一种提取森林土壤和凋落物中微生物总RNA的方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102286467 A (43)申请公布日 2011.12.21 CN 102286467 A *CN102286467A* (21)申请号 201110251997.4 (22)申请日 2011.08.30 C12N 15/10(2006.01) (71)申请人 中国科学院亚热带农业生态研究所 地址 410125 湖南省长沙市芙蓉区远大二路 1071 号 (72)发明人 陈香碧 苏以荣 何寻阳 梁月明 (74)专利代理机构 武汉宇晨专利事务所 42001 代理人 王敏锋 (54) 发明名称 一种提取森林土壤和凋落物中微生物总 RNA 的方法 (57) 摘要 本发明公。

2、开了一种提取森林土壤和凋落物中 微生物总 RNA 的方法， 其步骤 ： 1、 冷冻干燥森林土 壤或凋落物样品后， 磨细、 混匀 ； 2、 粉末样品中加 入焦碳酸二乙酯处理水， -70过夜 ； 3、 加入玻璃 珠、 十六烷基三甲基溴化铵缓冲液、 十二烷基硫酸 钠、 硅藻土和酚 / 氯仿 / 异戊醇， 混匀 ； 4、 将混合 液剧烈振荡后， 离心， 得上清液 ； 5、 上清液中加入 异硫氰酸胍， 离心， 得上清液 ； 6、 上清液中加入氯 仿 / 异戊醇， 离心， 得上清液 ； 7、 上清液中加入聚 乙二醇 6000， 放置， 离心， 弃掉上清液 ； 8、 经洗涤、 溶解、 DNA酶消化后， 得R。

3、NA溶液 ； 9、 用琼脂糖凝胶 电泳检测 RNA 的完整性， 用核酸蛋白测定仪检测 RNA 的浓度和纯度。利用该方法提取的 RNA 产量 高、 完整性好、 纯度较好。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 1 页 CN 102286478 A1/1 页 2 1. 一种森林土壤和凋落物中微生物总 RNA 提取的方法， 其步骤是 ： A、 将实验所用的所有试剂、 耗材用 0.1 v/v 焦碳酸二乙酯水浸泡过夜后高压灭菌， 不 可高压灭菌的试剂， 用 0.1 v/v 焦碳酸二乙酯处理过的水配制， 所述的试剂包括。

4、十六烷基 三甲基溴化铵缓冲液、 20 w/w 十二烷基硫酸钠、 6 w/w 硅藻土、 5M 异硫氰酸胍、 聚乙二醇 6000 溶液、 72 75 v/v 乙醇和 0.1 v/v 焦碳酸二乙酯处理水 ； B、 采集森林土壤或森林凋落物样品， 剪碎后投入液氮中速冻， 经冷冻干燥仪冷冻干燥， 磨细、 混匀， 得粉末样品， 将粉末样品置于 -70保存 ； C、 取于-70保存的粉末样品0.20.5g， 加入300400L0.1v/v焦碳酸二乙酯 处理水， 待水渗透样品后， 得混合物 A， 将混合物 A 放入 -70， 过夜 ； D、 于经 -70过夜的混合物 A 中， 分别加入 0.2 0.5g 玻璃。

5、珠混合物、 100 400L 十六烷基三甲基溴化铵缓冲液、 20 80L 20 w/w 十二烷基硫酸钠、 40 80L 6 w/ w 硅藻土和 300 500L 酚 / 氯仿 / 异戊醇混合液， 于涡旋仪上混匀， 得混合液 B ； 其中 玻璃珠混合物中 0.1mm 和 0.5mm 直径玻璃珠的质量比为 1 1， 十六烷基三甲基溴化铵缓 冲液中十六烷基三甲基溴化铵的浓度为 5 w/w、 磷酸缓冲液的浓度为 120mM、 氯化钠的浓 度为 0.35M、 pH 值为 8.0 8.5， 酚 / 氯仿 / 异戊醇混合液中酚、 氯仿、 异戊醇的体积比为 25 24 1、 pH 值为 8.0 ； E、 将所。

6、得混合液 B 放入快速核酸提取仪， 以 4.5 5.5m/s 的速度裂解细胞 30 45s 后， 于 4、 14000rpm， 离心 10 15min， 得上清液 ； F、 步骤 E 所得的上清液中加入 100L 5M 异硫氰酸胍， 混匀， 于 4、 12000 14000rpm， 离心 5 10min， 得上清液， 并重复该步骤 1 3 次 ； G、 步骤 E 所得的上清液或步骤 F 所得的上清液中， 加入等体积的氯仿 / 异戊醇混合液， 氯仿 / 异戊醇混合液中氯仿、 异戊醇的体积比为 24 1， 混匀， 于 4、 12000 14000rpm， 离心 10min， 得上清液 ； H、 步。

7、骤 G 所得的上清液中加入 2 倍体积的聚乙二醇 6000 溶液， 聚乙二醇 6000 溶液中 聚乙二醇6000的浓度为3040w/w、 氯化钠的浓度为1.52.0M， 混匀， 室温放置1 2h 以沉淀核酸 ； 于 4、 14000rpm， 离心 10min， 弃掉上清液， 得核酸沉淀 ； I、 用 300 400L 预冷的 72 75 v/v 乙醇， 分两次清洗步骤 H 所得的核酸沉淀， 瞬时离心 10 15s， 用移液器吸走残留乙醇溶液， 于超净工作台中， 自然晾干 5 10min， 加 50 100L 0.1 v/v 焦碳酸二乙酯处理水， 溶解， 混匀， 得 DNA/RNA 溶液 C ；。

8、 J、 用琼脂糖凝胶电泳检测 DNA/RNA 溶液 C 中 DNA 和 RNA 的完整性， 用 DNA 酶消化 DNA/ RNA 溶液 C 中的 DNA， 得 RNA 溶液 D， 用琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 溶液 D 中 RNA 的完整性， 用 核酸蛋白测定仪检测 RNA 溶液 D 中 RNA 的浓度和纯度， 并将 RNA 溶液 D 保存于 -70备用。 权 利 要 求 书 CN 102286467 A CN 102286478 A1/6 页 3 一种提取森林土壤和凋落物中微生物总 RNA 的方法 技术领域 0001 本发明属生物技术领域， 涉及一种提取微生物总 RNA 的方法， 尤其涉及一。

9、种提取 森林土壤和凋落物中微生物总 RNA 的方法。该方法主要适合于科研、 教学、 环保等部门对森 林土壤和凋落物中微生物功能基因转录组学研究过程中， 提取样品中的微生物总 RNA。 背景技术 0002 现有技术条件下， 95以上微生物不可培养， 这是传统微生物生态学在揭示自然 界微生物群落结构、 生态功能及其相互关系研究中的最大障碍。随着分子生物学的理论与 技术在微生物生态学研究中的不断渗透， 直接对环境样品中分离的微生物总 DNA 进行分析 的方法， 在一定程度上弥补了传统培养方法所存在的局限性。但是， 由于基因表达的时空 特异性， 复杂环境条件下环境微生物基因特异性表达及其功能并不能通过。

10、对微生物 DNA 的 研究得到揭示， 而这种信息是生态环境研究中的重要部分。近年来， 通过转录组学的方法， 从 mRNA 水平上研究环境微生物， 取得了很大的成功， 且获得的结果更准确、 可靠。该方法 首先通过提取样品中所有微生物的 RNA， 将其中的 mRNA 反转录为 cDNA， 再运用定量 PCR、 Northern 杂交和 cDNA 文库构建等下游实验技术研究功能基因的丰度、 群落结构和生态功 能等。因此， 获得高质量的 RNA 是顺利进行该方法下游实验的最基本前提。 0003 森林凋落物的微生物分解直接影响着森林土壤肥力和森林生态系统养分循环过 程。对森林凋落物和土壤中微生物群落结构。

11、和功能的研究， 已成为国际土壤微生物研究领 域的热点。但森林凋落物和土壤中含丰富的腐殖酸、 多糖、 多酚等物质， 使提取的微生物总 RNA 纯度不高， 且环境中广泛存在着 RNA 酶， RNA 易被其降解， 给 RNA 提取带来了许多困难。 有为数不多的商业公司研发了土壤 RNA 提取试剂盒， 但价格昂贵， 且对土壤样品选择性较 强， 尤其是提取森林凋落物中微生物总 RNA 时， 所提的 RNA 产量低、 效果不稳定。而绝大部 分通过手提法获得的土壤微生物总 RNA 产量不高、 腐殖酸污染较严重， 会干扰下游试验的 顺利进行。此外， 目前对环境微生物总 RNA 提取的方法主要针对土壤、 堆肥、。

12、 水和大气等环 境样品， 尚缺乏针对森林凋落物中微生物总 RNA 的有效提取方法。因此， 开发一种高产量、 高质量的既适合森林土壤又适合森林凋落物中微生物总 RNA 提取的方法， 是进行森林生态 系统凋落物微生物分解过程研究的迫切需要。 发明内容 0004 本发明的目的是在于提供了一种提取森林土壤和凋落物中微生物总 RNA 的方法， 利用该方法提取的微生物总 RNA 产量高、 完整性好、 纯度较好。 0005 为了实现上述的目的， 本发明采用以下技术方案 ： 0006 一种森林土壤和凋落物中微生物总 RNA 提取的方法， 其步骤是 ： 0007 A、 将实验所用的所有试剂、 耗材用 0.1 (。

13、v/v， 以下相同 ) 焦碳酸二乙酯 (DEPC) 水浸泡过夜后高压灭菌， 若配制的试剂不可高压灭菌， 用 0.1焦碳酸二乙酯 (DEPC) 处理 过的水配制， 所述的试剂包括十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB) 缓冲液、 20 (w/w) 十二烷基 说 明 书 CN 102286467 A CN 102286478 A2/6 页 4 硫酸钠 (SDS)、 6 (w/w) 硅藻土、 5M 异硫氰酸胍 (GITC)、 聚乙二醇 6000(PEG6000) 溶液、 72 75 (v/v) 乙醇和 0.1焦碳酸二乙酯 (DEPC) 处理水等， 所述的耗材包括碾钵、 碾 棒、 玻璃珠、 离心管、 吸头和。

14、试剂瓶等。 0008 B、 采集新鲜森林土壤或森林凋落物样品， 剪碎后立即投入液氮中速冻， 经冷冻干 燥仪冷冻干燥， 磨细、 混匀， 得粉末样品， 将粉末样品置于 -70保存。 0009 C、 取于-70保存的粉末样品0.20.5g， 加入300400L0.1焦碳酸二乙酯 (DEPC) 处理水， 待水渗透样品后， 得混合物 A， 将混合物 A 放入 -70， 过夜 ； 0010 D、 于经 -70过夜的混合物 A 中， 分别加入 0.2 0.5g 玻璃珠混合物、 100 400L 十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB) 缓冲液、 20 80L20 (w/w) 十二烷基硫酸钠 (SDS)、 40 8。

15、0L 6 (w/w) 硅藻土和 300 500L 酚 / 氯仿 / 异戊醇混合液， 于涡旋仪 上混匀， 得混合液 B ； 其中玻璃珠混合物中 0.1mm 和 0.5mm 直径玻璃珠的质量比为 1 1， 十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB) 缓冲液中十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB) 的浓度为 5 (w/ w)、 磷酸缓冲液的浓度为 120mM、 氯化钠 (NaCl) 的浓度为 0.35M、 pH 值为 8.0 8.5， 酚 / 氯 仿 / 异戊醇混合液中酚、 氯仿、 异戊醇的体积比为 25 24 1、 pH 值为 8.0 ； 0011 E、 将所得混合液 B 放入快速核酸提取仪， 以 4.5 5。

16、.5m/s 的速度裂解细胞 30 45s 后， 于 4、 14000rpm， 离心 10 15min， 得上清液 ； 0012 F、 步骤 (E) 所得的上清液中加入 100L 5M 异硫氰酸胍 (GITC)， 混匀， 于 4、 12000 14000rpm， 离心 5 10min， 得上清液， 并重复该步骤 1 3 次 ； 0013 G、 步骤 (E) 所得的上清液或步骤 (F) 所得的上清液中， 加入等体积的氯仿 / 异 戊醇混合液， 氯仿 / 异戊醇混合液中氯仿、 异戊醇的体积比为 24 1， 轻轻混匀， 于 4、 12000 14000rpm， 离心 10min， 得上清液 ； 001。

17、4 H、 步骤 (G) 所得的上清液中加入 2 倍体积的聚乙二醇 6000(PEG6000) 溶液， 聚乙 二醇溶液中聚乙二醇 6000(PEG6000) 的浓度为 30 40 (w/w)、 氯化钠 (NaCl) 的浓度 为 1.5 2.0M， 充分混匀， 室温 (20 25， 以下相同 ) 放置 1 2h 以沉淀核酸 ； 于 4、 14000rpm， 离心 10min， 弃掉上清液， 得核酸沉淀 ； 0015 I、 用 300 400L 预冷的 72 75 (v/v) 乙醇， 分两次清洗步骤 (H) 所得的 核酸沉淀， 瞬时离心1015s， 用移液器吸走残留乙醇溶液， 于超净工作台中， 自然。

18、晾干5 10min， 加 50 100L 0.1焦碳酸二乙酯 (DEPC) 处理水， 溶解， 混匀， 得 DNA/RNA 溶液 C。 0016 J、 用琼脂糖凝胶电泳检测 DNA/RNA 溶液 C 中 DNA 和 RNA 的完整性， 用 DNA 酶消化 DNA/RNA 溶液 C 中的 DNA， 得 RNA 溶液 D， 用琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 溶液 D 中 RNA 的完整 性， 用核酸蛋白测定仪检测 RNA 溶液 D 中 RNA 的浓度和纯度， 并将 RNA 溶液 D 保存于 -70 备用。 0017 上述的技术方案中， 所述 CTAB 缓冲液与 SDS 裂解液体积比的控制是该技术方案 的。

19、关键之一， CTAB 缓冲液同时具有裂解细胞和去除样品中的腐殖质、 多糖等物质的功能， 在 CTAB 缓冲液中加入 SDS 可增加破坏细胞壁和裂解细胞的能力， 提高 RNA 的产量 ； 当试验样 品为森林土壤时， 可适当降低 CTAB/SDS 的比例， 即所述步骤 (D) 中 CTAB 缓冲液的加入量为 100 300L， SDS 的加入量为 40 80L ； 当试验样品为凋落物时， 可适当增加 CTAB/SDS 的比例， 即所述步骤 (D) 中 CTAB 缓冲液的加入量为 200 400L， SDS 的加入量为 20 40L。 说 明 书 CN 102286467 A CN 10228647。

20、8 A3/6 页 5 0018 上述的技术方案中， 所述快速核酸提取仪购自美国 MP BIO 公司， 型号为 FastPrep-24 ； 所述步骤 (E) 中， 混合液 B 放入快速核酸提取仪， 以 4.5 5.5m/s 的速度裂 解细胞 30 45s， 可被替换为将混合液 B 置于转速 1500 2000rpm 的涡旋仪上， 涡旋 10 15min。 0019 上述的技术方案中， 所述步骤(F)中， 加入的GITC是一种蛋白质变性剂， 多次加入 5M GITC 能有效去除蛋白质类物质 ； 根据不同样品， 若提取的 RNA OD260/280 1.8， 可省去所 述步骤 (F)， 若提取出的 。

21、RNA OD260/280 1.8， 则有必要进行所述步骤 (F)。 0020 上述的技术方案中， 所述步骤 (H) 中， 以 PEG6000 为沉淀剂， 可使核酸与腐殖质类 物质有效分离， 所提取的 RNA 的纯度比以乙醇或异丙醇作为沉淀剂有大大提高。 0021 上述的技术方案中， 所述 RNA 质量的检测， 可按本领域常规方法进行， 本发明采用 的 RNA 质量检测方法如下 ： 0022 1) 取 1 3L 上述技术方案中步骤 (I) 所得 DNA/RNA 溶液 C， 经 1.5 (w/w) 琼 脂糖凝胶电泳检测 DNA/RNA 溶液 C 中 DNA 和 RNA 的完整性 ； 0023 2。

22、) 再取适量 DNA 酶液， 加入适量的 DNA/RNA 溶液 C， 于 37水浴保温 30 60min， 对 DNA/RNA 溶液 C 中的 DNA 进行消化， 得 RNA 溶液 D ； 0024 3) 取 1 3LRNA 溶液 D， 经 1.5 (w/w) 琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 溶液 D 中 RNA 的完整性 ； 0025 4) 取 1 2LRNA 溶液 D， 用核酸蛋白测定仪测定 RNA 溶液 D 中 RNA 的浓度和纯 度 ； 以 OD260表示 RNA 浓度， 以 OD260/280表示 RNA 的蛋白质污染程度， 其值 1.8 表示 RNA 基 本未被蛋白质污染， 以 OD2。

23、60/230表示 RNA 的腐殖质污染程度， 其值 1.7 2.0 表示 RNA 受腐 殖质污染较轻。 0026 本发明与现有 RNA 提取技术相比， 具有以下优点和效果 ： 0027 1) 操作方便 ： 提取过程简单、 易操作 ； 0028 2) 效果优良 ： 操作过程中 RNA 不易降解， 提取的 RNA 产量高 (20 150g/g 干 样 )、 纯度较好 (OD260/280值为 1.8 2.0， OD260/230值为 1.5 1.8)、 完整性好， 可直接用于反 转录、 RT-PCR、 Northern 杂交等后续实验。 0029 3) 适用范围广 ： 适用不同地区、 不同来源的森。

24、林土壤和森林凋落物中微生物总 RNA 的提取， 亦可用于提取农田土壤中的微生物总 RNA， 具有广普适用性 ； 0030 4) 经济实用 ： 综合成本低， 并且能同时提取样品中微生物总 DNA 和 RNA， 对于需要 同时研究微生物总 DNA 和 RNA 的试验， 采用该方法， 实验操作更省时、 经济。 附图说明 0031 图 1 为一种森林土壤和凋落物中微生物总 RNA 提取的方法的电泳图。 0032 本发明实施例 1 中从森林土壤中提取的微生物总 DNA 和 RNA 的 1.5 (w/w) 琼脂 糖凝胶电泳图 ； 1， 2， 3， 4， 5 分别代表五个小样方所提取的土壤中微生物总 DNA。

25、 和 RNA ； M 为 D2000 DNA Marker( 索莱宝公司 )。 0033 图 2 为一种森林土壤和凋落物中微生物总 RNA 提取的方法的电泳图。 0034 本发明实施例 1 中从森林土壤中提取的微生物总 RNA 的 1.5 (w/w) 琼脂糖凝胶 电泳图 ； M 为 D2000DNA Marker( 索莱宝公司 ) ； S1 代表实施例 1 中标准样方的土壤中微生 说 明 书 CN 102286467 A CN 102286478 A4/6 页 6 物总 RNA。 0035 图 3 为一种森林土壤和凋落物中微生物总 RNA 提取的方法的电泳图。 0036 本发明实施例 2 中从。

26、森林凋落物中提取的微生物总 DNA 和 RNA 的 1.5 (w/w) 琼 脂糖凝胶电泳图 ； 6， 7， 8， 9， 10分别代表五个小样方所提取的凋落物中微生物总DNA和RNA ； M 为 D2000 DNA Marker( 索莱宝公司 )。 0037 图 4 为一种森林土壤和凋落物中微生物总 RNA 提取的方法的电泳图。 0038 本发明实施例 2 中从森林凋落物中提取的微生物总 RNA 的 1.5 (w/w) 琼脂糖凝 胶电泳图 ； M 为 D2000DNA Marker( 索莱宝公司 ) ； S2 代表实例 2 中标准样方的凋落物中微 生物总 RNA。 具体实施方式 0039 下面结。

27、合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。 0040 实施例 1 ： 0041 一种森林土壤和凋落物中微生物总RNA提取的方法(提取马尾松林土壤中微生物 总 RNA)， 其步骤是 ： 0042 (1) 将实验所用的所有试剂、 耗材用 0.1 (v/v， 以下相同 ) 焦碳酸二乙酯 (DEPC) 水浸泡过夜后高压灭菌， 若配制的试剂不可高压灭菌， 用 0.1焦碳酸二乙酯 (DEPC) 处理 过的水配制， 所述的试剂包括十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB) 缓冲液、 20 (w/w) 十二烷基 硫酸钠 (SDS)、 6 (w/w) 硅藻土、 。

28、5M 异硫氰酸胍 (GITC)、 聚乙二醇 6000(PEG6000) 溶液、 72 75 (v/v) 乙醇和 0.1焦碳酸二乙酯 (DEPC) 处理水等， 所述的耗材包括碾钵、 碾 棒、 玻璃珠、 离心管、 吸头和试剂瓶等。 0043 (2)在马尾松林(针叶林)， 选择一个标准样方(2020m)， 在标准样方中选择5个 小样方 (55m)， 编号分别为 1、 2、 3、 4 和 5， 分别采集表土 (0 20cm)， 混匀， 按四分法分取 约 50g， 放入灭菌铝箔包好， 立即投入液氮中速冻， 带回实验室 ； 经冷冻干燥仪冷冻干燥， 去 除样品中的水分， 经磨细、 混匀后， 置于 -70保存。

29、。 0044 (3)取0.5g于-70保存的土壤样品放入2mL离心管， 加入300L 0.1DEPC处 理水， 待水渗透样品后， 放入 -70， 过夜 ； 0045 (4) 加入 0.5g 玻璃珠、 150L CTAB 缓冲液、 80L 20 (w/w)SDS、 40L 6 (w/ w) 的硅藻土， 400L 酚 / 氯仿 / 异戊醇 ( 体积比 25 24 1， pH 8.0)， 于涡旋仪上混匀 ； 所用的玻璃珠由 1 1 质量比的 0.1mm 和 0.5mm 直径的玻璃珠混合， 所用的 CTAB 缓冲液中 含 5 (w/w)CTAB、 120mM 磷酸缓冲液、 0.35M NaCl、 pH。

30、 8.0 ； 0046 (5) 放入快速核酸提取仪， 以 5.5m/s 的速度裂解细胞 40s， 4、 14000rpm， 离心 10min， 转移上清液至另一新的 1.5mL 离心管 ； 0047 (6) 加入 100L 5M GITC， 4、 14000rpm， 离心 5min， 转移上清液至另一新的 1.5mL 离心管， 重复该步骤 2 次 ； 0048 (7) 加入等体积氯仿 / 异戊醇 ( 体积比 24 1)， 轻轻混匀， 4、 14000rpm， 离心 10min， 转移上清液至另一新的 1.5mL 离心管 ； 0049 (8) 加入 2 倍体积的 PEG 溶液， 充分混匀， 室温。

31、 (20 25， 以下相同 ) 放置 2h， 说 明 书 CN 102286467 A CN 102286478 A5/6 页 7 4、 14000rpm， 离心 10min， 弃上清液 ； 所用的 PEG 溶液中含 35 (w/w)PEG6000 和 1.5M NaCl ； 0050 (9) 分两次加入 400L 预冷的 75 (v/v) 乙醇， 瞬时离心 15s， 用移液器吸走残 留乙醇溶液， 于超净工作台中， 自然晾干 10min， 加 50L 0.1 DEPC 处理水， 混匀， 得 DNA/ RNA 混合液。 0051 (10)从编号为15的土壤样品中提取的DNA/RNA混合液分别取1。

32、.5L用1.5 (w/w) 琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 和 RNA 的完整性， 如图 1 所示 ； 从编号为 1 5 的土壤样品 中提取的 DNA/RNA 混合液中各取 4L 溶液 ( 共 20L)， 加入 5L DNA 酶， 于 37水浴保 温 30min， 所得 RNA 编号为 S1， 取 1.5L DNA 酶消化过的 RNA， 用 1.5 (w/w) 琼脂糖凝胶 电泳检测 RNA 的完整性， 如图 2 所示 ； 另取 1.5L DNA 酶消化过的 RNA， 用核酸蛋白测定仪 检测 RNA 的浓度和纯度， 并将 DNA 酶消化过的 RNA 保存于 -70备用。 0052 图 1、 图 2 。

33、中 RNA 带型整齐、 清晰， 无明显降解， 说明所提取的 RNA 完整性好 ； 此 外， 经核酸蛋白测定仪检测用 DNA 酶消化过的 RNA， OD260为 180ng/L， 即 22.5g/g 干土， OD260/280值为1.85， OD260/230值为1.64， 说明从土壤中提取的RNA浓度高， 纯度较好， 可用于下 游 RT-PCR 等实验。 0053 实施例 2 ： 0054 一种森林土壤和凋落物中微生物总RNA提取的方法(提取喀斯特常绿落叶阔叶混 交林凋落物中微生物总 RNA)， 其步骤是 ： 0055 (1) 将所用的所有试剂、 耗材用 0.1 (v/v， 以下相同 )DEP。

34、C 水浸泡过夜后高压灭 菌， 若配制的试剂不可高压灭菌， 用0.1DEPC处理过的水配制， 所述的所有试剂为CTAB缓 冲液、 20 (w/w)SDS、 6 (w/w) 硅藻土、 5M GITC、 PEG6000 溶液、 72 75 (v/v) 乙醇和 0.1 DEPC 处理水等， 所述的耗材包括碾钵、 碾棒、 玻璃珠、 离心管、 吸头和试剂瓶等。 0056 (2) 在喀斯特常绿落叶阔叶混交林， 选择一个标准样方 (2020m)， 在标准样方中 选择 5 个小样方 (55m)， 编号分别为 6、 7、 8、 9 和 10， 分别采集凋落物， 用剪刀剪碎， 混匀， 按四分法分取约 50g， 放入。

35、灭菌铝箔包好， 立即投入液氮中速冻 ； 带回实验室， 经冷冻干燥 仪冷冻干燥， 去除样品中的水分， 经磨细、 混匀后， 置于 -70保存。 0057 (3) 取 0.2g 于 -70保存的凋落物样品放入 2mL 离心管， 加入 400L 0.1 DEPC 处理水， 待水渗透样品后， 放入 -70， 过夜 ； 0058 (4) 加入 0.2g 玻璃珠、 300L CTAB 缓冲液、 30L 20 (w/w)SDS、 40L 6 (w/ w) 硅藻土， 400L 酚 / 氯仿 / 异戊醇 ( 体积比 25 24 1， pH 8.0)， 于涡旋仪上混匀 ； 所 用的玻璃珠由 1 1 质量比的 0.1。

36、mm 和 0.5mm 直径的玻璃珠混合， 所用的 CTAB 缓冲液中含 5 (w/w)CTAB、 120mM 磷酸缓冲液、 0.35M NaCl、 pH 8.0。 0059 (5) 放入快速核酸提取仪， 以 4.5m/s 的速度裂解细胞 30s， 4、 14000rpm， 离心 15mm， 转移上清液至另一新的 1.5mL 离心管 ； 0060 (6) 加入等体积氯仿 / 异戊醇 ( 体积比 24 1)， 轻轻混匀， 4、 14000rpm， 离心 10min， 转移上清液至另一新的 1.5mL 离心管 ； 0061 (7)加入2倍体积的PEG溶液， 充分混匀， 室温放置2h， 4、 1400。

37、0rpm， 离心10min， 弃上清液 ； 所用的 PEG 溶液中含 35 (w/w)PEG6000 和 1.5M NaCl ； 0062 (8) 分两次加入 400L 预冷的 75 (v/v) 乙醇， 瞬时离心 15s， 用移液器吸走残 说 明 书 CN 102286467 A CN 102286478 A6/6 页 8 留乙醇溶液， 于超净工作台中， 自然晾干 10min， 加 50L 0.1 DEPC 处理水， 混匀， 得 DNA/ RNA 混合液。 0063 (9)从编号为610的土壤样品中提取的DNA/RNA混合液分别取1.5L用1.5 (w/w) 琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 和 R。

38、NA 的完整性， 如图 3 所示 ； 从编号为 6 10 的凋落物 样品中提取的 DNA/RNA 混合液中各取 4L 溶液 ( 共 20L)， 加入 5L DNA 酶， 于 37水 浴保温 30min， 所得 RNA 编号为 S2， 取 1.5L DNA 酶消化过的 RNA， 经 1.5 (w/w) 琼脂糖 凝胶电泳检测 RNA 的完整性， 如图 4 所示 ； 另取 1.5L DNA 酶消化过的 RNA， 用核酸蛋白测 定仪检测 RNA 的浓度和纯度， 并将 DNA 酶消化过的 RNA 保存于 -70备用。 0064 图 3、 图 4 中 RNA 带型整齐、 清晰， 无明显降解， 说明所提取的 RNA 完整性好 ； 此外， 经核酸蛋白测定仪检测用 DNA 酶消化过的 RNA， OD260为 300ng/L， 即 93.75g/g 干凋落 物， OD260/280值为 1.95， OD260/230值为 1.72， 说明从凋落物中提取的 RNA 浓度高， 纯度好， 可用 于下游 RT-PCR 等实验。 说 明 书 CN 102286467 A CN 102286478 A1/1 页 9 图 1图 2图 3图 4 说 明 书 附 图 CN 102286467 A 。