分离型前胶原氨基末端肽的方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102093465 A (43)申请公布日 2011.06.15 CN 102093465 A *CN102093465A* (21)申请号 200910250478.9 (22)申请日 2009.12.10 C07K 1/36(2006.01) C07K 1/30(2006.01) C07K 1/20(2006.01) C07K 1/18(2006.01) C07K 1/16(2006.01) (71)申请人 北京北方生物技术研究所 地址 100076 北京市丰台区潘家庙甲 20 号 (72)发明人 赵玉军 (54) 发明名称 分离型前胶原氨基末端肽的方法 (57)。

2、 摘要 本发明涉及一种分离 III 型前胶原氨基末 端肽的方法， 解决了 III 型前胶原氨基末端肽的 提取方法、 效率、 纯度、 活性的问题， 采用硫酸氨 分级分离发法， 第一步将杂质减少了 5.5， 而得 率增加了 11.7， 采用 Qsepharose FF， 上样量 大， 流速快， 进一步分离未采用 pH4.5 和 pH8.5 的缓冲液变换洗脱， 而采用对蛋白有保护作用的 疏水层析， 纯度和活性大大提高， 用高分辨率的 Superdex200 代替 Sephacryl200， 进一步提高纯 度， 经 SDS-PAGE 分析纯度达 98， 活性是现有技 术的 10 倍。 (51)Int.。

3、Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 2 页 CN 102093472 A1/1 页 2 1. 一种分离 III 型前胶原氨基末端肽的方法 ： 离体腹水2升， 提取PIIINP， 10000RPM离心， 收集硫酸氨浓度达到4060的馏分， 方 法为加入硫酸氨后搅拌过夜， 10000RPM 离心， 收集沉淀， 弃上清 ； 用 BufferA 透析上述沉淀 并使浓度为 1mg/ml， 调溶液的 pH 为 5.6， 搅拌 4 个小时， 10000RPM 离心， 收集沉淀， 弃上清 ； 用 BufferA 透析上述沉淀并使浓度为 1mg/ml，。

4、 上阴离子交换柱去掉硷性蛋白的同时， 收集 40 60即 BufferB 部分 ； 上述收集物用 BufferC 0.1m HAC-NaAC， pH4.4 透析， 上阳离子 交换柱 CM-SepharoseFF， 去掉酸性蛋白的同时， 用 BufferC 和 BufferA 进行梯度洗脱， 收集 20 50 馏分 ； 浓缩成 5mg/ml， 取 200ul 上 superdex200 分子筛层析， 收集 45KD 位置的峰， 浓缩成 1mg/ml， 加入叠氮钠， PMSF。 权 利 要 求 书 CN 102093465 A CN 102093472 A1/2 页 3 分离 III 型前胶原氨基。

5、末端肽的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种分离 III 型前胶原氨基末端肽的方法。 背景技术 0002 现有的提纯方法是都采用了 DEAE-Sephacel 离子交换柱及 Sephacryl 分子筛， 经验证此法纯化效率不高， 杂蛋白与活性峰分不开， 而且纯化的 pIIIINP 活性不高， 活 性下降极快， 纯度无法满足高精度实验要求。最主要是， 得率太低， 经测算 (RIA-Gnost Prokollagen-III-Peptid)， 用此法提纯 95的 PIIINP1mg 需要 PIIINP 的有效含量达 100mg 以上。 0003 第一步加 (NH4)2SO4 没有分级将大部杂质。

6、带入后续阶段， 而且这一步也仅能去掉 10的杂蛋白。 0004 0005 上述方法所用的DEAE-Sephacel离子交换柱及Sephacryl分子筛分辨率不高是造 成纯度低、 效率低的主要原因， 长时间采用pH4.5和pH8.5的缓冲液洗脱及未完全去除的杂 质导致 pIIIINP 活性不高。 0006 采用 (NH4)2SO4 沉淀， 二次不同 pH 的及 Sephacel S-200 分子筛柱层析从人癌性 腹水中分离并纯化了PIIINP， 并制备了抗血清， 经取癌性腹水3L， 加固体(NH4)2SO4到40 饱和度， 搅拌过夜， 静置4h， 16000g离心20min， 弃上清液， 将沉淀。

7、溶于50mmol/L Tris-HCl， 2mmol/L EDTA， 2mmol/LNEM， 2mmol/LPMB， 1mmol/LPMSF， 2mmol/L ICH2COONa， 2mmol/ L(NH2)2CO 的缓冲液中， pH8.6。并与该缓冲液做充分透析， 以除去样品中的 (NH4)2SO4。 经 DEAE-Sephacel 离子交换柱层析， 用上述缓冲液做 NaCl 阶段洗脱。洗脱后的活性峰部 分与 10mmol/L 柠檬酸盐缓冲液 pH4.5 充分透析后， 25000g 离心 60min。取上清液， 再经 DEAE-Sephacel 离子交换柱， 用 00.6mmol/LNaCl。

8、， 10mmol/L 柠檬酸盐缓冲液 pH4.5 作 线性梯度洗脱， 在 232nm 处检测蛋白峰， 用西德 PIIIP 药盒检测 PIIIP 活性峰， 合并活性峰 部分， 与10mmol/LNH4HCO3充分透析后， 冷冻干燥， 经Sephacryl S-200分子筛柱层析， 收集 PIIIP 活性峰， 合并， 与 10mmol/LNH4HCO3 充分透， 分装， 冷冻干燥， 置 -20C 保存。全部提纯 过程均在 4-8C 下进行。上述方法的缺点 ： 1) 纯化效率、 纯度不高， 杂蛋白与活性峰分不开 ； 2) 纯化的 pIIIINP 活性不高， 活性下降极快。 发明内容 0007 本发明。

9、是要解决 III 型前胶原氨基末端肽的提取方法、 效率、 纯度、 活性的问 题。采用硫酸氨分级分离发法， 第一步将杂质减少了 5.5， 而得率增加了 11.7。采用 说 明 书 CN 102093465 A CN 102093472 A2/2 页 4 Qsepharose FF， 上样量大， 流速快， 分辩高， 大大提高了效率。进一步分离未采用 pH4.5 和 pH8.5 的缓冲液变换洗脱， 而采用对蛋白有保护作用的疏水层析， 纯度和活性显著提高， 用 高分辨率的 Superdex200 代替 Sephacryl200， 进一步提高纯度。经 SDS-PAGE 分析纯度达 98， 活性是现有技术。

10、的 10 倍。 具体实施方式 0008 为了获得免疫活性好的抗体， 从人癌性腹水中提取 PIIINP， 免疫家兔。取癌性病 人腹水 2 升， 10000RPM 离心， 目的是去掉组织块和癌性细胞 ； 这一步必须穿戴防护手套和眼 镜， 因为决大多数肝癌病人都携带肝炎病毒 ； 0009 分级收集硫酸氨浓度达到4060(根据不同病人而变化)的沉淀， 加入硫酸氨 后要搅拌过夜， 10000RPM 离心， 收集沉淀， 弃上清 ； 0010 由于腹水杂蛋白含量达80mg/ml， 而有效含量60600ng/ml， 仅为百万分之一， 所 以直接用柱层析方法是不可能将痕量的 pIIINP 分离出来。根据序列分析。

11、， PIIINP 的等电 点为 5.71。因此， 用 BufferA 透析上述沉淀并使浓度为 1mg/ml， 调溶液的 pH 为 5.6， 搅拌 4 个小时， 10000RPM 离心， 收集沉淀， 弃上清 ； 0011 用 BufferA 透析上述沉淀并使浓度为 1mg/ml， 上阴离子交换柱去掉硷性蛋白的同 时， 收集 40 60 (BufferB) 部分 ； 0012 上 述 收 集 物 用 BufferC(0.1m HAC-NaAC， pH4.4) 透 析，上 阳 离 子 交 换 柱 CM-SepharoseFF， 去掉酸性蛋白的同时， 用BufferC和BufferA进行梯度洗脱， 收。

12、集2050 馏分 ； 0013 浓缩成5mg/ml， 取200ul上superdex200分子筛层析， 收集45KD位置的峰， 浓缩成 1mg/ml， 加入叠氮钠， PMSF， 最后进行纯度鉴定和免疫学鉴定， 将合格品保存 ； 0014 用法国CIS公司的三型前胶原肽免放药盒OCFKO7-PIIIP(国家食品药品监督管理 局特殊药品进口准许证 P-04-05-27-03) 检验各峰中 PIIINP 的含量， 获得纯度高的 PIIINP 进行免疫。 0015 用 PIIINP-R 和 PIIINP-Ag 分别标记 125I 然后替代药盒中的相同组份， 检验试剂盒 的各种组分。结果 PIIINP-。

13、R 组总有部分 ( 且只有部分 ) 组分完全符合免疫学检验对药盒 的各项指标， 但 B0 偏低。而 PIIINP-Ag 各项指标 B0 达到 70 以上， 但非特异稍高。 0016 本发明解决了 III 型前胶原氨基末端肽的提取方法的问题。首先在初提阶段增加 20硫酸氨分级沉淀为以后的进一步分离奠定了基础。 选用高分辩率的Qsepharose FF(阴 离子交换柱 )Superdex200( 分子筛层析 )。选用 Phenylsepharose Highperformence( 疏 水层析柱 )， 避免用 pH4.5 和 pH8.5 的缓冲液变换洗脱。选用 Qsepharose FF( 阴离子交换 柱)Phenylsepharose Highperformence(疏水层析柱)， 使分离效率大大提高。 离子交换和 分子筛层析选用高分辩率的 Qsepharose FF( 阴离子交换柱 )Superdex200( 分子筛层析 )， 使得纯度的提高。避免用 pH4.5 和 pH8.5 的缓冲液变换洗脱， 通过提高纯度提高活性。 说 明 书 CN 102093465 A 。