人抗凝血酶转基因羊的外源基因漂移风险的分析方法.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 102321761 B (45)授权公告日 2013.04.10 CN 102321761 B *CN102321761B* (21)申请号 201110252143.8 (22)申请日 2011.08.30 201010274678.0 2010.09.07 CN C12Q 1/68(2006.01) (73)专利权人 青岛森淼实业有限公司 地址 266061 山东省青岛市崂山区苗岭路 19 号裕龙大厦 2 号楼 1 单元 2601 室 (72)发明人 袁三平 顾玉超 邹贤刚 赵雅琳 (74)专利代理机构 青岛发思特专利商标代理有 限公司 37212 代理人 蔡绍强。

2、 J. R. S. MEADOWS ET AL.Mitochondrial Sequence Reveals High Levels of Gene Flow Between Breeds of Domestic Sheep from Asia and Europe.Journal of Heredity .2005, 第 96 卷 ( 第 5 期 ),494-501. (54) 发明名称 人抗凝血酶转基因羊的外源基因漂移风险 的分析方法 (57) 摘要 人抗凝血酶 III 转基因羊的外源基因漂移风 险的分析方法。包括如下步骤 ： 引物及 Taqman 探 针设计， 血液基因组 DNA 的制备。

3、， ATIII 基因的扩 增， ATIII 基因的克隆， 荧光定量 PCR 检测和敏感 性评价及定量分析。为了能够灵敏的检测到微量 的 ATIII 基因， 本研究建立了灵敏、 特异的实时荧 光定量 PCR 检测人 ATIIII 基因的技术方法， 最低 能检测到 1copy 的 ATIII 基因， 并且检测特异性 高。在此基础上， 开展了抗凝血酶 III 转基因羊 环境安全性评估的初步研究。完成了与 ATIII 转 基因羊密切接触的同种和异种动物血液基因组中 ATIII基因的检测工作(共57个样本)， 结果表明 人 ATIII 基因没有在转基因羊和非转基因羊及其 它动物间发生漂移， 提示转基因羊。

4、对于环境是安 全的。 (66)本国优先权数据 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 高超 权利要求书 2 页 说明书 10 页 序列表 3 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 2 页 说明书 10 页 序列表 3 页 附图 4 页 1/2 页 2 1. 一种人抗凝血酶 III 转基因羊的外源基因漂移风险的分析方法， 其特征是包括如下 步骤 ： 引物及Taqman探针设计， 血液基因组DNA的制备， ATIII基因的扩增， ATIII基因的克 隆， 质粒标准品浓度的计算， 荧光定量 PCR 检测， 敏感性评价及定量分析和特异性评价 ；。

5、 其 中， 引物及 Taqman 探针设计 利 用 Primer Primer 5.0 软 件 分 析 人 ATIII 基 因 的 序 列 NM_000488， 设 计 并 合成用于构建标准质粒的人 ATIII 特异性引物 F ： 5 -gtgataggaactgtaacct-3 ； R ： 5 -cggccagcaatcacaacag-3 ， 利用 Applied Biosystems 公司的 Primer Express 3.0 软件设计 Taqman 探针和引 物 F ： 5 -TGTGATAGGAACTGTAACCTCTGG-3 ， R ： 5 -GCTTGGCTGTGCAGATGTC。

6、-3 ， Taqman 探针 5 -(FAM)TGTCCTTGCTGCTCATTGGCTTCTG(Eclipse)-3 ， 利用 BLAST 在线软件分析设计引物和探针序列的特异性 ； 血液基因组 DNA 的制备 血样采用 EDTA 抗凝， 血液置于 1.5ml 离心管中 4保存备用 ； 利用 QIAGEN 离心柱血液 基因组提取试剂盒提取血液基因组 ； ATIII 基因的扩增 以转 ATIII 基因羊血液基因组为模板 ； PCR 扩增体系如下 ： DNA 模板 10ng， l0Ex Taq buffer2.5l， dNTP 2.5mM 5l， 引物 F 10pM， 引物 R 10pM， Ta。

7、q 酶 0.2l， ddH2O 补到 25l， 反应条件为 94 5min ； 95 30S， 55 30S， 72 1.5min， 25 个循环 ； 72 10min ； 扩增片段大小为 1263bp， 以 1% 琼脂糖凝胶电泳分析扩增 效果并回收 ； ATIII 基因的克隆 利用 DNA 琼脂糖凝胶回收试剂盒将 ATIII 基因 PCR 扩增产物回收， 胶回收产物连接到 pMD18T 载体中， 转化 E.coli DH5， 挑取单克隆， PCR 鉴定， 并测序鉴定 ； 质粒标准品浓度的计算 将上述质粒用紫外分光光度计测定 260nm 与 280nm 波长下的 OD 值， 判断其纯度， 然后。

8、 转换成质粒的拷贝数 ； 所述的与标准品对照计算每微升质粒拷贝数的方法是 ： 制备质粒标准品 ； 标准品作 10 倍梯度稀释， -20保存备用 ； 样品质粒用紫外分光光度计测定 260nm 与 280nm 波长下的 OD 值， 然后按照下面的公 式转换成质粒的拷贝数 ： 每微升质粒拷贝数 = ( 质量/分子量) ( 6 . 0 2 1 0 2 3 ) = 质粒浓度n g / l1l10-9/2404697(6.021023个 /mo1)， 其中 ： 6.021023是阿佛加德罗常数 ； 2404697 是标准质粒的分子量 ； 权 利 要 求 书 CN 102321761 B 2 2/2 页 3。

9、 荧光定量 PCR 检测 ； 敏感性评价及定量分析 ； 特异性评价。 2. 按照权利要求 1 所述的人抗凝血酶 III 转基因羊的外源基因漂移风险的分析方法， 其特征是所述的荧光定量 PCR 检测的方法是 ： 25l 反应体系包括 TaqMan Universal PCR Master Mix 缓冲液 12.5l， 血样 DNA 模 板 10ng， 引物为 300nM、 探针为 250nM， 体系用 ddH2O 补齐 ； 特异性反应条件为二温循环， 即 95 10min;95 15s,60 1min,40 个循环 ； 引物和探针的用量为矩阵法优化得到的结果。 3. 按照权利要求 1 所述的人抗。

10、凝血酶 III 转基因羊的外源基因漂移风险的分析方法， 其特征 是所述的敏感性评价及定量分析的方法是 ： RNA 标准品经 1/10 系列稀释， 利用建立的检测体系对不同浓度的 RNA 标准品进行荧光 定量 PCR 检测， 以确定检测灵敏度 ； 同时用标准品检测扩增曲线获得标准曲线， 对检测样品 进行定量分析。 4. 按照权利要求 1 所述的人抗凝血酶 III 转基因羊的外源基因漂移风险的分析方法， 其特征是所述的特异性评价的方法是 ： 利用建立的检测体系对转 ATIII 基因羊血液基因组， 非转基因羊血液基因组， 和其它 对照动物血液基因组， 进行荧光定量 PCR 检测， 以验证其特异性。 。

11、权 利 要 求 书 CN 102321761 B 3 1/10 页 4 人抗凝血酶转基因羊的外源基因漂移风险的分析方法 技术领域 0001 本发明属于对转基因动物环境安全的检测和评价领域， 具体涉及一种人抗凝血酶 转基因羊的外源基因漂移风险的分析方法。 背景技术 0002 随着生物技术的高度发展， 转基因动物研究的不断深入和加快， 转基因育种成为 培养新品种的重要途径， 商业化转基因动物即将面世， 同时， 与转基因相伴而生的潜在的安 全问题已引起世界各国的关注和重视 1-2。转基因动物是通过基因工程技术使生物遗传信 息发生了转移、 替换、 融合和表达的遗传工程体， 由于外源基因的插入， 打破了。

12、原有的育种 规律， 改变了物种多样性局面， 可能发生潜在的生物环境安全问题， 造成重大经济损失， 对 人类生存造成威胁。因此， 对转基因动物环境安全的检测和评价有利于保证人类健康和生 态环境安全、 促进转基因动物相关技术的快速健康发展。 0003 基因漂移是指转基因生物中转入的外来基因， 转移到相邻的其他生物之中， 从而 改变其他生物的基因组成 3。 转基因植物发生基因漂移可能引起的生态环境安全性问题已 经引起广泛关注， 而转基因动物发生基因漂移的可能性一直没有被重视。因而研究转基因 动物发生基因漂移的可能性对于评价转基因动物环境安全性具有重要的意义。 0004 本研究建立了实时荧光定量 PC。

13、R 技术检测抗凝血酶 III 的技术方法， 并充分发挥 了申请人青岛森淼实业有限公司的转基因羊资源优势 4， 开展抗凝血酶 III（ATIII） 转基 因羊环境安全性评估的初步研究。 发明内容 0005 本发明采用如下技术方案实施 ： 0006 研究一种人抗凝血酶 III 转基因羊的外源基因漂移风险的分析方法， 其特征是包 括如下步骤 ： 引物及Taqman探针设计， 血液基因组DNA的制备， ATIII基因的扩增， ATIII基 因的克隆， 荧光定量 PCR 检测和敏感性评价及定量分析 ； 其中， 0007 引物及 Taqman 探针设计 0008 利用 Primer Primer 5.0 。

14、软件分析人 ATIII 基因的序列 NM_000488， 设计 并合成用于构建标准质粒的人 ATIII 特异性引物 F5 -gtgataggaactgtaacct-3 ； R ： 5 -cggccagcaatcacaacag-3 ， 0009 利用 Applied Biosystems 公司的 Primer Express 3.0 软件设计 Taqman 探针 和引物 0010 F ： 5 -TGTGATAGGAACTGTAACCTCTGG-3 ， 0011 R ： 5 -GCTTGGCTGTGCAGATGTC-3 ， 0012 Taqman 探针 0013 5 -(FAM)TGTCCTTGC。

15、TGCTCATTGGCTTCTG(Eclipse)-3 ， 0014 利用 BLAST 在线软件分析设计引物和探针序列的特异性 ； 说 明 书 CN 102321761 B 4 2/10 页 5 0015 血液基因组 DNA 的制备 0016 血样采用 EDTA 抗凝， 血液置于 1.5ml 离心管中 4保存备用 ； 利用 QIAGEN 离心柱 血液基因组提取试剂盒提取血液基因组 ； 0017 ATIII 基因的扩增 0018 以编号 A22 的转 ATIII 基因羊血液基因组为模板 ； 0019 PCR 扩增体系如下 ： 0020 DNA 模板 10ng， l0Ex Taq bufer2.5。

16、l， dNTP 2.5mM 5l， 引物 F 10pM， 引物 R 10pM， Taq 酶 0.2l， ddH2O 补到 25l。反应条件为 94 5min ； 95 30S， 55 30S， 72 1.5min， 25 个循环 ； 72 10min ； 扩增片段大小为 1263bp， 以 1% 琼脂糖凝胶电泳分析扩增 效果并回收 ； 0021 ATIII 基因的克隆 0022 利用 DNA 琼脂糖凝胶回收试剂盒将 ATIII 基因 PCR 扩增产物回收， 胶回收产物连 接到 pMD18T 载体中， 转化 E.coli DH5， 挑取单克隆， PCR 鉴定， 并测序鉴定 ； 0023 质粒标准。

17、品浓度的计算 0024 将上述质粒用紫外分光光度计测定 260nm 与 280nm 波长下的 OD 值， 判断其纯度， 然后转换成质粒的拷贝数 ； 0025 荧光定量 PCR 检测 ； 0026 敏感性评价及定量分析 ； 0027 特异性评价。 0028 上述的人抗凝血酶 III 转基因羊的外源基因漂移风险的分析方法， 其特征是所述 的与标准品对照计算每微升质粒拷贝数的方法是 ： 0029 制备质粒标准品 ； 标准品作 10 倍梯度稀释， -20保存备用 ； 0030 样品质粒用紫外分光光度计测定 260nm 与 280nm 波长下的 OD 值， 然后按照下面 的公式转换成质粒的拷贝数 ： 0。

18、031 每微升质粒拷贝数 = 0032 ( 质量 / 分子量 )(6.021023)= 质粒浓度 (ng/1l)1l10-9/2404697 (6.021023个 /mo1)， 0033 其中 ： 6.021023是阿佛加德罗常数 ； 2404697 是标准质粒的分子量。 0034 上述的人抗凝血酶 III 转基因羊的外源基因漂移风险的分析方法， 其特征是所述 的荧光定量 PCR 检测的方法是 ： 0035 上述的人抗凝血酶 III 转基因羊的外源基因漂移风险的分析方法， 其特征是所述 的敏感性评价及定量分析的方法是 ： 0036 25l 反应体系包括 TaqMan Universal PCR。

19、 Master Mix 缓冲液 12.5l， 血样 DNA 模板 10ng， 引物为 300nM、 探针为 250nM， 体系用 ddH2O 补齐 ； 0037 特异性反应条件为二温循环， 即 95 10min;95 15s,60 1min,40 个循环 ； 0038 用矩阵法筛选引物和探针的最佳使用量。 0039 上述的人抗凝血酶 III 转基因羊的外源基因漂移风险的分析方法， 其特征是所述 的敏感性评价及定量分析的方法是 ： 0040 RNA 标准品经 1/10 系列稀释， 利用建立的检测体系对不同浓度的 RNA 标准品进行 说 明 书 CN 102321761 B 5 3/10 页 6 。

20、荧光定量 PCR 检测， 以确定检测灵敏度 ； 同时用标准品检测扩增曲线获得标准曲线， 对检测 样品进行定量分析。 0041 上述的人抗凝血酶 III 转基因羊的外源基因漂移风险的分析方法， 其特征是所述 的特异性评价的方法是 ： 0042 利用建立的检测体系对编号为 A22 的转 ATIII 基因羊血液基因组， 非转基因羊血 液基因组， 和其它对照动物血液基因组， 进行荧光定量 PCR 检测， 以验证其特异性 ； 0043 上述的人抗凝血酶 III 转基因羊的外源基因漂移风险的分析方法， 其特征是所述 的采取动物血液基因组样品的方法是 ： 0044 采用颈静脉取血的方法分别采集 ： 转 AT。

21、III 基因羊血液基因组血液样品， 转乙肝 表面抗原基因羊血液样品， 转 - 干扰素转基因羊血液样品， 野生型山羊血液样品， 家养犬 静脉血液样品， 试验用小鼠静脉血液样品 ； 0045 以及采用翅静脉采血法采取家养鸡血液样品和家养鹅血液样品 ； 0046 建立各该动物血液基因组， 进行荧光定量PCR检测， 以验证人抗凝血酶III转基因 羊的外源基因漂移风险的分析方法的特异性。 0047 本发明的优点是 ： 0048 本发明的技术方案建立了灵敏、 特异的实时荧光定量 PCR 检测人 ATIII 基因的技 术方法， 最低能检测到 1copy 的 ATIII 基因， 并且检测特异性高。在此基础上，。

22、 开展了抗凝 血酶 III 转基因羊环境安全性评估的初步研究。完成了与 ATIII 转基因羊密切接触的同种 和异种动物血液基因组中 ATIII 基因的检测工作 （共 57 个样本） ， 结果表明人 ATIII 基因没 有在转基因羊和非转基因羊及 其它动物间发生漂移， 提示转基因羊对于环境是安全的。 附图说明 0049 图 1 是实施例 2 的 PCR 克隆人 ATIII 基因片段示意图 ； 0050 图 2 是实施例 3 的荧光定量 PCR 检测 ATIII 标准质粒 （1 到 1109copy/l） 的扩 增曲线示意图 ； 0051 图 3 是实施例 3 的定量 PCR 检测 ATIII 的。

23、标准曲线示意图 ； 0052 图 4 是实施例 3 的定量 PCR 的特异性试验示意图 ； A、 转 ATIII 基因羊血液基因组 为模板 ； B、 以非转基因羊和小鼠血液基因组为模板 ； 0053 图 5 是实施例 4 的定量 PCR 检测野生型山羊、 - 干扰素和乙肝表面抗原转基因 羊血液样品中 ATIII 基因示意图 ； 0054 图 6 是实施例 4 的定量 PCR 检测狗、 鸡和鹅血液样品中 ATIII 基因示意图 ； 0055 图 7 是实施例 4 的 FQ-PCR 检测 ATIII 转基因羊血液样品中 ATIII 基因示意图。 0056 图 1 中， 泳道 M ： DL2000 。

24、分子量标准品 ； 泳道 1 ： ATIII 基因 PCR 扩增片段 ； 图中显 示 ATIII 基因被成功克隆。 0057 图 2 中， 纵坐标是相对荧光强度， 横坐标是循环数 ； 图中显示扩增曲线呈标准的 S 型， 表明 PCR 反应效率高。 0058 图3中， 纵坐标是Ct值， 横坐标是模板拷贝数的对数 ； 图中显示荧光定量PCR的灵 敏度可以达到 1copy/l， 但是当浓度为 1copy/l 时， Ct 值的重复性较差 ； 标准曲线的斜 率为 -3.072， R2为 0.992. 说 明 书 CN 102321761 B 6 4/10 页 7 0059 图 4 中， 纵坐标是相对荧光强。

25、度， 横坐标是循环数 ； 图中显示只有转 ATIII 基因的 羊血液基因组中能检测到 ATIII 基因。 0060 图 5 中， 纵坐标是相对荧光强度， 横坐标是循环数 ； 图中显示野生型山羊血液中、 白介素 6 和乙肝表面抗原转基因羊血液中均未检测到 AT3 基因。 0061 图 6 中， 纵坐标是相对荧光强度， 横坐标是循环数 ； 图中显示狗、 鸡和鹅血样中也 未检测到 AT3 基因的存在。 0062 图 7 中， 纵坐标是相对荧光强度， 横坐标是循环数 ； 0063 图中显示转 ATIII 基因羊血液中可以检测到 ATIII 基因。 具体实施方式 0064 试验材料及仪器 0065 野生。

26、型山羊、 转乙肝表面抗原基因羊、 转 - 干扰素转基因羊、 转 ATIII 基因羊、 狗、 鸡和鹅的血样采集于青岛森淼实业有限公司的转基因动物养殖基地 ； 0066 血液基因组提取试剂盒， 购自美国 QIAGEN 公司 ； TaqMan Universal PCR Master Mix， 购自美国 Applied Biosystems 公司 ； Taqman 探针及引物由大连 Takara 公司合成 ； 其 它普通生化试剂均为国产分析纯。 0067 美国 Applied Biosystems 公司 7500 荧光定量 PCR 仪和 9700 型 PCR 仪。 0068 实施例 1 引物及 Ta。

27、qman 探针设计 0069 利用 Primer Primer 5.0 软件分析人 ATIII 基因的序列 （NM_000488） ， 设计 并合成用于构建标准质粒的人 ATIII 特异性引物 （F ： 5 -gtgataggaactgtaacct-3 ； R ： 5 -cggccagcaatcacaacag-3 ） 。利用 Applied Biosystems 公司的 Primer Express 3.0 软 件 设 计 Taqman 探 针 和 引 物 （F ： 5 -TGTGATAGGAACTGTAACCTCTGG-3 ； R ： 5 -GCTTGGCTGTGCAGATGTC-3 ； T。

28、aqman 探针 ： 5 -(FAM)TGTCCTTGCTGCTCATTGGCTTCTG(Ecli pse)-3 ） 。利用 BLAST 在线软件分析设计引物和探针序列的特异性。引物及探针委托大连 Takara 公司合成。 0070 实施例 2 血液基因组 DNA 的制备、 DNA 扩增及克隆 0071 1. 血样采用 EDTA 抗凝， 血液置于 1.5ml 离心管中 4保存备用。利用 QIAGEN 离 心柱血液基因组提取试剂盒提取血液基因组。 0072 2. 转基因羊 ATIII 基因的扩增 0073 以转 ATIII 基因羊 （试验编号 A22） 血液基因组为模板。 0074 PCR 扩增。

29、体系如下 ： 0075 25l 的体系， DNA 模板 3l， l0Ex Taq bufer 2.5l， dNTP(2.5mM)2.5l， 引 物 F(10pM)， 引物 R(10pM)， Taq 酶 0.2l， ddH2O 补到 25l。反应条件为 94 5min ； 95 30S， 55 30S， 72 1.5min， 25 个循环 ； 72 10min。扩增片段大小为 1263bp， 以 1% 琼脂 糖凝胶电泳分析扩增效果并回收。 0076 3. 转基因羊 ATIII 基因的克隆 0077 利用 DNA 琼脂糖凝胶回收试剂盒将 ATIII 基因 PCR 扩增产物回收 ( 具体操作见试 剂。

30、盒说明书 )， 胶回收产物连接到 pMD18T 载体中， 转化 E.coli DH5， 挑取单克隆， PCR 鉴 定， 并测序鉴定。 说 明 书 CN 102321761 B 7 5/10 页 8 0078 4. 质粒标准品浓度的计算 0079 将上述质粒用紫外分光光度计测定 260nm 与 280nm 波长下的 OD 值， 判断其纯度 (OD ： 260nm/OD280nm1.8 者为纯品 )， 然后按照下面的公式转换成质粒的拷贝数 ： 每微升质 粒拷贝数 =( 质量 / 分子量 )(6.021023)= 质粒浓度 (ng/1l)110-9/2404697 (6.021023个 /mo1)，。

31、 其中 ： 6.021023是阿佛加德罗常数 ； 2404697 是标准质粒的分子 量。标准品作 10 倍梯度稀释， -20保存备用。 0080 5 实施例 3 荧光定量 PCR 检测及分析 0081 1. 荧光定量 PCR 检测 0082 25l 反应体系包括 TaqMan Universal PCR Master Mix 缓冲液 12.5l， 血样 DNA 模板 10ng， 引物和探针浓度按具体实验添加， 体系用 ddH2O（双蒸水 double distilled water） 补齐。特异性反应条件为二温循环 （95 10min;95 15s,60 1min,40cycle） 。 用矩阵。

32、法筛选引物和探针的最佳使用量。 0083 2. 敏感性评价及定量分析 0084 RNA 标准品经 1/10 系列稀释， 利用建立的检测体系对不同浓度的 RNA 标准品进行 荧光定量 PCR 检测， 以确定检测灵敏度。同时用标准品检测扩增曲线获得标准曲线， 对检测 样品进行定量分析。 0085 3. 特异性评价 0086 利用建立的检测体系对转 ATIII 基因羊血液基因组 （A22） 、 非转基因羊血液基因 组 ( 转基因羊养殖基地外采集 ) 和小鼠血液基因组， 等进行荧光定量 PCR 检测， 以验证其特 异性。 0087 4. 实施例 4 样品检测 0088 利用一次性注射器， 采用颈静脉取。

33、血的方法采集山羊血液样品， 共采集野生型山 羊血样 9 个 （山羊编号为 11、 64、 82、 83、 86、 87、 2-5、 3-10） 、 共采集转乙肝表面抗原基因羊血 样 10 个 （编号为 H11、 H16、 H17、 H26、 H42、 H48、 H50、 H55、 H65、 H66） 、 采集转 - 干扰素转基 因羊血样 10 个 （编号为 B5、 B10、 B17、 B18、 B19、 B20、 B21、 B22、 B23、 B24） 、 采集转 ATIII 基 因羊血样 8 个 （编号为 A08、 A23、 A38、 A39、 A41、 A43、 A46、 A54） ； 采。

34、用腿静脉采血方法， 采集 狗静脉血样 4 个 ； 采用翅静脉采血方法， 采集鸡血样 8 个、 鹅血样 8 个。 0089 提取血液基因组， 做模板， 进行荧光定量 PCR 检测， 以评价 ATIII 基因是否发生漂 移。 0090 结果与分析 0091 1. 人 ATIII 标准质粒的构建 0092 以转 ATIII 基因羊 （试验编号 A22） 血液基因组为模板， PCR 扩增得到 1300bp 的片 段参见图 1， 胶回收后克隆到 pMD18T 载体中。转化 E.coli DH5， 挑取 2 个单克隆， PCR 鉴 定均为阳性 （结果未给出） ， 进一步测序证明序列完全正确。 0093 2。

35、. 引物和探针浓度的优化 0094 以相同量的阳性核酸为模板， 引物和探针的浓度分别选取了 100、 150、 200、 250 和 300nM 五个浓度梯度， 反应条件为二温循环 （95 10min;95 15s,60 1min,40 个 cycle） ， 利用矩阵法对引物和探针的浓度进行优化， 以阈值 （Ct 值） 最小的条件为最佳反应 条件。在试验设计的范围内， 当引物和探针的浓度增加， Ct 值相应减小， 而引物和探针的浓 说 明 书 CN 102321761 B 8 6/10 页 9 度在 250 和 300nM 时 Ct 值没有明显变化。因而我们选择引物为 300nM、 探针为 2。

36、50nM 作为 后续的试验条件。 0095 3. 标准曲线及荧光定量 PCR 灵敏度 0096 以十倍稀释的标准质粒 （1 到 1109copy/l， 共十个梯度） 为模板进行扩增的扩 增曲线见图 2， 标准曲线如图 3。结果表明， FQ-PCR 的灵敏度可以达到 1copy/l， 但是当浓 度为 1copy/l 时， Ct 值的重复性较差 ； 标准曲线的斜率为 -3.072， R2为 0.992。 0097 附图 4 定量 PCR 的特异性试验中， 1 ： 以转 ATIII 基因羊血液基因组为模板 ； 2 ： 以 非转基因羊血液基因组为模板 ； 3 ： 以小鼠血液基因组为模板。 0098 为。

37、了研究 FQ-PCR 检测人 ATIII 基因的特异性， 同时检测了转 ATIII 基因羊血液基 因组 ( 试验编号 A22)、 非转基因羊血液基因组和小鼠血液基因组， 每个反应加入 l0ng 基因 组 DNA。如附图 4 所示， 只有转 ATIII 基因的羊血液基因组中能检测到 ATIII 的表达， 证明 了 FQ-PCR 的特异性。 0099 附图5中显示， 定量PCR检测野生型山羊、 干扰素和乙肝表面抗原转基因羊血 液样品中 ATIII 基因 0100 利用 QIAGEN 离心柱血液基因组提取试剂盒提取血液基因组， 提取的基因组利用 紫外分光光度计测定 OD260nm OD280nm， 。

38、确定基因组 DNA 的纯度和浓度， 通过琼脂糖凝胶 电泳检测基因组 DNA 的完整性。 0101 检查结果表明， 提取的基因组 DNA 无 RNA、 蛋白污染， 无降解。 0102 利用上面建立的转基因羊血液中人 ATIII 实时荧光定量 PCR 检测方法， 检测血液 基因组中 ATIII 基因 DNA 的含量。 0103 检测结果显示， 野生型山羊血液中、 p干扰素和乙肝表面抗原转基因羊血液中均 未检测到 ATIII 基因 ； 0104 同法， 附图 6 中显示， 定量 PCR 检测狗、 鸡和鹅血样中也未检测到 ATIII 基因的存 在 ； 0105 同法， 附图 7 中显示， 所有 ATI。

39、II 转基因羊血样中均检测到 ATIII 基因。 0106 结果表明， ATIII 转基因羊的外源基因 ( 人 ATIII 基因 ) 在种内和种间均未发生 基因横向转移。 0107 参考文献 (References) 0108 1Adow D A,Zwahlen C.Assessing environmental risks oftransgenic plantsJ.Ecology Lette,2006,(9):196-214 0109 2 施巧婷 , 魏成斌 , 李建林 , 等 . 转基因生物的安全性 J. 中国农学通 报 ,2009,25:66-70Shi Qiao-ting,Wei Ch。

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44、102321761 B 11 9/10 页 12 0120 说 明 书 CN 102321761 B 12 10/10 页 13 说 明 书 CN 102321761 B 13 1/3 页 14 青岛森淼实业有限公司人抗凝血酶转基因羊的外源基因漂移风险的分析方法 序列表 青岛森淼实业有限公司 人抗凝血酶转基因羊的外源基因漂移风险的分析方法 CN201010274678.0 2010-09-07 6 1 1398 DNA 人工序列 misc_feature (1). . (1398) 人源抗凝血酶 III 基因 1 1 ATGATTTATT CCAATGTGAT AGGAACTGTA ACCTC。

45、TGGAA AAAGGAAGGT 50 TTATCTTTTG TCCTTGCTGC TCATTGGCTT CTGGGACTGC GTGACCTGTC 100 ACGGGAGCCC TGTGGACATC TGCACAGCCA AGCCGCGGGA CATTCCCATG 150 AATCCCATGT GCATTTACCG CTCCCCGGAG AAGAAGGCAA CTGAGGATGA 200 5 GGGCTCAGAA CAGAAGATCC CGGAGGCCAC CAACCGGCGT GTCTGGGAAC 250 TGTCCAAGGC CAATTCCCGC TTTGCTACCA CTTTCTATC。

46、A GCACCTGGCA 300 GATTCCAAGA ATGACAATGA TAACATTTTC CTGTCACCCC TGAGTATCTC 350 CACGGCTTTT GCTATGACCA AGCTTGGTGC CTGTAATGAC ACCCTCCAGC 400 AACTGATGGA GGTATTTAAG TTTGACACCA TATCTGAGAA AACATCTGAT 450 10 CAGATCCACT TCTTCTTTGC CAAACTGAAC TGCCGACTCT ATCGAAAAGC 500 CAACAAATCC TCCAAGTTAG TATCAGCCAA TCGCCTTTTT 。

47、GGAGACAAAT 550 CCCTTACCTT CAATGAGACC TACCAGGACA TCAGTGAGTT GGTATATGGA 600 GCCAAGCTCC AGCCCCTGGA CTTCAAGGAA AATGCAGAGC AATCCAGAGC 650 GGCCATCAAC AAATGGGTGT CCAATAAGAC CGAAGGCCGA ATCACCGATG 700 15 TCATTCCCTC GGAAGCCATC AATGAGCTCA CTGTTCTGGT GCTGGTTAAC 750 序 列 表 CN 102321761 B 14 2/3 页 15 ACCATTTACT TC。

48、AAGGGCCT GTGGAAGTCA AAGTTCAGCC CTGAGAACAC 800 AAGGAAGGAA CTGTTCTACA AGGCTGATGG AGAGTCGTGT TCAGCATCTA 850 TGATGTACCA GGAAGGCAAG TTCCGTTATC GGCGCGTGGC TGAAGGCACC 900 CAGGTGCTTG AGTTGCCCTT CAAAGGTGAT GACATCACCA TGGTCCTCAT 950 20 CTTGCCCAAG CCTGAGAAGA GCCTGGCCAA GGTAGAGAAG GAACTCACCC 1000 CAGAGGTGCT GCA。

49、AGAGTGG CTGGATGAAT TGGAGGAGAT GATGCTGGTG 1050 GTCCACATGC CCCGCTTCCG CATTGAGGAC GGCTTCAGTT TGAAGGAGCA 1100 GCTGCAAGAC ATGGGCCTTG TCGATCTGTT CAGCCCTGAA AAGTCCAAAC 1150 TCCCAGGTAT TGTTGCAGAA GGCCGAGATG ACCTCTATGT CTCAGATGCA 1200 25 TTCCATAAGG CATTTCTTGA GGTAAATGAA GAAGGCAGTG AAGCAGCTGC 1250 AAGTACCGCT GTTGTGATTG CTGGCCGTTC GCTAAACCCC AACAGGGTGA 1300 CTTTCAAGGC CAACAGGCCT TTCCTGGTTT TT。