氧薄膜防水透气胶带面一侧边和所述培养薄膜粘附有显色培养体系面的一侧边粘合，可以通过聚丙烯酸压敏胶粘合。
上述吸氧薄膜中，所述防水不透气胶带为PET胶带；
所述PET胶带厚度为0.10mm-0.50mm；
所述PET胶带为7.0-10.0cm×8.0-11.0cm的长方形；
所述防水透气胶带为PVC胶带；
所述PVC胶带厚度为0.03mm-0.10mm；
所述PVC胶带为7.0-10.0cm×8.0-11.0cm的长方形。
上述吸氧薄膜中，所述吸氧剂为铁粉；
所述铁粉目数为120目-200目。
上述培养薄膜中，所述防水不透气胶带为PET胶带；
所述培养薄膜中PET胶带厚度、宽度同吸氧薄膜中PET胶带，长度长于吸氧薄膜中PET胶带0.3cm-0.5cm。
上述培养薄膜中，所述微生物显色培养基和所述冷水可溶性凝胶的质量比为1:1-3。
上述厌氧菌测试片中，所述微生物显色培养基为乳酸菌显色培养基、双歧杆菌显色培养基、产气荚膜梭菌显色培养基或肉毒梭菌显色培养基。
在本发明的实施例中，采用的微生物显色培养基为乳酸菌显色培养基，其由MRS培养基和显色物TTC组成，所述显色物TTC和所述MRS培养基的质量比具体为0.05:1。MRS培养基由质量分数为18.88%牛肉蛋白粉；18.88%鱼肉汁；9.44%酵母浸出汁粉；37.76%葡萄糖；9.44%醋酸钠；3.78%柠檬酸二胺；0.19%吐温80；1.10%硫酸镁和0.53%硫酸锰组成。
上述培养薄膜中，所述冷水可溶性凝胶为海藻酸钠、黄原胶、瓜尔豆胶或羟甲基纤维素钠中的一种。
本发明的第二个目的是提供制备所述厌氧菌测试片的方法，包括如下步骤：
1）制备粘附有吸氧剂的吸氧薄膜
所述粘附有吸氧剂的吸氧薄膜为将吸氧剂粘附到防水不透气胶带的胶面，再将防水透气胶带粘附在吸氧剂的表面，形成粘附有吸氧剂的吸氧薄膜；
2）制备粘附有显色培养体系的培养薄膜
粘附有显色培养体系的培养薄膜为将冷水可溶性凝胶和微生物显色培养基混合后，得到显色培养体系，再将所述显色培养体系粘附到所述防水不透气胶带的表面，形成粘附有显色培养体系的培养薄膜；
3）组装
将所述吸氧薄膜防水透气胶带面和所述培养薄膜粘附有显色培养体系面在短边一侧粘合，可以通过聚丙烯酸压敏胶粘合。
上述的厌氧菌测试片在检测厌氧菌限度中的应用也是本发明保护的范围；
或，上述的厌氧菌测试片进行厌氧菌计数中的应用也是本发明保护的范围。
上述厌氧菌为乳酸菌，双歧杆菌，产气荚膜梭菌或肉毒梭菌中至少一种。
本发明的第三个目的是提供一种厌氧菌计数的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：
1）揭起上述的厌氧菌测试片的培养薄膜，再将待检微生物样液加在所述测试片的吸氧薄膜上，盖上所述培养薄膜，使样液自由扩散，得到加样后测试片；
2）将所述加样后测试片置于培养箱中需氧培养，对培养后菌落进行计数。
本发明的实验证明，本发明的厌氧菌测试片节省了操作人员清洗器皿、配制培养基、处置废弃物等工作，操作简便、随用随取，产品重复性好，准确性高。本发明首次将铁粉作为吸氧剂引入测试片，不需要厌氧设备即能实现厌氧菌的检测，成功突破了传统检测在仪器设备方面的限制；将显色培养基和凝胶直接混合后粘于胶带上作为培养层，省去培养基加水调配、涂布、烘干等环节，减少制作工艺对营养成分的破坏；制作工艺简单；测试片与常规检测符合率高，检测结果准确。
附图说明
图1为厌氧菌测试片的产品图。
图2为厌氧菌测试片的侧面效果图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、厌氧菌测试片
本发明的厌氧菌测试片的结构示意图如图1和图2所示。
图1和图2所示的厌氧菌测试片，包括粘附有吸氧剂的吸氧薄膜和粘附有显色培养体系的培养薄膜；吸氧薄膜包括防水不透气胶带1，吸氧剂2和防水透气胶带3；培养薄膜包括显色培养体系4和防水不透气胶带5；吸氧薄膜防水透气胶带面和所述培养薄膜粘附有显色培养体系面在短边一侧粘合连接。
粘附有吸氧剂的吸氧薄膜为将吸氧剂粘附到防水不透气胶带的胶面，再将防水透气胶带粘附在吸氧剂的表面，形成粘附有吸氧剂的吸氧薄膜。
粘附有显色培养体系的培养薄膜为将冷水可溶性凝胶和微生物显色培养基混合后，得到显色培养体系，再将显色培养体系粘附到胶带的胶面，形成粘附有显色培养体系的培养薄膜。
显色培养体系由微生物显色培养基和冷水可溶性凝胶组成，其中，微生物显色培养基和冷水可溶性凝胶的质量比为1:1-3。
微生物显色培养基为乳酸菌显色培养基、双歧杆菌显色培养基、产气荚膜梭菌显色培养基或肉毒梭菌显色培养基。
上述各实施例仅用于说明本发明，其中各部件的结构、设置位置及其连接方式等都是可以有所变化的，凡是在本发明技术方案的基础上进行的等同变换和改进，均不应排除在本发明的保护范围之外。
实施例2、用于乳酸菌总数检测的厌氧菌测试片的制备及应用
一、乳酸菌测试片的制备
1、粘附有吸氧剂的吸氧薄膜的制备
将铁粉（常州智广活性炭有限公司，200目）粘附到PET胶带（深圳合昌兴科技有限公司；货号：401，厚度0.11mm）表面，再将PVC胶带（扬州市腾龙包装材料有限公司；厚度0.03mm）粘附到铁粉表面，得到粘附有铁粉的吸氧薄膜。
2、粘附有显色培养体系的培养薄膜的制备
将2.00g海藻酸钠（河南德旺化工实业有限公司；货号：9005-38-3）和1.05g MRS显色培养基混合均匀，得到显色培养体系，再将显色培养体系粘附于PET胶带（深圳合昌兴科技有限公司；货号：401，厚度0.11mm）表面，得到粘附有显色培养体系的培养薄膜。
上述MRS显色培养基由1.00g MRS培养基和0.05g指示剂TTC（Sigma公司 货号T8877）混匀得到；MRS培养基由质量分数为18.88%牛肉蛋白粉；18.88%鱼肉汁；9.44%酵母浸出汁粉；37.76%葡萄糖；9.44%醋酸钠；3.78%柠檬酸二胺；0.19%吐温80；1.10%硫酸镁和0.53%硫酸锰组成。
3、测试片的组装
将上述1制备的粘附有铁粉的吸氧薄膜裁切成9.0cm×10.0cm的长方形；
将上述2制备的粘附有显色培养体系的培养薄膜裁切成9.0cm×10.5cm的长方形；
将上述吸氧薄膜防水透气胶带面和所述培养薄膜粘附有显色培养体系面在短边一侧以压敏胶粘合，粘合宽度1.0cm。
铝箔袋包装，环氧乙烷灭菌后备用，得到图1或图2所示的乳酸菌测试片。
二、乳酸菌测试片检测乳酸菌总数
1、乳酸菌测试片检测法
接种：分别取6份生鲜蔬菜样品和4份活性乳酸菌饮料样品，每份样品按无菌操作取25g于无菌均质袋中，加入225mL无菌生理盐水，以拍击式均质器均质1min，制成10-1菌液，再吸取1mL加入到9mL无菌生理盐水中，制成10-2菌液，以此做10倍梯度稀释。选2-3个适宜稀释度各吸取1mL滴加于上述一得到的乳酸菌测试片的吸氧薄膜表面，缓慢盖上上层培养薄膜，使样液自由扩散，得到加样后测试片，凝固1min，每个稀释度2个重复。吸取1mL无菌生理盐水滴加于上述一得到的乳酸菌测试片作为空白对照，空白对照2个重复。
培养：叠放每摞不超过10片，36℃±1℃需氧培养48h±2h。
计数：培养结束后计数红色菌落，以平均数在20-200个菌落的2个测试片平均值乘以相应稀释度作为该样品乳酸菌总数。空白对照菌落数为0，否则实验无效。
2、MRS平板法
按GB4789.35-2010法进行接种、培养和计数。
统计：以测试片法和MRS平板法测得的各样品菌落总数做t-检验，以P＜0.05存在显著差异。
表1为测试片法与MRS平板法检测6份生鲜蔬菜样品和4份活性乳酸菌饮料样品乳酸菌总数结果
（单位：cfu/g）
注：1：蒙牛优益C；2：伊利酸牛奶3：蒙牛冠益乳；4：三元酸牛奶； 5：西红柿；6：马铃薯；7：菠菜；8：山药； 9：黄瓜；10：茄子
实验证明测试片法与MRS平板法检测6份生鲜蔬菜样品和4份活性乳酸菌饮料样品乳酸菌总数无显著差异（P=0.48＞0.05），测试片法可代替常规方法检验样品中乳酸菌总数。