一种从海滨锦葵籽中提取活性蛋白质的工艺及用途.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 102286450 B (45)授权公告日 2013.03.27 CN 102286450 B *CN102286450B* (21)申请号 201110157445.7 (22)申请日 2011.06.13 C12N 9/88(2006.01) C12N 9/04(2006.01) C12N 9/00(2006.01) A23L 1/305(2006.01) A61K 38/43(2006.01) A61K 38/44(2006.01) A61K 38/51(2006.01) A61P 37/04(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 。

2、1/16(2006.01) (73)专利权人 南京大学连云港高新技术研究院 地址 222000 江苏省连云港市新浦区科教创 业园区晨光路 2 号南楼三楼 专利权人 南京大学 (72)发明人 钦佩 张鹤云 张太平 (74)专利代理机构 南京众联专利代理有限公司 32206 代理人 刘喜莲 CN 1904008 A,2007.01.31, 全文 . RUAN Cheng-Jiang 等 .Analysis of Nutritive Compositions in the Seeds of Kosteletzkya virginica.作物学报 .2004, 第 30 卷 ( 第 9 期 ),901。

3、-905. 丁海荣等 . 耐盐植物海滨锦葵研究进展 . 安 徽农学通报 .2008, 第 14 卷 ( 第 13 期 ),43-45. Xing Wang 等 .Purification and Characterization of Three Antifungal Proteins from Cheeseweed (Malva parviflora).Biochemical and Biophysical Research Communications .2001, 第 282 卷 1224-1228. (54) 发明名称 一种从海滨锦葵籽中提取活性蛋白质的工艺 及用途 (57) 摘要 本。

4、发明是一种从海滨锦葵籽中提取活性蛋白 质的工艺， 其特征在于 ： 海滨锦葵籽粉碎， 去脂， 超声， 过滤 ； 上 DEAE- 纤维素柱， 洗涤杂质， 分别用 0.01PBS-0.1molNaCL/L、 -0.25molNaCL/L 洗 脱， 收集， 透析， 冻干， 得产品。 本发明工艺提取制得的 活性蛋白质可以在制备增强体液免疫和抗肝脏肿 瘤的保健食品或药品中应用， 依据这些生物活性 可根据需要制成胶囊、 片剂、 口服液、 粉针剂等保 健品、 药品。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 唐莉 权利要求书 1 页 说明书 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专。

5、利 权利要求书 1 页 说明书 3 页 1/1 页 2 1. 一种从海滨锦葵籽中提取活性蛋白质的工艺， 其特征在于， 其步骤是 ： 采集海滨锦 葵的籽， 粉碎， 用石油醚或乙醚抽提去脂肪， 得到无脂肪的干粉 ； 将锦葵籽无脂肪干粉按 1:20 比例加入蒸馏水， 混匀， 用超声仪超声提取 ； 超声条件为 ： 温度 40， 功率 200W， 时间 1 小时 ； 超声结束后， 过滤， 滤液存放， 滤渣按比例 1:20 加入蒸馏水， 再用上述超声条件重复 提取一次 ； 两次滤液合并， 滤液减压蒸发， 得超声提取浓缩液 ； 用 DEAE- 纤维素柱对超声提取浓缩液进行分离 ； DEAE- 纤维素按常规方。

6、法处理， 处理 好后装柱， 用磷酸缓冲液平衡， 上样 ； 先用 0.01molPBS pH6.5 洗涤柱子， 再用 0.01molPBS -0.1molNaCl pH6.5洗脱并第一次收集洗脱液 ； 随后再用0.01molPBS -0.25molNaCl pH6.5 洗脱并第二次收集洗脱液 ； 将 2 次洗脱液分别装透析袋对水透析， 透析后收集透析内液， 冻 干浓缩， 分别得到两种活性蛋白质。 2. 一种如权利要求 1 所述的方法提取得到的第一次收集洗脱液制得的活性蛋白质在 制备增强体液免疫和抗肝脏肿瘤的药品中的应用 ； 第二次收集洗脱液制得的活性蛋白质在 制备抗肝脏肿瘤的药品中的应用。 权 。

7、利 要 求 书 CN 102286450 B 2 1/3 页 3 一种从海滨锦葵籽中提取活性蛋白质的工艺及用途 技术领域 0001 本发明属于生化分离技术领域， 特别是涉及一种从海滨锦葵籽中提取活性蛋白质 的工艺 ； 本发明还涉及前述活性蛋白质的用途。 背景技术 0002 海滨锦葵(Kostelezkya virginica)是适宜海滨地区生长的锦葵科锦葵属多年生 宿根盐生植物 , 天然分布于美国东部沿海盐沼海岸带。1992 年由南京大学引种至中国。有 文献报导， 因其耐盐水浇灌， 种子产量高的耐盐油料作物而日益受到人们的重视。 有实验表 明海滨锦葵种子中营养成分有较高的营养价值 , 可以作为。

8、油料、 食品、 饲料、 保健品和其他 工业用途的原料 ； 然而， 基于探究其主要活性成分的研究较少 , 近年来仅有少量研究表明 海滨锦葵种子具有增强免疫， 降低血糖等功效的论文。而探明锦葵籽中的活性蛋白质成分 的论文未见。从锦葵籽中提取制备锦葵生物活性蛋白质组分专利文献至今未有。 发明内容 0003 本发明需要解决的技术问题是针对现有技术的不足， 提供一种新的、 工艺更为简 单合理的从海滨锦葵的籽中提取活性蛋白质的工艺。 0004 本发明需要解决的另一技术问题是提供上述工艺提取活性蛋白质的用途。 0005 本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。 本发明是一种从海 滨锦葵的籽中提。

9、取活性蛋白质的工艺， 其特点是， 其步骤如下 ： 0006 一种从海滨锦葵籽中提取活性蛋白质的工艺， 其特征在于， 其步骤是 ： 采集海滨 锦葵的籽， 粉碎， 用石油醚或乙醚抽提去脂肪， 得到无脂肪的干粉 ； 将锦葵籽无脂肪干粉按 1:20 比例加入蒸馏水， 混匀， 用超声仪超声提取 ； 超声条件为 ： 温度 40， 功率 200W， 时间 1 小时 ； 超声结束后， 过滤， 滤液存放， 滤渣按比例 1:20 加入蒸馏水， 再用上述超声条件重复 提取一次 ； 两次滤液合并， 滤液减压蒸发， 得超声提取浓缩液 ； 0007 用 DEAE- 纤维素柱对超声提取浓缩液进行分离 ； DEAE- 纤维素。

10、按常规方法处理， 处 理好后装柱， 用磷酸缓冲液平衡， 上样 ； 先用 0.01molPBS pH6.5 洗涤柱子， 再用 0.01molPBS -0.1molNaCl pH6.5洗脱并第一次收集洗脱液 ； 随后再用0.01molPBS -0.25molNaCl pH6.5 洗脱并第二次收集洗脱液 ； 将 2 次洗脱液分别装透析袋对水透析， 透析后收集透析内液， 冻 干浓缩， 分别得到两种活性蛋白质。 0008 以下是发明人所做的关于本发明工艺提取得到的海滨锦葵的两种活性蛋白质的 生物学活性试验。 0009 1.） 海滨锦葵两种蛋白质的免疫学活性 0010 表 1. 锦葵籽活性蛋白对小鼠脾细胞。

11、和胸腺细胞增殖的影响 说 明 书 CN 102286450 B 3 2/3 页 4 0011 0012 2.） 海滨锦葵两种蛋白质的抗肿瘤活性 0013 表 2. 锦葵籽活性蛋白对 Hep-S 细胞生长的抑制作用 0014 0015 根据表 1， 海滨锦葵籽活性蛋白具有显著的提高小鼠免疫细胞增殖的作用 ； 又据 表2， 海滨锦葵籽活性蛋白具有显著抑制Hep-S肿瘤细胞生长的作用。 而且作用强度与浓度 比成明显的正相关关系。 0016 本发明工艺制得的 2 种蛋白质的含量测定方法可能使用 Folin- 酚法 （Lowry 法） 。 0017 本发明第一次使用超声技术提取出了海滨锦葵籽水溶性蛋白质。

12、， 并且初步做了免 疫学、 抗肿瘤的生物学活性。根据这些生物活性可制成胶囊、 片剂、 口服液、 粉针剂等保健 品、 药品， 供有关患者使用。 说 明 书 CN 102286450 B 4 3/3 页 5 具体实施方案 0018 以下进一步描述本发明的具体技术方案， 以便于本领域的技术人员进一步地理解 本发明， 而不构成对其权利的限制。 0019 实施例 1。从海滨锦葵籽中提取活性蛋白质的工艺， 其步骤如下 ： 0020 1取 60 g 干燥的锦葵籽， 研成粉末样品， 石油醚 （100 mL3） 80 回流萃取， 去 脂籽粒粉室温阴干， 得去脂肪样品 51.7g。 0021 取所得去脂籽粉样， 。

13、以 1 ： 20（w:v） 的比例加蒸馏水 1100ml， 然后采用超声仪超声 破坏细胞膜辅助蛋白提取， 超声条件 ： 温度 40， 功率 200W， 时间 1h， 超声后用纱布过滤， 重 复以上步骤， 收集滤液 1700ml。 0022 取 DEAE- 纤维素， 按常规处理， 处理好的 DEAE 纤维素装填 254cm 柱子， 以 水覆盖， 装柱完毕后用 0.01mol/L PBS (pH6.5) 以稳定流速通过柱体直至达到平衡。 0023 将收集好的滤液以稳定流速缓慢的流入柱中， 使其吸附于柱上。上样完毕后 采用 0.01mol/L PBS (pH6.5) 洗涤柱子， 用量为 2-3 个床。

14、体积。 0024 依次用 0.01mol PBS pH6.5-0.1mol NaCL/L， 0.01mol PBS pH6.5-0.25mol NaCL/ L 的洗脱液洗脱。收集洗脱液， 采用紫外检测仪 （波长 280nm）检测 , 收集 0.01mol PBS pH6.5-0.1mol NaCL/L 洗脱液得 470ml， 0.01mol PBS pH6.5-0.25mol NaCL/L 洗脱液得 400ml。分别装透析袋， 对蒸馏水透析， 透析后收集， 然后用冻干机冻干。 0025 冷冻干燥得到0.01mol PBS pH6.5-0.1mol NaCL/L洗脱峰冻干样品0.326g,含量 。

15、31.9%， 0.01mol PBS pH6.5-0.25mol NaCL/L 洗脱峰冻干样品 0.89g, 含量 58.8% 两种活性 蛋白样品。 0026 2海滨锦葵籽活性蛋白质的测定方法 0027 从海滨锦葵中分离制备的活性蛋白质， 按常规方法 Folin- 酚法 （Lowry 法） 测定含 量， 鉴定纯度。活性蛋白组分经质谱分析初步确定， 主要有三种已知蛋白分别是 - 乳糖酰基 谷胱甘肽裂解酶 ； 苹果酸脱氢酶 ； 烯醇化酶等。 0028 本实施例制得的活性蛋白质可以按常规方法单独用于或组合用于制成胶囊、 片 剂、 口服液、 粉针剂等保健品、 药品。 说 明 书 CN 102286450 B 5 。