一株烟草节杆菌及其在水产养殖中的应用.pdf

本发明从三文鱼循环水养殖废水处理塔内的水样中筛选到烟草节杆菌YY-9，已于2014年6月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，编号为CCTCC NO：M2014278，其对养殖废水中的氨态氮具有很强的降解能力，48h处理后氨态氮的去除率高达92.70％，净水效果显著；本发明还利用上述烟草节杆菌YY-9直接处理小棚虾养殖池中的水体，处理48h后NH4+-N的去除率高达90.28％，因此，所述烟草节杆菌YY-9能有效解决水产养殖氨态氮过高的问题，减轻高密度养殖对水体的污染。

1.一种烟草节杆菌(Arthrobacternicotianae)YY-9，其特征在于，所述的烟草节杆菌的保藏编号为CCTCCNO:M2014278。 2.权利要求1所述的烟草节杆菌在水体净化中的应用。 3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的水体为水产养殖水体或生活污水。 4.一种微生物添加剂，所述的微生物添加剂是由权利要求1所述的烟草节杆菌发酵制备的。 5.权利要求4所述的微生物添加剂，其为菌粉。

技术领域

本发明涉及功能微生物筛选技术领域，具体涉及一株具有异养亚硝化功能的烟草 节杆菌及其应用。

背景技术

近几年来，我国水产养殖业迅猛发展，集约化、高密度养殖规模日益扩大，集中投 饵造成养殖水体中积累大量的残饵、粪便及动植物尸体，导致水体氮元素含量严重超标，富 营养化加剧，使得养殖生态环境遭到破坏，鱼虾病害频发，最终造成巨大的经济损失。亚硝 化是将氨态氮转化为亚硝态氮，是自然界中氮循环中的重要一环。随着水产养殖高密度的 发展，投饵量持续上升，自然界中脱氮负荷不断加大，造成氮的积累。研究表明，水产动物致 病的主要根源是养殖水体中氨态氮含量的严重超标，尤其是在pH高的时候，氨态氮的毒性 更强。所以，控制养殖水体中的氨态氮成为水产养殖水质处理的重点，也是难点。

与物理脱氮法相比，生物脱氮有其独特的优点：无二次污染，脱氮彻底，经济安全 等。由于生物脱氮技术具有成本低、易操作、达标排放可靠性强且无二次污染等优点，逐渐 成为食品工业废水处理的主要方式。通过选择性培养基筛选分离异养亚硝化细菌，并对异 养亚硝化细菌的各种生长特性和脱氮特性进行深入研究，对养殖废水、生活废水及工业污 水的脱氮处理有着重要的理论价值和实际意义。

发明内容

本发明的目的是提供一株新型烟草节杆菌菌株。所述烟草节杆菌具有异养及亚硝 化性能，能够显著降低水体中氨态氮的含量，从而起到净化水体的作用。

本发明一方面提供了一株烟草节杆菌(Arthrobacternicotianae)YY-9，已于 2014年6月24日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为 CCTCCNO：M2014278。

本发明的另一方面提供了包含上述烟草节杆菌YY-9的微生物制剂。

所述微生物制剂为上述烟草节杆菌YY-9的菌粉。

本发明还提供了上述烟草节杆菌YY-9在水产养殖或生活污水处理中的应用。

本发明的有益效果：

本发明从三文鱼循环水养殖废水处理塔内的水样中筛选到烟草节杆菌YY-9，其对 养殖废水中的氨态氮具有很强的降解能力，48h处理后氨态氮的去除率高达92.70％，净水 效果显著；本发明还利用上述烟草节杆菌YY-9直接处理小棚虾养殖池中的水体，处理48h后 NH4+-N的去除率高达90.28％，因此，所述烟草节杆菌YY-9能有效解决水产养殖氨态氮过高 的问题，减轻高密度养殖对水体的污染。

具体实施方式

实施例1菌株的分离、筛选与鉴定

1、样品

取自烟台东方海洋集团三文鱼循环水养殖废水处理塔内的水样；

2、异养亚硝化培养基配方：

物质名称 用量 (NH4)2SO4 0.5g 琥珀酸钠 5.62g 维氏盐溶液 50.0mL H2O 定容至1000.0mL

3、筛选方法

首先梯度稀释上述水样：取0.1mL稀释后的水样均匀涂布于上述异养亚硝化培养 基表面，置入恒温培养箱，30℃下培养2～3d后，用接种环挑取培养基上的单菌落，进行分离 纯化，即为初筛菌株。

本次试验共挑取了10株单菌落，并依此命名为YY-1、YY-2、YY-3……、YY-10。接种 单菌落至营养肉汤培养基，在30℃、160r/min条件下进行液体培养24h后，无菌离心，将菌泥 用生理盐水重悬，制成菌液，其中菌浓度为108～109CFU/mL。

按1％(v/v)的比例将上述菌液分别接种到已灭菌的养殖废水(NH1+-N浓度为 1.37mg/L)中，30℃、160r/min条件下进行摇瓶处理，48h后取样测定实验体系中NH4+-N的浓 度，计算NH4+-N的去除率(去除率＝(初始浓度-终止浓度)/初始浓度×100％)。NH4+-N的浓 度采用纳氏法测定。具体结果如表1所示：

表1处理48h后养殖废水中NH4+-N的去除情况

菌株编号 初始NH4+-N(mg/L) 终止NH4+-N(mg/L) 去除率 YY-1 1.37 0.34 75.18％ YY-2 1.37 0.78 43.07％ YY-3 1.37 0.76 44.53％ YY-4 1.37 0.49 64.23％ YY-5 1.37 0.34 75.18％ YY-6 1.37 1.22 10.95％ YY-7 1.37 0.46 66.42％ YY-8 1.37 0.90 34.31％ YY-9 1.37 0.10 92.70％

YY-10 1.37 0.45 67.15％

从表1的数据可以看出，本发明筛选到的菌株YY-9对养殖废水中的氨态氮具有很 强的降解能力，48h处理后氨态氮的去除率高达92.70％，净水效果显著。

4、菌株鉴定

1)菌落形态特征：将菌株YY-9在营养琼脂培养基上培养18小时，呈现为黄色、半透 明、表面湿润、无皱褶、直径约1mm菌落，镜检其细胞为短杆状。

2)利用试剂盒提取上述菌株YY-9的基因组DNA，利用PCR技术扩增16SrRNA序列， 测序后获得长度为1398bp的片段。通过BLAST比对分析，其与公布的多株节杆菌的16SrRNA 序列相似度高达99％，鉴定证实上述菌株YY-9为节杆菌，与生化鉴定结果一致。上述菌株 YY-9的16SrRNA序列：

GCAGTCGAACGATGAAGCCGGAGCTTGCTTTGGCGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGTAACCTGCCC CCGACTTCGGGATAAGCCCGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATATGACCTCGCACCGCATGGTGTGGGGTGGAAAGA TTTATCGGTGGGGGATGGACTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGC CGGCCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATAT TGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGTA GGGAAGAAGCGCAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGG GCGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGTTTGTCGCGTCTGCCGTGAAAGTCCGAGGC TCAACCTCGGATCTGCGGTGGGTACGGGCAGACTAGAGTGATGTAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAA ATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGATGGCGAAGGCAGGTCTCTGGGCATTTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCAT GGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGTTGGGCACTAGGTGTGGGGGACATTCCACGT TTTCCGCGCCGTAGCTAACGCATTAAGTGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGAC GGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGCGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATGTGC CAGACCGGATCAGAGATGGTTCTTCCCTTCGGGGCTGGTTCACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTG AGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGTTCCATGTTGCCAGCGGGTTATGCCGGGGACTCATGGGA GACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTTCACGCAT GCTACAATGGCCGGTACAATGGGTTGCGATACTGTGAGGTGGAGCTAATCCCTAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTG GGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCG GGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGTCACGAAAGTTGGTAACACCCGAAGCCGATGGCCTAACCACCTTGTGTGGGG GGAGTCGTCGAAGG

3)将菌株YY-9命名为烟草节杆菌(Arthrobacternicotianae)YY-9，并于2014年6 月24日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCCNO： M2014278。

实施例2烟草节杆菌YY-9处理水产养殖水体实验

1、菌粉的制备

首先将烟草节杆菌YY-9进行活化，扩大培养，经液态发酵、喷雾干燥做成菌粉，其 中烟草节杆菌含量约为100亿/g。

2、实验地点：江苏如东的小棚虾养殖池

选取水质指标相近的三个养殖池作为三个平行，分别用塑料布将养殖池的水体隔 开，一半水体作为实验组，另一半水体作为对照组。分别检测各组水体中NH4+-N的初始浓度； 然后向实验组水体中添加10ppm上述烟草节杆菌YY-9菌粉，对照组不加。实验温度为28-30 ℃，实验期间不间断曝气，且各组曝气量一致。48h后分别测定各组水体中NH4+-N的浓度，将 三个平行组的检测结果取平均值，用于计算NH4+-N的去除率。具体结果如表2所示：

表2处理48h后小棚虾养殖池水体中NH4+-N的去除情况

组别 初始NH4+-N(mg/L) 终止NH4+-N(mg/L) 去除率 对照组 1.37±0.03 1.24±0.02 9.49％ 实验组 1.44±0.03 0.14±0.02 90.28％

从表2的结果可以看出，上述烟草节杆菌YY-9对水产养殖肥水中的NH4+-N有很强的 降解作用(p＜0.05)，处理48h后NH4+-N的去除率高达90.28％。氨态氮在pH高的情况下可以 较高比例的转化为非离子氨，非离子氨具有较强的细胞损害性，影响水产养殖对象的代谢， 氨态氮的降解问题是目前水产养殖上的难点之一。因此，本发明筛选到的烟草节杆菌YY-9 对NH4+-N的降解效果显著，可用于解决水产养殖氨态氮过高的问题。

除了能降解养殖水体中的氨态氮之外，本发明所述烟草节杆菌YY-9还能有效降解 生活污水中的氨态氮，处理48h后NO2-N的去除率高于87％。