多节孢绿胶霉素类化合物及其用途.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201510112090.8 (22)申请日 2015.03.13 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104774239 A (43)申请公布日 2015.07.15 (73)专利权人 暨南大学 地址 510000 广东省广州市黄埔大道西601 号 (72)发明人 高昊陈国栋姚新生郭良栋 胡丹于洋赵琴冯晓琳 李小霞王高乾 (74)专利代理机构 北京中济纬天专利代理有限 公司 11429 代理人 张晓霞 (51)Int.Cl. C07J 71/00(2006.01) 。

2、A61K 31/58(2006.01) A61P 25/28(2006.01) A61P 25/14(2006.01) A61P 25/16(2006.01) 审查员 吴姗姗 (54)发明名称 多节孢绿胶霉素类化合物及其用途 (57)摘要 本发明属于天然产物药物领域， 具体涉及多 节孢绿胶霉素类化合物及其用途。 所述多节孢绿 胶霉素类化合物具有式(I)所示的结构。 本发明 还提供了式(I)化合物在制备预防或治疗神经退 行性疾病药物中的应用。 权利要求书1页 说明书7页 CN 104774239 B 2017.01.04 CN 104774239 B 1.一类多节孢绿胶霉素类化合物或其药学上可接。

3、受的盐， 具体结构式如下： 2.根据权利要求1所述的多节孢绿胶霉素类化合物或其药学上可接受的盐， 其特征在 于， 式(II)-式(IV)的多节孢绿胶霉素类化合物的药学上可接受的盐， 为式(II)-式(IV)的 多节孢绿胶霉素类化合物与盐酸、 氢溴酸、 硫酸、 硝酸无机酸或乙酸、 丙酸、 丙二酸、 丁酸、 乳 酸、 甲磺酸、 乙磺酸、 苯磺酸、 对甲苯磺酸、 马来酸， 苯甲酸、 琥珀酸、 苦味酸、 酒石酸、 柠檬酸、 富马酸有机酸形成的盐。 3.权利要求1所述的多节孢绿胶霉素类化合物或其药学上可接受的盐在制备预防或治 疗神经退行性疾病药物中的应用。 4.根据权利要求3所述的应用， 所述神经退行性。

4、疾病包括但不限于老年痴呆、 帕金森氏 症、 多发性硬化症和亨廷顿氏病中一种或几种。 5.根据权利要求4所述的应用， 所述老年痴呆为阿尔茨海默病、 血管性痴呆病、 路易体 痴呆病以及额颞痴呆。 6.一种药物制剂， 其由权利要求1所述的多节孢绿胶霉素类化合物或其药学上可接受 的盐与药学上可接受的载体组成。 权利要求书 1/1 页 2 CN 104774239 B 2 多节孢绿胶霉素类化合物及其用途 技术领域 0001 本发明属于天然产物药物领域， 具体涉及多节孢绿胶霉素类化合物及其用途。 背景技术 0002 老年痴呆是一种由脑部疾病引起的， 以进行性认知功能障碍和记忆损害为特征的 中枢神经系统退行。

5、性疾病综合征， 其表现为智力(包括记忆力、 学习能力、 方向辨认能力、 语 言能力、 理解能力以及判断力 )上的减退。 老年痴呆一股常见的有阿尔茨海默病 (Alzheimer sdisease， AD)、 血管性痴呆病(Vasculardementia， VA)、 路易体痴呆病 (DementiawithLewybodies， DLB)以及额颞痴呆(Frontotemporaldementia， FTD)等。 在 所有的痴呆患者中， 阿尔茨海默病患者占5070， 是老年痴呆中最常见的类型。 0003 目前已经上市治疗老年痴呆症的药物主要以乙酰胆碱酯酶抑制剂和N-甲基-D-天 门冬氨酸受体拈抗剂。

6、(NMDA)为主， 这些药物能在一定程度上改善患者的痴呆症状， 但不能 从根本上阻止病情的恶化、 逆转病情， 因此寻找抗老年痴呆症药物的研制已经引起全世界 的重视， 并已建立许多相关的生物活性筛选和评价体系。 在现有众多整体动物模型中， 果蝇 是人们最为熟知的模式生物之一。 果蝇有着其它模式动物不能比拟的优势， 如： 个体空间占 位极小(一股一个试剂瓶中可以培养上千只果蝇)、 饲养成本低、 易培养、 繁殖速度快且繁殖 能力强(筛选通量高)、 样品消耗量少(5-50mg)、 寿命周期短(约50天， 活性测试周期短)、 与 年龄相关的神经元退化明显， 是老年痴呆症等神经退行性疾病研究和药物筛选的理。

7、想模 型。 0004 绿胶霉素类化合物为由真菌产生的一系列C环芳香化且C-4和C-6位骈合一个呋喃 环的甾体化合物。 该类化合物具有抗菌活性、 植物毒性、 抗炎活性， 以及最近发现该类化合 物中的脱甲绿胶霉素具有抑制A 42聚集活性。 发明内容 0005 本发明的一个目的是提供一类多节孢绿胶霉素类化合物或其药学上可接受的盐， 具体结构式如下： 0006 0007 其中： 0008 R1、 R2、 R3和R4为氢、 羟基、 酮基或任选取代的C1-14烷基， 其中所述任选取代为任选被 下述取代基中的一个或多个取代： 卤素、 氰基、 羟基、 氨基和酮羰基， 其中所述烷基的一个或 多个CH2基团可各自。

8、独立地被-O-、 -S-、 -CO-O-、 -O-CO-、 -O-CO-O-或-CHCH-代替， 前提是 除了所列基团中允许的以外， 杂原子不直接相互连接。 说明书 1/7 页 3 CN 104774239 B 3 0009 在本发明进一步地实施方案中， 所述式(I)化合物优选为具有以下结构式的化合 物： 0010 0011 在本发明中， 式(I)的多节孢绿胶霉素类化合物的药学上可接受的盐， 为式(I)的 多节孢绿胶霉素类化合物与盐酸、 氢溴酸、 硫酸、 硝酸等无机酸或乙酸、 丙酸、 丙二酸、 丁酸、 乳酸、 甲磺酸、 乙磺酸、 苯磺酸、 对甲苯磺酸、 马来酸， 苯甲酸、 琥珀酸、 苦味酸、 。

9、酒石酸、 柠檬 酸、 富马酸等有机酸形成的盐。 0012 本发明的另一个目的是提供上述化合物在制备预防或治疗神经退行性疾病药物 中的应用。 神经退行性疾病是指神经元的结构或功能的渐进性的丧失， 包括神经元死亡。 所 述神经退行性疾病包括但不限于老年痴呆、 帕金森氏症、 多发性硬化症和亨廷顿氏病中一 种或几种； 优选为老年痴呆， 所述老年痴呆为阿尔茨海默病、 血管性痴呆病、 路易体痴呆病 以及额颞痴呆。 0013 上述化合物是通过多节孢属真菌(Nodulisporiumsp.)(菌株编号： 65-12-7-1)发 酵、 分离得到。 该菌株从采自中国云南紫溪山的条衣属地衣中分离， 经分类学研究鉴定。

10、为多 节孢属真菌(Nodulisporiumsp.)， 其18SrRNA基因序列的GenBank登录号为KC894854， 并 于2013年3月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(编号： 7332， 地 点： 中国北京朝阳区大屯路中科院微生物研究所， 100101)。 0014 尽管本发明的化合物可以不经任何配制直接给药， 但所述的各种化合物优选以与 药学上可接受的辅料制备成药物制剂使用。 药学上可接受的辅料包括稀释剂、 润滑剂、 粘合 剂、 崩解剂、 稳定剂、 溶剂等。 0015 本发明所述稀释剂包括但不限于淀粉、 微晶纤维素、 蔗糖、 糊精、 乳糖、 糖粉、 葡萄 糖等。

11、； 所述润滑剂包括但不限于硬脂酸镁、 硬脂酸、 氯化钠、 油酸钠、 月桂醇硫酸钠、 泊洛沙 母等； 所述粘合剂包括但不限于水、 乙醇、 淀粉浆、 糖浆、 羟丙基甲基纤维素、 羧甲基纤维素 钠、 海藻酸钠、 聚乙烯吡咯烷酮等； 所述崩解剂包括但不限于淀粉泡腾混合物即碳酸氢钠和 枸橼酸、 酒石酸、 低取代羟丙基纤维素等； 所述稳定剂包括但不限于多糖如金合欢胶、 琼脂、 藻酸、 纤维素醚和羧甲基甲壳酯等； 所述溶剂包括但不限于水、 平衡的盐溶液等。 0016 所述制剂包括各种固体口服制剂、 液体口服制剂、 注射剂等。 药剂学可接受的口服 剂固体制剂有： 普通片剂、 分散片、 肠溶片、 颗粒、 胶囊、。

12、 滴丸、 散剂等， 口服液体制剂有口服 液、 乳剂； 注射剂有： 小水针、 输液、 冻干粉针等。 各制剂可以根据常规的工艺制备而成。 说明书 2/7 页 4 CN 104774239 B 4 0017 药物制剂中含有的活性成份(即本发明化合物)的量可以根据患者的病情、 医生诊 断的情况特定的加以应用， 所用的化合物的量或浓度在一个较宽的范围内调节， 通常， 活性 化合物的量范围为组合物的190(重量)。 0018 本发明相对于现有技术， 具有以下的优点和有益效果： 本发明所示的多节孢绿胶 霉素类化合物是新的绿胶霉素类化合物； 本发明通过生物活性测试实验表明多节孢绿胶霉 素类化合物具有显著的抗老。

13、年痴呆症活性。 多节孢绿胶霉素可作为制备预防或治疗神经退 行性疾病的药物。 具体实施方式 0019 下面将进一步的来举例说明本发明。 需要指出的是， 以下说明仅仅是对本发明要 求保护的技术方案的举例说明， 并非对这些技术方案的任何限制。 本发明的保护范围以所 附权利要求书记载的内容为准。 0020 下列实施例中， 质谱仪为德国Bruker公司生产的amaZonSL质谱仪。 超导核磁共振 仪为BrukerAV-400和BrukerAV-500。 薄层色谱用硅胶GF254和柱色谱硅胶(200-300目)均 为青岛海洋化工厂产品。 反相ODS填料50 m为日本YMC公司产品。 中低压液相色谱仪为上海。

14、 利穗电子科技有限公司产品。 SephadexLH-20为美国AmershamPharmaciaBiotech有限公 司产品。 液相分离所使用半制备级色谱柱为PhenomexGeminiC18column(10.0250mm， 5 m)， 制备级色谱柱为PhenomexGeminiC18column(21.2250mm， 5 m)。 液相色谱用乙腈为 色谱纯， 水为双重蒸馏水， 其他试剂均为分析纯。 0021 实施例1多节孢属真菌65-12-7-1大量发酵及其样品前处理方法 0022 (1)多节孢属真菌65-12-7-1经PDA斜面活化后接种于PDB培养基， 在25下以 200r.min-1震。

15、荡培养5d制备种子液， 再按照5接种量接种到165个装有PDB培养基的三角烧 瓶(500mL)中， 25下以200r.min-1下震荡培养12d， 得到发酵液。 所述PDB培养基由以下按重 量体积比的组分组成： 土豆200g/L， 葡萄糖20g/L， 纯净水1L。 0023 (2)将发酵物加入乙酸乙酯进行浸泡提取2次， 将提取液减压浓缩至干， 得到粗提 物(11.5g)。 0024 实施例2式(II)-式(IV)化合物的制备 0025 粗提物经硅胶柱， 经环己烷和甲醇洗脱， 得到环己烷部分C(3.8g)和甲醇部分M (5.6g)； 然后对甲醇部分M进行中低压ODS柱层析， 依次用体积比为30 。

16、70、 50 50、 70 30、 90 10和100 0的甲醇-水梯度洗脱得到5个馏分M1、 M2、 M3、 M4、 M5)； 再将体积比50 50甲醇-水洗 脱得到的子馏分M2(1.8g)过中低压液相ODS柱层析， 依次用体积比30 70， 35 65， 40 60， 45 55， 50 50， 55 45， 100 0的甲醇-水梯度洗脱， 得到M2a， M2b， M2c， M2d， M2e， M2f， M2g， M2h， M2i， M2j和M2k共11个子馏分。 将体积比为35 65的甲醇-水洗脱得到的子馏分M2a(105mg)经 过反相半制备级HPLC制备， 使用乙腈-水(18 82，。

17、 v/v)流速为3mL/min进行洗脱， 得到式(IV) 化合物(tR： 31.6min， 13.5mg， 纯度95)； 将体积比35 65甲醇-水洗脱得到的子馏分M2b (371.0mg)经反相制备级HPLC制备， 流动相使用乙腈-水(20 80， v/v)流速为10mL/min进行 洗脱， 得到式(II)化合物(tR： 68.4min， 54.5mg， 纯度95)； 将体积比35 65的甲醇-水洗脱 得到的子馏分M2d(189.5mg)再经过SephadexLH-20凝胶柱层析， 使用甲醇为流动相， 洗脱 600mL得到M2da， M2db， M2dc， M2dd和M2de共五个子馏分， 。

18、再将从第320mL到第385mL收集得到 说明书 3/7 页 5 CN 104774239 B 5 子馏分M2dd(54.2mg)经过反相半制备级HPLC制备， 使用乙腈-水(25 75， v/v)流速为4mL/ min进行洗脱得到式(III)化合物(tR： 44.2min， 2.2mg， 纯度95)。 0026 所获得的化合物的理化常数如下： 0027式(II)化合物： 无色片状结晶；UV(MeOH) max(log ) 203(3.90)， 220(3.75)， 261(3.91)， 315(3.81)nm； CD(c2.910-4M， MeOH) max( )： 209(+ 1.78)，。

19、 225(-5.60)， 246(+2.61)， 271(-8.97)， 307(+4.78)， 357(-0.81)； IR(KBr)vmax3509， 3361， 2958， 2934， 2863， 1728， 1649， 1614， 1444， 1397， 1338， 1074， 1057cm-1； ESI-MS (positive)m/z365M+Na+， 7072M+Na+； HRESIMS(positive)m/z343.1543M+H+ (calcd.forC20H23O5， 343.1545)确定该化合物的分子式为C20H22O5； 13C和1HNMR见表1。 0028式(II。

20、I)化合物： 淡黄色无定形粉末；UV(MeOH) max (log )205(4.18)， 231(3.96)， 261(3.91)， 302(3.75)nm； CD(c2.910-4M， MeOH) max( )： 224(-4.66)， 267(-6.28)， 305(+3.02)； IR(KBr)vmax3390， 3094， 2931， 2869， 1742， 1694， 1619， 1517， 1473， 1146， 1106cm-1； ESI-MS(positive)m/z363M+Na+， 7032M+Na+； ESI-MS (negative)m/z339M-H-， 375M+。

21、C1-； HRESIMS(positive)m/z341.1384M+H+ (calcd.forC20H21O5， 341.1389)确定该化合物的分子式为C20H22O5； 3C和1HNMR见表1。 0029式(IV)化合物： 白色粉末；UV(MeOH) max(log)204 (3.97)， 220(3.81)， 261(3.97)， 310(3.86)nm； CD(c2.910-4M， MeOH) max( )： 209(+ 3.79)， 226(-4.30)， 246(+0.89)， 268(-3.04)， 307(+3.59)， 348(-0.95)； IR(KBr)vmax3421。

22、， 2922， 2851， 1729， 1658， 1618， 1458， 1420， 1380， 1040cm-1； ESI-MS(positive)m/z343M+H +； ESI-MS(negative)m/z341M-H-； HRESIMS(positive)m/z343.1550M+H+(calcd.for C20H23O5， 343.1545)确定该化合物的分子式为C20H22O5； 13C和1HNMR见表1。 0030 表1式(II)-式(IV)化合物的13CNMR及1HNMR数据和归属(DMSO-d6为测试溶剂) 说明书 4/7 页 6 CN 104774239 B 6 003。

23、1 0032 0033 a： inppm， JinHz， 1HNMR(400MHz)，13CNMR(100MHz)， inDMSO-d6 0034 b： inppm， JinHz， 1HNMR(500MHz)，13CNMR(125MHz)， inDMSO-d6 说明书 5/7 页 7 CN 104774239 B 7 0035 c： Overlappedsignalsarereportedwithoutdesignatingmultiplicity. 0036 实施例3化合物提高老年痴呆果蝇学习记忆活性测试方法 0037 (1)老年痴呆果蝇的培育 0038 w1118(isoCJ1)作为实验的。

24、对照组背景果蝇， 简记为 “2U” 。 成功转入致病性A 42蛋白 的果蝇为(UAS-A 42； 简记为 “H29.3” )。 该品系果蝇通过与全脑表达Gal4启动子果蝇进行杂 交， 获得携带elav-GAL4c155(P35)与A 42的果蝇品系。 0039 (2)老年痴呆果蝇的给药 0040 试验设置健康果蝇无药对照、 疾病果蝇无药对照和疾病果蝇给药的三种组别。 0041 所有测试果蝇的亲本均在恒温24， 恒湿42RH(Relativehumidity)的蝇房饲 养和繁殖。 果蝇羽化后的第一天将对照组果蝇及疾病组果蝇和待喂药组果蝇通过二氧化碳 麻醉之后， 挑选正确性状的果蝇在含有食物的玻璃。

25、管中。 在给药阶段， 所有测试果蝇在28 恒温和42恒湿的保温箱内饲养， 以保证果蝇吃药的效率。 每日果蝇喂药4小时， 从挑出果 蝇的第二天一直喂药到第8天。 0042 所喂药物在挑蝇第二天配制并与配制当天给果蝇喂药。 100DMSO溶解使其浓度 为10mM。 在配制工作液时， 利用含有4的蔗糖将10mM母液稀释至100 M。 另外， 对照组果蝇 喂含有1DMSO的糖水。 对于每个行为指数(PerformanceIndex)， 需要有2管果蝇组， 每管 中含有约100只果蝇。 0043 实验在恒温25、 恒湿70， 避光的行为房中进行， 方法可见参考文献1-3。 0044 1)在训练阶段， 将。

26、大约100只左右的果蝇装入安置有铜网交叉电极的训练管， 先后 通入辛醇(OCT)和甲基环己醇(MCH)两种气味各60s， 中间间隔45s的新鲜空气。 在通入第一 种气味(CS+)的同时给予果蝇60V的脉冲电击刺激(US， 脉冲时长1.5s， 间隔3.5s)。 通入第二 种气味(CS-)时不给予电击。 如此完成一个训练周期。 0045 2)在瞬时记忆(学习)能力测试中， 完成一个训练周期的果蝇被立即转移到T-Maze 的选择点， 同时从相对的两个方向通入CS+和CS-。 经过2min的选择后两侧的果蝇被分别收 集， 麻醉或处死后进行计数。 行为指数(Performanceindex， PI)的计。

27、算公式如下： PI (CS-)-(CS+)/(CS-)+(CS+)100。 0046 分别使用OCT和MCH作为CS+进行训练和测试， 得到的两个PI的平均值作为一次实 验的PI使用。 PI0表示测试中果蝇对于两种气味的选择为5050， 即没有形成记忆； PI 100表示测试中果蝇全部逃避伴随电击的气味， 即完美记忆。 进行活性测试时， 同时进行不 喂药的同遗传背景健康蝇(2U*H29.3)、 不喂药的老年痴呆疾病蝇(P35*H29.3)、 喂测试药的 老年痴呆疾病蝇的嗅觉短期记忆缺陷测试， 分别计算它们的总学习记忆行为指数(PI)。 将 喂测试药的老年痴呆疾病蝇学习记忆行为指数与不喂药的同遗。

28、传背景健康蝇(2U*H29.3) 行为指数、 不喂药的老年痴呆疾病蝇(P35*H29.3)行为指数相比较， 评价测试药物抗老年痴 呆的作用。 喂食测试物的老年痴呆疾病蝇学习记忆行为指数相对越高则说明测试物抗老年 痴呆作用越强。 采用T检验比较， 喂食测试物的老年痴呆疾病蝇学习记忆行为指数和不喂药 (仅给不含药样品的溶剂)的老年痴呆疾病蝇学习记忆行为指数， P0.05为有明显差别， P 0.01为有显著差别， P0.001为有极显著差别。 0047 数据分析和图形展示通过使用GraphPadPrism5.03进行处理； 具体结果见表2： 0048 表2化合物提高老年痴呆果蝇学习记忆活性结果 说明。

29、书 6/7 页 8 CN 104774239 B 8 0049 0050 0051 2U*H29.3代表健康果蝇； P35*H29.3代表疾病果蝇； 美金刚为表阳性对照药治疗 组。 药物治疗组给药浓度为100 M。 与2U*H29.3组比较， *P0.001； 与P35*H29.3组比较， #P 0.001； 与对比化合物组比较，n8， t-test。 0052 对比化合物为CN103316020A公开的脱甲绿胶霉素具体结构式。 0053 实施例4多节孢绿胶霉素类化合物对A 42淀粉样蛋白聚集的影响 0054 0.1mgA 42蛋白冻干粉溶于10 LDMSO和543.78 L磷酸缓冲液体系中配。

30、置成终浓度 为40 M的A 42蛋白储备溶液。 12.5 L待检测样品溶液(浓度为100 M)、 25 LA 42蛋白储备溶 液及12.5 LThT储备液(浓度为80 M)加于96孔板板孔中， 混合并置96孔板振荡仪以90rpm振 荡15min后于37二氧化碳培养箱静置孵育16h。 16h后， 利用英国TTPLabtech公司的高速 细胞分析仪(AcumeneX3型)405通道测定其荧光强度。 0055 活性物质的抗A 42蛋白聚集活性的计算： Vi(F0-Fi)/F0100。 其中， Vi为相对 抑制率， Fi为加入待测样品后的A 42聚集物的荧光强度， F0为未加入待测样品时的A 42聚集 物的荧光强度。 0056 具体结果如表3： 0057 表3化合物抑制A 42蛋白聚集活性结果 0058 0059 本发明内容仅仅举例说明了要求保护的一些具体实施方案， 其中一个或更多个技 术方案中所记载的技术特征可以与任意的一个或多个技术方案相组合， 这些经组合而得到 的技术方案也在本申请保护范围内， 就像这些经组合而得到的技术方案已经在本发明公开 内容中具体记载一样。 说明书 7/7 页 9 CN 104774239 B 9 。