一种水稻叶色调控基因YL1及其应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610696220.1 (22)申请日 2016.08.19 (71)申请人 杭州师范大学 地址 310036 浙江省杭州市下沙高教园区 学林街16号 (72)发明人 于彦春陈飞武丽敏杨兴政 (74)专利代理机构 杭州天正专利事务所有限公 司 33201 代理人 黄美娟李世玉 (51)Int.Cl. C12N 15/29(2006.01) C07K 14/415(2006.01) C12N 15/82(2006.01) A01H 5/12(2006.01) (54)发明名称。

2、 一种水稻叶色调控基因YL1及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种水稻叶色调控基因YL1及 其应用， 所述基因核苷酸序列如SEQIDNO.1所 示， 编码的蛋白质序列如SEQIDNO.2所示。 本发 明通过图位克隆技术获得新的水稻叶色性状调 控基因YL1， 并通过转基因功能互补实验验证了 所述基因的功能。 YL1与叶绿体ATPase蛋白复合 体亚基AtpB存在互作， YL1基因的突变导致叶绿 体ATPase活性下降， 引起光合相关蛋白表达量降 低、 叶绿体发育受损、 叶绿素含量下降， 产生黄叶 表型。 利用本发明蛋白和编码基因可以进一步阐 释水稻叶色调控分子机制， 同时可用于作物遗传 改良，。

3、 对创制高光效育种具有重要意义。 权利要求书1页 说明书8页 序列表2页 附图5页 CN 106399323 A 2017.02.15 CN 106399323 A 1.一种水稻叶色调控基因YL1， 其特征在于所述基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。 2.一种权利要求1所述水稻叶色调控基因YL1编码蛋白， 其特征在于所述编码蛋白氨基 酸序列为SEQ ID NO.2所示。 3.一种权利要求1所述水稻叶色调控基因YL1构建的重组载体。 4.一种权利要求3所述重组载体转化制备的重组基因工程菌。 5.一种权利要求1所述水稻叶色调控基因YL1在调控水稻叶色中的应用。 6.如权利要求5所述的应用，。

4、 其特征在于所述调控是通过RNAi、 基因敲除或基因失活的 方法降低水稻叶色调控基因YL1编码蛋白的表达或活性， 从而使水稻叶色变淡或变黄。 7.如权利要求5所述的应用， 其特征在于所述调控是通过导入水稻叶色调控基因YL1互 补序列抑制水稻叶色调控基因YL1编码蛋白的表达或活性， 从而使变淡或变黄的水稻叶色 恢复正常。 权利要求书 1/1 页 2 CN 106399323 A 2 一种水稻叶色调控基因YL1及其应用 (一)技术领域 0001 本发明涉及一种黄叶调控基因， 特别涉及一种水稻黄叶调控基因YL1(Yellow Leaf 1)及利用该基因调控植物叶绿体发育， 提高光合作用效率的应用。 。

5、(二)背景技术 0002 水稻是世界三大粮食作物之一， 有超过一半的人口以稻米作为主食。 在我国， 水稻 是第一大粮食作物， 其种植面积约占粮食作物总种植面积的28， 产量约占粮食总产量的 35(National data,2012, 因此， 水稻的高产稳产对 保障我国粮食安全具有极其重要的意义。 叶片是植物进行光合作用的主要场所， 对干物质 积累有重要影响， 水稻叶色发生变化大多情况下会影响水稻的产量。 研究表明， 导致叶色变 化的主要原因是植物体内叶绿素合成、 降解或叶绿体发育相关基因的发生突变， 影响了叶 绿素的生物合成和降解过程， 导致叶片中叶绿素的含量发生变化， 最终导致了叶色的变化。

6、。 水稻叶色突变体表型明显， 易于观察， 已广泛应用于生产实践和科学研究中。 除作为性状标 记应用于新品种培育外， 叶色突变体对于研究植物叶绿体发育、 光形态建成等方面具有重 要的作用。 0003 基于Gramene网站和国家水稻数据中心的研究结果整理， 迄今为止已有大约40个 水稻黄叶突变体基因被定位和克隆， 大部分主要通过参与叶绿素的生物合成以及影响叶绿 体的发育两个途径来调控叶色变异。 OsCHL1和OsCHL9编码叶绿素生物合成过程中镁离子螯 合酶亚基， 该基因功能失活会导致水稻整个生育期内叶片呈现浅黄绿色； FLG(OsPORB)编码 原叶绿酸酯氧化还原酶B， 该酶能保证植物在强光照。

7、射下正常合成叶绿素， 突变后会导致水 稻叶片退绿黄化； OsDVR基因编码联乙烯叶绿素酸酯还原酶， 联乙烯叶绿素酸酯a在该酶的 催化作用下生成单乙烯叶绿素酸酯a， 乙烯叶绿素酸酯a能在叶绿素酸酯a氧化酶OsCAO1/ OsCAO2作用下经一系列反应生成叶绿素b， 也能在叶绿素合成酶YGL的催化作用下生成叶绿 素a， 因此该过程中的任一基因功能受阻或失活都会直接影响叶绿素a和叶绿素b的合成， 导 致水稻叶片变黄。 此外， 利用水稻叶色突变体， 部分叶绿体发育和分化相关的基因也相继被 克隆， 包括V1(Kusumi et al.,1997)、 V2(Sugimoto et al.,2004)、 O。

8、sPPR1(Kodiveri et al.,2005)、 V3、 STRIPE1(Yoo et al.,2009)、 YSA(Su et al.,2012)、 VYL(Dong et al., 2013)、 AM1(Sheng et al.,2014)、 OsDG2(Jiang et al.,2014)、 GRY79(Wan et al.,2015)、 ASL2(Lin et al.,2015)等。 其中V1编码叶绿体蛋白NUS1， 该蛋白控制叶绿体发育前体中与 叶绿体分化相关基因的转录与翻译， V1基因突变导致水稻苗期低温黄化。 V2编码一个定位 在质体和线粒体上新型的鸟苷酸激酶(pt/mt。

9、GK)， 该基因的突变导致叶绿体分化受到抑制， 尤其在叶片发育早期破坏叶绿体的蛋白翻译机制。 V3和STRIPE1分别编码RNR(核糖核酸还 原酶)大亚基RNRL1和小亚基RNRS1， 参与调节DNA合成和修复过程中脱氧核糖核苷酸的形成 速率， 这两个基因的突变会影响叶绿体的正常发育， 当突变体表型对温度敏感。 尽管已有众 多基因被克隆， 但植物叶绿体的生物合成和发育是一个及其复杂的过程， 受到核基因和自 身质体基因组的共同调控， 因此发掘新的水稻叶色突变体， 克隆其调控基因对揭示叶绿素 说明书 1/8 页 3 CN 106399323 A 3 生物合成和叶绿体发育的分子机理以及水稻高产育种实。

10、践具有重要的意义。 0004 本发明通过EMS诱变分离得到了一个黄叶突变体， 该突变体整个生育期均呈现黄 叶表型。 运用图位克隆技术， 我们首先克隆了YL1(Yellow Leaf 1)基因， 该基因编码一个含 165个氨基酸的蛋白， 其中包含1个跨膜区域但未发现其它已知功能的结构域。 我们已通过 基因功能互补实验鉴定了该基因的功能， 并从生理、 分子水平探究该基因可能的生物学功 能。 (三)发明内容 0005 本发明要解决的技术问题是提供一种调控水稻叶色变异的基因及其编码的蛋白 质， 以及利用所述基因调控植物叶绿体发育和对水稻叶片颜色进行改造的方法。 0006 本发明采用的技术方案是： 00。

11、07 本发明提供一种水稻叶色调控基因YL1， 所述基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所 示。 本发明还包括与SEQ ID NO.1至少有70同源性的基因序列， 也包括在取代、 插入或缺 失一个或多个核苷酸而产生的突变体、 等位基因或衍生物， 还含具有相同功能并能达到本 发明目的的基因序列。 0008 本发明还提供一种所述水稻叶色调控基因YL1编码蛋白， 所述编码蛋白氨基酸序 列为SEQ ID NO.2所示。 本发明还包括与SEQ ID NO.2所示序列至少具有60的同源性， 包 括在SEQ ID NO.2序列中进行氨基酸的替换、 插入或缺失氨基酸所获得的功能类似物。 0009 本发明还涉及。

12、一种所述水稻叶色调控基因YL1构建的重组载体。 该载体可以表达 由上述核酸序列编码的多肽或同源类似物。 0010 本发明还涉及一种所述重组载体转化制备的转化子， 包括大肠杆菌、 农杆菌和植 物细胞。 0011 此外， 本发明还提供一种所述水稻叶色调控基因YL1在调控水稻叶色中的应用。 所 述调控是通过RNAi、 基因敲除或基因失活的方法降低水稻叶色调控基因YL1编码蛋白的表 达或活性， 从而使水稻叶色变淡或变黄。 所述调控还可以是通过导入水稻叶色调控基因YL1 互补序列抑制水稻叶色调控基因YL1编码蛋白的表达或活性， 从而使变淡或变黄的水稻叶 色恢复正常。 0012 本发明的具体步骤如下： 0。

13、013 1.水稻黄叶突变体yl1-1的分离： 本发明涉及的水稻黄叶突变体yl1-1是由籼稻品 种蜀恢527(购自中国农科院作物品种资源库)经EMS诱变产生， 该突变体整合生育期均表现 为黄叶表型， 如图1所示。 通过yl1-1与野生型水稻的正交实验， 证明该突变体受隐性单基因 控制。 0014 2.图位克隆控制水稻叶色调控基因YL1:YL1基因的初定位。 为分离YL1基因， 本 发明首先通过yl1-1与粳稻品种日本晴杂交构建了F2定位群体， 通过图位克隆的方法， 利用 SSR、 STS等分子标记对YL1位点进行初定位， 将目标基因初定位于水稻第2染色体顶端， 介于 RM7562和RM3703两。

14、个分子标记之间(图2)。 YL1的精细定位及候选基因预测。 通过对 RM7562和RM3703标记之间的BAC序列分析发展新的STS标记， 并进一步将YL1目标区间缩小 至约199Kb的区间内， 位于BAC AP007224和AP005869上YP2344和YP2392两个分子标记之间， 通过对该区间内开放阅读框的预测和测序分析， 推测YL1候选基因。 说明书 2/8 页 4 CN 106399323 A 4 0015 3.YL1基因的鉴定和功能分析： 通过转基因功能互补实验， 结果表明本发明获得了 使yl1-1突变体获得正常表型的转基因水稻(图2)， 证明本发明正确克隆了YL1基因。 氨基酸。

15、 序列分析表明YL1存在一个跨膜区域， 但不含有任何已知功能的结构域。 0016 本发明有益效果主要体现在： 本发明通过图位克隆技术获得新的水稻叶色性状调 控基因YL1， 并通过转基因功能互补实验验证了所述基因的功能。 本发明实验证明， YL1是水 稻叶绿体正常发育所需的。 YL1与叶绿体ATPase蛋白复合体亚基AtpB存在互作， YL1基因的 突变导致叶绿体ATPase活性下降， 引起光合相关蛋白表达量降低、 叶绿体发育受损、 叶绿素 含量下降， 产生黄叶表型。 本发明对YL1基因的功能解析进一步阐明了水稻叶绿体发育的分 子机制， 同时， 所述蛋白和编码基因可以应用于作物遗传改良， 对创制。

16、高光效育种具有重要 意义。 (四)附图说明 0017 图1 野生型(WT)和突变体(yl1-1)的表型； A发芽后7天的幼苗； B发芽后40天的植 株； C孕穗期的植株； D对C放大后的叶片。 0018 图2 YL1基因的图位克隆。 0019 图3 YL1和相关蛋白的进化树分析。 0020 图4 pCAMBIA1300-YL1载体图谱。 0021 图5 转基因功能互补验证。 A互补转基因苗的分子鉴定(1.DNA marker； 2.野生型； 3.突变体； 4.互补转基因株系)； B野生型(左)、 突变体(中)和互补转基因苗(右)的表型； C野 生型、 突变体和互补转基因苗的叶绿素含量变化。 0。

17、022 图6 叶绿体机构观察分析； 40d水稻苗上部第1真叶(Leaf 1)与第4真叶(Leaf 4) 用于透射电镜观察叶绿体， A、 E为野生型， B、 F为yl1-1突变型， C、 D和G、 H分别为A、 B和E、 F中 单个叶绿体放大图。 0023 图7 YL1的亚细胞定位分析。 0024 图8 YL1在不同组织部位的定量分析； A为qRTPCR检测YL1在不同组织中的表达； B 为YL1在转基因水稻不同组织中的GUS表达。 0025 图9 Western blot检测突变体和野生型中光合相关蛋白复合体亚基的表达情况。 0026 图10 酵母双杂交和BiFC方法分析YL1的互作蛋白； A。

18、酵母双杂交分析YL1和类囊体 膜复合物亚基编码基因之间的相互作用； B水稻原生质体中利用BiFC检测YL1基因与AtpB基 因的相互作用。 0027 图11 野生型和突变体叶绿体ATPase活性差异。 (五)具体实施方式 0028 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述， 但本发明的保护范围并不仅限于 此： 0029 实施例1： 0030 1、 水稻材料 0031 水稻(Oryza sativa L.)yl1-1突变体植株是由籼稻蜀恢527品种(购自中国农科 院作物品种资源库)经过EMS诱变处理得到的。 说明书 3/8 页 5 CN 106399323 A 5 0032 yl1-1突变体植株。

19、从幼苗第一片完全展开叶(DAG6， 真叶展开)开始就表现出明显 的淡黄色表型， 并持续整个生育期。 与野生型(籼稻蜀恢527)相比， yl1-1突变体植株还表现 为分蘖时期延后及分蘖数减少。 此外， 野生型和突变体在株高上也存在差异， 在幼苗期 (DAG6)两者差异不明显， 在成熟期yl1-1突变体植株株高均显著低于野生型植株， 如图1所 示。 0033 2、 分析和定位群体 0034 F2定位群体是通过纯合的yl1-1突变体和粳稻品种 “日本晴” (Oryza sativa subsp.japonicacv.Nipponbare)杂交产生F1代， F1代自交得到F2群体。 从F2群体中筛选出。

20、 1386株表型明显的黄叶yl1-1突变个体用于图位克隆。 0035 3、 通过SSR， STS标记定位YL1基因 0036 基因组DNA的提取： 采用改良的CTAB法提取水稻叶片(即步骤2筛选的1386株表型 明显的黄叶yl1-1突变个体)基因组DNA。 具体方法为： 取约0.2g新鲜的水稻叶片于2.0ml离 心管中， 经液氮冷冻， 利用组织研磨仪(QIAGEN)将叶片磨成粉末状， 加入CTAB提取液提取 DNA， 获得的DNA沉淀溶解于200 L超纯水中。 0037 YL1基因的初定位： 随机选取20个F2定位群体中分离的隐性突变单株， 将其DNA混 合组成混池， 选取近似均匀分布于水稻1。

21、2条染色体上的SSR(简单重复序列)标记和STS(序 列标签位点)标记， 进行PCR扩增， 经5的琼脂糖凝胶电泳分析， 检测PCR产物的多态性， 将 YL1基因初步定位到水稻2号染色体顶端， 位于RM7562和RM3703两个分子标记之间(图2)。 PCR反应体系(20 L)： DNA模板2 L， 2SpecificTM Taq Master Mix 10 L， 上、 下游引物各1 L， 超纯水补足至20 L。 PCR反应条件为94预变性3min； 94变性30s， 55退火30s， 72延 伸30s， 32循环； 72延伸5min。 0038 YL1基因的精细定位： 利用已知的水稻基因组BA。

22、C序列， 通过籼、 粳稻之间的序列差 异比对(http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)， 在初定位区间内设计新的STS标记， 利用 STS标记对F2群体中分离的隐性突变单株进行标记连锁分析， 最终将YL1基因精细定位与2 号染色体上的两个新的STS标记YP2344(位于BAC序列AP007224上)和YP2392(位于BAC序列 AP005896上)之间的约199kb的区域内(图2)。 图位克隆过程所用的引物序列见表1。 0039 表1.YL1图位克隆所用的引物 说明书 4/8 页 6 CN 106399323 A 6 0040 0041 0042 4、 基因预测和序。

23、列分析 0043 通过Rice Genome Annotation Database分析预测， 上述199kb区间内共有27个候 选基因， 我们设计基因的测序引物通过用PCR方法(反应体系和条件同上)从野生型和突变 型植株扩增出候选基因并进行测序分析。 结果显示(图2)， yl1-1突变体在基因LOC_ Os02g05890的第4外显子处发生1个单碱基突变， 由C变成T， 导致编码氨基酸由脯氨酸(Pro) 变成丝氨酸(Ser)。 该基因全长2720bp， 核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示， 该基因编码蛋白序 列如SEQ ID NO.2所示。 0044 通过NCBI(http:/www.n。

24、cbi.nlm.nih.gov/)网站的BLAST序列分析， 将YL1基因在 水稻、 拟南芥和其他物种中的同源基因序列整理归类并制成进化树(MAGE software version 5.05)。 结果显示， 在整个植物界中YL1基因家族共有两个大的分支， 单子叶植物分 支和双子叶植物分支。 在单子叶植物分支中， 又有两个分支， YL1位于其中一个分支上， 它在 水稻中的同源基因OsYL2和OsYL3位于另一个分支。 在双子叶植物中也有两个分支， YL1在拟 南芥的同源基因At1g56200和At1g30475分别位于不同的分支中(图3)。 YL1候选基因测序引 物见表2。 0045 表2.候。

25、选基因测序引物 说明书 5/8 页 7 CN 106399323 A 7 0046 0047 实施例2 0048 植物转化： 0049 根 据 目 的 基 因 ( L O C _ O s 0 2 g 0 5 8 9 0 ) 设 计 引 物 p C Y L 1 - F ( 5- tctagaAGTCCCATGTAAATAGGGTC-3 )和pCYL1-R(5 -gtcgacGCTTCTCGGATAACGACTCT-3 )， 片 段全长5.38kb， 包含该基因5 -端上游2099bp， 目的基因全长以及3 -端下游1382bp。 以粳稻 品种日本晴基因组DNA为模板， 以pCYL1-F和pCYL。

26、1-R为引物， 利用NEB公司Q5高保真酶体系 进行PCR扩增， 反应体系为(20 L)： DNA模板2 L， 2Master Mix 10 L， 上、 下游引物各1 L， 超纯水补足至20 L。 PCR反应条件为98预变性30s； 98变性10s， 65退火30s， 72延伸 2min30s， 30循环； 72延伸10min。 PCR产物经电泳后， 回收目标片段并接入T5-zero载体(购 自北京全式金生物技术有限公司)， 经测序验证后， 克隆到双元载体pCAMBIA1300(中国科学 院遗传所)中， 获得了用于转化的质粒pCAMBIA1300-YL1(图4)。 质粒通过电击的方法转入农 杆。

27、菌(AgroBacterium tumefaciens)株系EHA105(中国科学院遗传所)中， 并转化水稻(方法 可参照Toki等,Plant J,2006,47(6):969-976)， 具体如下： 将实施例1获得的yl1-1突变体 种子脱壳， 用30的NaClO表面灭菌15min， 无菌水冲洗后接种到诱导愈伤组织的培养基中， 32持续光照培养5-7天， 挑选生长旺盛， 颜色浅黄， 比较松散的胚性愈伤组织， 用作转化的 受体。 用含有双元质粒pCAMBIA1300-YL1的EHA105菌株侵染水稻愈伤组织， 在黑暗处25培 养3天后， 在含有50mg/L潮霉素和400mg/L羧苄的选择培养。

28、基上筛选抗性愈伤组织， 并接种 于50mg/L潮霉素和250mg/L羧苄的分化培养基上， 32持续光照培养2周， 分化出的幼苗经 移至生根培养基诱导生根， 然后移栽到水田， 结实后收种进行表型鉴定。 结果显示， 与同时 期的突变体植株比较， yl1-1:pCAMBIA1300-YL1互补转基因植株叶色恢复正常， 叶绿素含 量也恢复到野生型水平(叶绿素检测方法可参照Lichtenthaler,Methods in Enzymology, 1987,148:350-382)， 说明本发明获得了使突变体黄叶表型恢复正常的转基因水稻(图5)。 0050 实施例3 0051 1、 叶绿体超微结构观察 0。

29、052 为了研究YL1基因突变对水稻叶绿体发育的影响， 我们通过透射电镜观察分析了 40天苗龄的野生型和突变心叶和第四叶的叶绿体超微结构。 结果图6所示。 野生型植株的心 叶和第四叶均展现出较完整的叶绿体结构， 基粒片层堆积有规则。 然而， yl1-1突变体中叶 绿体形态表现出不规则表型， 类囊体膜堆积松散， 而且基粒片层堆积明显少于野生型。 说明 YL1功能缺失使叶绿体发育受损。 0053 2、 YL1蛋白的亚细胞定位 0054 我们构建了YL1全长的亚细胞定位载体， 探究YL1在水稻中的亚细胞定位情况。 质 说明书 6/8 页 8 CN 106399323 A 8 粒构建方法同实施例2中所。

30、述： 引物为pCYL1-F(5 -根据目的基因(LOC_Os02g05890)设计引 物YL1-GFP-F (5 -gagctcATGCCTCCACTTGCCACAAT-3 ) 和YL1-GFP-R (5 - gtcgacTTGGGGAGCGAGCCCATTGT-3 )， 片段包含所述基因CDS序列全长， 以粳稻品种日本晴 cDNA为模板， 利用NEB公司Q5高保真酶体系进行PCR扩增， 反应体系和条件同实施例2。 PCR产 物经电泳后， 回收目标片段并接入T5-zero载体(购自北京全式金生物技术有限公司)， 经测 序验证后， 克隆到双元载体CaMV 35S:GFP(中国科学院遗传所)中， 。

31、获得了用于转化的质粒 pCaMV 35S:YL1-GFP。 我们用PEG转化法将亚细胞定位载体转到新鲜制备的水稻原生质体 (粳稻品种日本晴)中， 在激光共聚焦显微镜下观察水稻原生质体， 可以明显的观察到融合 蛋白GFP信号出现在叶绿体上， 绿色荧光信号随着叶绿体的移动而移动并且始终重叠在一 起， 如图7所示。 以上结果表明， YL1定位在水稻的叶绿体中。 0055 3、 YL1基因表达分析 0056 利用TRIzol(购自Invitrogen公司)法， 分别提取野生型籼稻品种蜀恢527的根、 茎、 叶、 叶鞘、 幼穗和孕穗的总RNA， 采用TOYOBO反转录试剂盒(ReverTraqPCR R。

32、T Master Mix with gDNA Remover)反转录成cDNA， 然后利用CFX96荧光定量PCR仪(Bio-Rad) 进行荧光定量PCR检测， qPCR反应使用SYBR Green Supermix(Bio-Rad)试剂盒， 所有试剂盒 涉及的方法均根据相关说明书操作。 结果如图8中A所示， YL1基因在叶和叶鞘中表达量最 高， 其次是茎， 在根， 幼穗和孕穗中几乎没有表达。 0057 为了进一步研究YL1基因的表达模式， 我们构建了YL1promoter驱动的GUS基因质 粒(YL1 promoter:GUS， 质粒构建方法同实施例2中所述， 引物为pGUS-F： 5 - 。

33、ggtaccAGTCCCATGTAAATAGGGTC-3 和pGUS-R： 5 -ccatggGATATGCAGCAGCTGTGTAG-3 ， 以日本 晴gDNA为模板， 扩增YL1基因启动子区2099bp片段， 最终将PCR产物克隆到含GUS报告基因的 pCAMBIA1301(购自中国科学院遗传所)中， 并将该质粒通过农杆菌介导方法转入籼稻品种 日本晴中， 转化方法同实施例2。 在转基因T2代检测GUS染色， 结果显示(图8中B)， 在叶、 叶 鞘、 茎中能检测到很高的GUS基因表达， 而在根和幼穗中几乎检测不到， 与qRT-PCR结果一 致。 表明YL1在绿色组织中有较高的表达量。 005。

34、8 4、 类囊体膜光合相关蛋白复合体亚基表达检测 0059 为研究YL1功能缺失对叶绿体光合相关蛋白复合体的影响， 我们通过Western Blot方法检测野生型和突变体类囊体膜上光合相关蛋白复合体部分核心亚基(PsaAPSI、 PsbA和PsbOPSII、 AtpA和AtpBAtpase、 Cyt fCyt b6f、 LHcbLHC、 RbcL)的表达量。 类 囊体膜蛋白提取方法可参照Zhang等(Plant Methods,1999,7:30)方法。 取相同重量的野生 型和突变体植物叶片提取类囊体膜蛋白用于Western Blot分析， 具体步骤如下： 类囊体膜 蛋白加入相同体积的2SDS。

35、上样缓冲液(125mM Tris-HClpH6.8、 2SDS、 20甘油、 0.02溴酚蓝、 5 -巯基乙醇)并煮沸5min， 经10SDS-PAGE胶电泳分离， 电泳后的分离胶 通过湿转至PVDF膜上(90V， 1h)， 然后用5的脱脂奶粉(用TBST缓冲液配置， 缓冲液配方： 10mM Tris-HCl， pH7.5、 150mM NaCl、 0.05Tween20)室温封闭1h， 封闭结束后用TBST缓冲 液漂洗3次， 每次5min， 之后加入上述光合蛋白复合体亚基的抗体(一抗， 1:2000， 抗体溶于 5的脱脂奶粉TBST溶液)孵育(4过夜或室温1h)， 结束后用TBST缓冲液漂洗。

36、3次， 每次 5min， 随后加入二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗兔HRP抗体， 1:5000)室温孵育1h， 同样用 TBST缓冲液漂洗3次， 每次5min， 最后经ECL(购自Invitrogen公司)后通过化学发光成像系 说明书 7/8 页 9 CN 106399323 A 9 统检测蛋白印迹(Bio-Rad)。 结果显示， 相比于野生型， yl1-1突变体中所有检测的光合蛋白 亚基的表达量均显著下降， 特别是PSI中心亚基PsaA较野生型下降了70， 如图9所示。 表 明YL1基因对叶绿体光合作用相关蛋白复合体亚基的积累具有重要作用。 0060 5、 YL1蛋白与类囊体膜光合相关蛋白亚基。

37、互作研究 0061 为了深入分析YL1影响叶绿体发育的分子机理， 我们通过酵母双杂交方法筛选YL1 的互作蛋白。 质粒构建采用实施例2中所述方法， 首先通过PCR扩增YL1基因和部分编码光合 蛋白亚基基因(PsaA、 D1、 AtpA、 AtpB、 Cyt f)的CDS全长(所用引物见表3)， 测序验证后YL1基 因片段克隆至pGAKT7载体(prey)， PsaA、 D1、 AtpA、 AtpB、 Cyt f等基因则分别克隆至pGADT7 载体。 酵母双杂交的实验采用Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System(购自 Clontech)， 参照说明书方法操作。

38、。 蛋白互作结果如图10所示， YL1基因与AtpB基因共转化的 酵母细胞能在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp+X-gal的培养基上生长而且能都变蓝， 而与其他几 个基因共转化均不能生长， 说明YL1与AtpB在体外具有相互作用。 此外， 通过双分子荧光互 补(BiFC,bimolecular fluorescence complementationn； 方法可参照Waadt等,Plant J, 2008,56:505-516)实验分析进一步验证了在体内YL1与AtpB也发生相互作用。 0062 表3酵母杂交载体构建引物 0063 0064 为进一步证实YL1与AtpB互作是否影响。

39、叶绿体ATPase生物合成， 我们检测了野生 型和yl1-1突变体叶绿体ATPase活性。 酶活检测采用Sigma公司的ATPase活性检测试剂盒 (Sigma-Aldrich)， 检测方法按试剂盒说明书操作。 结果如图11所示， yl1-1突变体的叶绿体 ATPase活性相比于野生型下降了58.3， 表明YL1对维持叶绿体ATPase的活性具有重要的 作用。 说明书 8/8 页 10 CN 106399323 A 10 0001 序列表 1/2 页 11 CN 106399323 A 11 0002 序列表 2/2 页 12 CN 106399323 A 12 图1 图2 说明书附图 1/5 页 13 CN 106399323 A 13 图3 图4 说明书附图 2/5 页 14 CN 106399323 A 14 图5 图6 图7 说明书附图 3/5 页 15 CN 106399323 A 15 图8 图9 说明书附图 4/5 页 16 CN 106399323 A 16 图10 图11 说明书附图 5/5 页 17 CN 106399323 A 17 。