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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201611225211.0 (22)申请日 2016.12.27 (71)申请人 西北大学 地址 710069 陕西省西安市太白北路229号 (72)发明人 王英娟杨泽熵张雨靖高文英 吕亚维 (74)专利代理机构 西安西达专利代理有限责任 公司 61202 代理人 谢钢 (51)Int.Cl. C12N 15/79(2006.01) C12N 15/66(2006.01) (54)发明名称 一种用于转化莱茵衣藻的gpd1基因农杆菌 双元表达载体及其构建方法 (57)摘要 本发明。
2、公开了一种含有酿酒酵母gpd1基因 的双元表达载体， 所述载体的构建方法是通过将 从酿酒酵母中提取的基因与博莱霉素基因Ble连 接， 并将连接产物连接在质粒pRI101-AN的多克 隆位点上， 构建得到pRI-Ble-GPD1。 本发明不仅 可以节省构建细胞壁缺陷型藻株的人力物力， 而 且可以对因为没有数据库而无法构建细胞壁缺 陷型的其他微藻的转基因方法具有一定的启发， 为将来高产油转基因微藻的研究提供了一些思 路。 权利要求书1页 说明书4页 序列表2页 附图6页 CN 106701811 A 2017.05.24 CN 106701811 A 1.一种含有酿酒酵母gpd1基因的双元表达载体。
3、， 其特征在于， 所述载体的构建方法包 括以下步骤： （1）gpd1基因为序列表中SEQ ID No.3 所示DNA分子， 来自酿酒酵母的基因组， 通过嵌 套PCR得到， 并在基因两端添加EcoRI和NdeI酶切位点， 其引物序列为序列表中SEQ ID No.1 和SEQ ID No.2所示的DNA分子； （2） 将PCR 扩增后的反应液和载体pDBle用NdeI和EcoRI双酶切， 并将得到的酶切产物 用T4 DNA连接酶连接， 转化大肠杆菌DH5 ， 挑取单克隆扩大培养， 提取质粒双酶切验证， 将 阳性重组质粒命名为重组质粒pDBle-GPD1； （3） 将pDBle-GPD1与pRI10。
4、1-AN质粒使用BamH I和KpnI 双酶切， 回收连接， 热激转化 DH5 的感受态细胞， Amp （100mg/L） 抗性的LB平板筛选培养， 阳性重组质粒命名为pRI101- GPD1。 2.根据权利要求1所述的含有酿酒酵母gpd1基因的双元表达载体， 其特征在于， 所述双 元表达载体为pRI101-GPD1。 3.权利要求1所述含有酿酒酵母gpd1基因的双元表达载体的构建方法， 其特征在于包 括以下步骤： （1）gpd1基因为序列表中SEQ ID No.3 所示DNA分子， 来自酿酒酵母的基因组， 通过嵌 套PCR得到， 并在基因两端添加EcoRI和NdeI酶切位点， 其引物序列为序。
5、列表中SEQ ID No.1 和SEQ ID No.2所示的DNA分子； （2） 将PCR 扩增后的反应液和载体pDBle用NdeI和EcoRI双酶切， 并将得到的酶切产物 用T4 DNA连接酶连接， 转化大肠杆菌DH5 ， 挑取单克隆扩大培养， 提取质粒双酶切验证， 将 阳性重组质粒命名为重组质粒pDBle-GPD1； （3） 将pDBle-GPD1与pRI101-AN质粒使用BamH I和KpnI 双酶切， 回收连接， 热激转化 DH5 的感受态细胞， Amp （100mg/L） 抗性的LB平板筛选培养， 阳性重组质粒命名为pRI101- GPD1。 4.权利要求1所述含有酿酒酵母gpd1。
6、基因的双元表达载体的遗传转化方法， 其特征在 于包括以下步骤： （1） 制备农杆菌 LBA4404 感受态， 然后将重组质粒pRI101-GPD1通过冻融法转化到根 癌农杆菌， 得到含有gpd1基因的根癌农杆菌 LBA4404； （2） 将获得的阳性农杆菌 LBA4404 侵染莱茵衣藻FACHB479获得转gpd1基因莱茵衣藻； （3） 提取莱茵衣藻基因组DNA和RNA通过PCR及RT-PCR鉴定阳性转基因植株； （4） 选择莱茵衣藻转化株， 使用改良的尼罗红染色法经多功能酶标仪进行油脂含量鉴 定， 并在激光共聚焦显微镜下观察油脂染色情况。 5.权利要求1所述的双元表达载体在携带外源gpd1基。
7、因进入野生型具有细胞壁的莱茵 衣藻基因组中的应用。 6.根据权利要求5所述应用， 其特征在于： 利用携带双元表达载体的农杆菌LBA44044侵 染野生型具有细胞壁的莱茵衣藻FACHB-479， 在乙酰丁香酮的作用下将目的基因转入莱茵 衣藻FACHB-479的基因组中， 并用PCR、 RT-PCR和尼罗红染色法验证。 权利要求书 1/1 页 2 CN 106701811 A 2 一种用于转化莱茵衣藻的gpd1基因农杆菌双元表达载体及其 构建方法 技术领域 0001 本发明属于基因工程技术领域， 具体涉及一种用于转化莱茵衣藻的gpd1基因农杆 菌双元表达载体的构建。 背景技术 0002 近年来随着。
8、传统化石燃料的临近枯竭， 加之环境问题也日益突出， 致使生物能源 越来越得到广泛的关注， 以微藻产油为代表的微藻生物燃料的生产， 尤其受到各国科学家 的重视。 因此利用现代生物技术强化微藻脂质代谢途径、 增加微藻的含油量、 增加富油微藻 生物量的累积， 来提高微藻产油的竞争力成为时下的热点。 其中莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)是微藻研究中的模式藻， 是研究油脂代谢基因的理想受体藻株。 莱茵衣藻的 油脂合成途径中， 甘油三酯 （TAG） 是油脂的主要成分， 代谢途径中TAG含量的多少取决于其 前体物质甘油-3-磷酸(G-3-P)的积累， 关键酶甘油-3-磷酸脱氢酶。
9、 （GPDH） 调控G-3-P的正向 合成， 直接影响TAG含量多少。 Vigeolas等在Brassica napus cv.中重组表达酵母菌甘油3- 磷酸酰基转移酶基因 （gpd1） 基因， 致使种子的含油量增加40%， 证实了gpd1基因对于TAG合 成的关键作用。 现有技术中存在使用外源gpd1基因提高莱茵衣藻TAG含量的技术， 但其是在 细胞壁缺陷型莱茵衣藻株系中使用珠磨法转化表达外源gpd1基因， 细胞壁缺陷型藻株需要 经过人为改造， 费时费力。 发明内容 0003 本发明针对现有技术需要细胞壁缺陷型藻株的缺点， 通过构建用于转化莱茵衣藻 的gpd1基因农杆菌双元表达载体， 使用农。
10、杆菌介导法转化野生型莱茵衣藻， 以提高莱茵衣 藻的含油量。 0004 本发明实现过程如下： 一种含有酿酒酵母gpd1基因的双元表达载体， 所述载体的构建方法包括以下步骤： （1）gpd1基因为序列表中SEQ ID No.3 所示DNA分子， 来自酿酒酵母的基因组， 通过嵌 套PCR得到， 并在基因两端添加EcoRI和NdeI酶切位点， 其引物序列为序列表中SEQ ID No.1 和SEQ ID No.2所示的DNA分子； （2） 将PCR 扩增后的反应液和载体pDBle用NdeI和EcoRI双酶切， 并将得到的酶切产物 用T4 DNA连接酶连接， 转化大肠杆菌DH5 ， 挑取单克隆扩大培养， 。
11、提取质粒双酶切验证， 将 阳性重组质粒命名为重组质粒pDBle-GPD1； （3） 将pDBle-GPD1与pRI101-AN质粒使用BamH I和KpnI 双酶切， 回收连接， 热激转化 DH5 的感受态细胞， Amp （100mg/L） 抗性的LB平板筛选培养， 阳性重组质粒命名为pRI101- GPD1。 0005 所述双元表达载体为pRI101-GPD1。 0006 上述含有酿酒酵母gpd1基因的双元表达载体的遗传转化方法， 包括以下步骤： 说明书 1/4 页 3 CN 106701811 A 3 （1） 制备农杆菌 LBA4404 感受态， 然后将重组质粒pRI101-GPD1通过冻。
12、融法转化到根 癌农杆菌， 得到含有gpd1基因的根癌农杆菌 LBA4404； （2） 将获得的阳性农杆菌 LBA4404 侵染莱茵衣藻FACHB479获得转gpd1基因莱茵衣藻； （3） 提取莱茵衣藻基因组DNA和RNA通过PCR及RT-PCR鉴定阳性转基因植株； （4） 选择莱茵衣藻转化株， 使用改良的尼罗红染色法经多功能酶标仪进行油脂含量鉴 定， 并在激光共聚焦显微镜下观察油脂染色情况。 0007 上述的双元表达载体在携带外源gpd1基因进入野生型具有细胞壁的莱茵衣藻基 因组中的应用， 利用携带双元表达载体的农杆菌LBA44044侵染野生型具有细胞壁的莱茵衣 藻FACHB-479， 在乙酰。
13、丁香酮的作用下将目的基因转入莱茵衣藻FACHB-479的基因组中， 并 用PCR、 RT-PCR和尼罗红染色法验证。 0008 本发明以具有细胞壁的野生型莱茵衣藻FACHB479作为受体细胞， 成功构建了用于 转化莱茵衣藻的gpd1基因农杆菌双元表达载体。 这不仅可以节省构建细胞壁缺陷型藻株的 人力物力， 而且可以对因为没有数据库而无法构建细胞壁缺陷型的其他微藻的转基因方法 具有一定的启发， 为将来高产油转基因微藻的研究提供了一些思路。 附图说明 0009 图1是 双元载体构建图； 图2是gpd1基因套嵌PCR分析图, A 第一次PCR， B 第二次PCR， M 2kb Marker; 图3是。
14、pMD-GPD1鉴定图， A PCR； BNde I和EcoR I双酶切:M 5kb Marker, 1 空白对照, 2 pMD-GPD1； 图4是质粒pMD-GPD1的gpd1测序比对图； 图5是质粒pDBle-GPD1双酶切验证图， M 15kb Marker, 1-2 pDBle-GPD1； 图6是质粒pRI101-GPD1双酶切验证图， M 15kb Marker, 1-2 pRI-Ble-GPD1； 图7是质粒pRI101-GPD1的gpd1测序比对图； 图8是转化藻株在Ble抗性TAP上的培养图， 1： 野生型FACHB-479， 2： FACHB-GPD1， 3： 空载 体PRI。
15、101-AN转化藻FACHB-479； 图9是不同藻株中gpd1基因的分子生物学分析图； A： PCR， B： RT-PCR M: 5kb Marker, 1： 阴性对照 （无模板） , 2： 阳性对照, 3： 野生型FACHB-479 , 4-12： 转化藻株； 图10是藻细胞激光共聚焦图； 图11是不同藻株油脂含量测定图。 具体实施方式 0010 1gpd1基因莱茵衣藻双元表达载体pRI101-GPD1的构建方法 根据gpd1基因序列 （NCBI GenBank登录号为NC_001136.10） ， 在上下游增加酶切位点， 用Oligo7软件设计引物， 序列为序列表中序列1和序列2， 由公。
16、司合成。 试剂盒法提取酿酒酵 母DNA， 采用嵌套PCR方法扩增gpd1。 PCR体系为20 L， 含有上下游引物终浓度各0.5 mol/L， dNTPs终浓度为125 mol/L， 10Pyrobest Buffer 2 L， Pyrobest DNA Polymerase 1U。 扩 增程序为94 10min， 94 1min， 55 1min， 72 2min， 进行30个循环， 72 10min。 1%琼 脂糖凝胶电泳分离PCR产物， 回收gpd1基因， 电泳结果显示扩增出1175bp的DNA片段 （图2） 。 说明书 2/4 页 4 CN 106701811 A 4 gpd1的3 端。
17、加碱基A连接到载体pMD18-T， 热激转入DH5 感受态细胞， 涂于附加有100mg/L Amp的LB平板， 37培养出单菌落， 再液体培养过夜。gpd1片段的PCR扩增结果 （图3） 以及Nde I和EcoR I双酶切结果 （图3） 均可以得到1175bp的预期电泳条带， 公司测序验证 （图4） 重组 质粒pMD-GPD1中的gpd1序列与酿酒酵母gpd1基因 （NCBI GenBank登录号NC_001136.10） 100%吻合。 。 0011 用Nde I和EcoR I 酶37 4h分别酶切质粒pMD-GPD1和pDBle， 回收产物连接， 热 激转化DH5 感受态细胞， 在Amp 。
18、（100mg/L） 抗性的LB平板培养。 阳性单菌落酶切鉴定为重组 质粒pDBle-GPD1。 经验证， 质粒pDBle-GPD1通过Nde I和EcoR I双酶切可以得到1175bp的预 期条带 （图5） 。 0012 进行pDBle-GPD1与pRI101-AN质粒的BamH I和KpnI 37 2h酶切， 回收连接， 热激 转化DH5 的感受态细胞， Amp （100mg/L） 抗性的LB平板筛选培养， 阳性单菌落酶切鉴定命名 为pRI101-GPD1， 构建成功的质粒pRI101-GPD1， 用BamH I和Kpn 进行双酶切得到4930bp条 带 （图6） 。 0013 2 pRI1。
19、01-GPD1转化农杆菌 取双元载体pRI101-GPD1冻融法转化到LBA4404的感受态细胞， 在Amp （100mg/L） 抗性的 YEB平板筛选， 阳性克隆菌测序验证载体gpd1序列正确 （图7） 。 同时以空载体pRI 101-AN相 同条件转化LBA4404的感受态细胞， 培养得到空载体转化农杆菌。 0014 上述冻融法转化方法如下： 取 0.1 g 重组质粒pRI101-GPD1加入到 100 l 的 LBA4404 感受态细胞中， 冰置60- 90min； 液氮速冻5min， 迅速取出， 28水浴热激5min； 加入 500 l YEB 液体培养基， 28， 100 rpm 培。
20、养 2-3h； 将菌液均匀涂布在含有Str (100mg/l） 和 Amp ( 100mg/L)的 YEB 固 体培养基上进行筛选。 挑取阳性克隆送进行公司测序， 目的基因序列与 Genebank 中的序 列(GenBank登录号为NC_001136.10)100%相同， 且插入位点正确(图7)， 说明含gpd1基因的 重组质粒 pRI101-GPD1已成功转入到农杆菌LBA4404 中。 0015 3 莱茵衣藻的遗传转化 将FACHB479藻液于附加100 mol/l乙酰丁香酮的TAP平板上， 预培养5d的藻落接受200 l含载体pRI101-GPD1的LBA4404悬浮液的均匀涂布浸染， 。
21、在252， 1500-2000lx， 光暗1:1 条件共培养48h后， 收获藻细胞。 同步进行FACHB479的含空载体的农杆菌转化培养。 0016 培养可以收获到阳性转化藻 （图8） ， 单藻落编号后Ble （10ng/ L） 抗性的TAP液体继 代培养， 可以收集到大量的不同转化株系的藻细胞。 而野生型FACHB-479和空载体PRI101- AN转化藻FACHB-479均不能在含有10ng/ LBle的TAP培养基中上生长。 0017 4 转化莱茵衣藻藻株的阳性鉴定 取培养至对数生长中期(细胞浓度3105个/mL)的转化藻株， 采用改良的CTAB法提取 藻细胞基因组DNA， PCR检测g。
22、pd1的整合。 Trizol法提取藻细胞RNA， 用 TaKaRa 的 PrimeScriptTM 1 st Strand cDNA Synthesis Kit 试剂盒反转录cDNA， rtPCR检测gpd1 的表达。 其中PCR与rtPCR引物均使用gpd1-F，gpd1-R； 20 L的反应体系中， 包含模板各1 L， 上下游引物各1 L （10 mol/L） ， Premix Taq10 L； 反应程序为94 10min， 9430s， 59 30s， 72 1min， 30个循环程序扩增， 72 10min。 0018 筛选到的抗性藻株， 显示部分抗性藻株可扩增出约1175 bp的gp。
23、d1基因目标条带， 说明书 3/4 页 5 CN 106701811 A 5 而野生型FFACHB-479、 及空载体pRI 1001-AN转化藻株未扩增出目的条带。 提取藻株的总 RNA， 反转录PCR （RT-PCR） 检测 （图9） 到部分转化藻株的gpd1基因目标1175 bp条带清晰可 见， T4、 T5、 T6、 T7、 T10、 T12确定为转基因藻株。 0019 上述CTAB法具体步骤如下： 取 0.2g 莱茵衣藻， 液氮充分研磨， 加 650 l 2CTAB 65水浴 1h 期间每隔 10 min 摇一次； 然后加入等体积的氯仿： 异戊醇(24:1)， 室温放置 30 min。
24、， 12 000 rpm 离心 10min， 取上清(用减过的枪头， 避免破坏基因组 DNA)， 重复一次； 上清加入 2 倍体积-20 预冷的无水乙醇， 沉淀 2h 以上， 12 000 rpm 离心 10 min， 用 70%的无水乙醇洗涤沉淀两 次， 离心， 彻底吸干乙醇， 待干燥后， 加入 200 l 的 ddH2O， 4过夜溶解， 置-20保存备 用。 0020 上述Trizol法具体步骤如下： 取 0.2g 莱茵衣藻， 液氮充分研磨， 迅速转入预冷的 1.5ml 的 EP 管中， 加入 1ml TRIzol 试剂混匀； 1530放置 5min， 使核酸蛋白复合物完全分离； 4， 1。
25、0 000 rpm 离心 10min， 取上清； 加 0.2ml 氯仿盖好管盖， 剧烈震荡 15s， 室温放置 3min； 4， 10 000 rpm 离心 10 min， 样品分三层(底层有机相/中间相/上层无色水相)， RNA 存在于水相最上层， 转移水相至新 EP 管， 加入 0.5ml 异丙醇沉淀， 4， 10 000 rpm 离心 10 min， 取上清； 加 1ml 75%乙醇(使用 DEPC 处理过的水配制)洗涤沉淀， 4， 7 500 rpm 离心 10 min， 弃上 清； 室温放置晾干， 沉淀为 RNA， 加 25200 l DEPC 水， 5560放置 10min 溶解，。
26、 置-80 保存备用。 0021 5 阳性转基因藻株的油脂鉴定 取对数生长中期(细胞浓度3105个/mL)的gpd1转化藻株1mL， 加入800 L尼罗红贮存 液(0.1g/L Nile red/Methanol)混匀 （终浓度44mg/L） ， 用铝箔包好离心管， 23避光染色 15min， 3000rpm， 30s收集藻细胞， 用TAP液体培养基洗去多余的染色液。 激发波长485nm、 发 射波长590nm条件下， 激光共聚焦显微镜观察记录。 同时取上述染色的莱茵衣藻细胞200 L 分别加入96孔板中， 多功能酶标仪在激发波长485nm， 检测波长590nm条件下测定荧光值 （a.u. ）。
27、 ， 分析不同藻株油脂情况。 0022 采用油脂尼罗红染色方法分析转基因藻FACHB-GPD的油脂含量。 在激光共聚焦显 微镜视野中， FACHB-GPD细胞整体呈红色， 亮黄色显示了细胞内存在的油脂， 大小和数目显 著高于野生型藻FACHB （图10） 。 使用多功能酶标仪测定油脂含量， 优化的尼罗红染色-荧光 检测条件为终浓度44mg/L的尼罗红甲醇溶液， 23避光染色15min， 得到的转基因藻液的荧 光值均高于野生型藻株 （图11） ， 检测藻株油脂含量为对照藻株的1.31.52倍。 说明书 4/4 页 6 CN 106701811 A 6 SEQUENCE LISTING 西北大学 。
28、一种用于转化莱茵衣藻的gpd1基因农杆菌双元表达载体的构建方法 2016 3 PatentIn version 3.5 1 30 DNA Artificial sequence 引物 1 ggaattccat atgtctgctg ctgctgatag 30 2 26 DNA Artificial sequence 引物 2 cggaattcct aatcttcatg tagatc 26 3 1176 DNA Saccharomyces cerevisiae 3 atgtctgctg ctgctgatag attaaactta acttccggcc acttgaatgc tggtagaaag 。
29、60 agaagttcct cttctgtttc tttgaaggct gccgaaaagc ctttcaaggt tactgtgatt 120 ggatctggta actggggtac tactattgcc aaggtggttg ccgaaaattg taagggatac 180 ccagaagttt tcgctccaat agtacaaatg tgggtgttcg aagaagagat caatggtgaa 240 aaattgactg aaatcataaa tactagacat caaaacgtga aatacttgcc tggcatcact 300 ctacccgaca atttgg。
30、ttgc taatccagac ttgattgatt cagtcaagga tgtcgacatc 360 atcgttttca acattccaca tcaatttttg ccccgtatct gtagccaatt gaaaggtcat 420 gttgattcac acgtcagagc tatctcctgt ctaaagggtt ttgaagttgg tgctaaaggt 480 gtccaattgc tatcctctta catcactgag gaactaggta ttcaatgtgg tgctctatct 540 ggtgctaaca ttgccaccga agtcgctcaa gaac。
31、actggt ctgaaacaac agttgcttac 600 cacattccaa aggatttcag aggcgagggc aaggacgtcg accataaggt tctaaaggcc 660 序列表 1/2 页 7 CN 106701811 A 7 ttgttccaca gaccttactt ccacgttagt gtcatcgaag atgttgctgg tatctccatc 720 tgtggtgctt tgaagaacgt tgttgcctta ggttgtggtt tcgtcgaagg tctaggctgg 780 ggtaacaacg cttctgctgc catcca。
32、aaga gtcggtttgg gtgagatcat cagattcggt 840 caaatgtttt tcccagaatc tagagaagaa acatactacc aagagtctgc tggtgttgct 900 gatttgatca ccacctgcgc tggtggtaga aacgtcaagg ttgctaggct aatggctact 960 tctggtaagg acgcctggga atgtgaaaag gagttgttga atggccaatc cgctcaaggt 1020 ttaattacct gcaaagaagt tcacgaatgg ttggaaacat gtg。
33、gctctgt cgaagacttc 1080 ccattatttg aagccgtata ccaaatcgtt tacaacaact acccaatgaa gaacctgccg 1140 gacatgattg aagaattaga tctacatgaa gattag 1176 序列表 2/2 页 8 CN 106701811 A 8 图1 说明书附图 1/6 页 9 CN 106701811 A 9 图2 图3 说明书附图 2/6 页 10 CN 106701811 A 10 图4 图5 说明书附图 3/6 页 11 CN 106701811 A 11 图6 图7 说明书附图 4/6 页 12 CN 106701811 A 12 图8 图9 说明书附图 5/6 页 13 CN 106701811 A 13 图10 图11 说明书附图 6/6 页 14 CN 106701811 A 14 。