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1、(10)授权公告号 CN 102002528 B (45)授权公告日 2012.09.26 CN 102002528 B *CN102002528B* (21)申请号 201010554690.7 (22)申请日 2010.11.22 C12Q 1/68(2006.01) G01N 21/64(2006.01) (73)专利权人 浙江省疾病预防控制中心 地址 310051 浙江省杭州市滨江区信诚路 630 号 (72)发明人 金大智 张政 罗芸 程苏云 (74)专利代理机构 杭州天正专利事务所有限公 司 33201 代理人 黄美娟 冷红梅 WO 2010/130882 A1,2010.11.1。
2、8, 全文 . Dongeun Yong 等 .Characterization of a New Metallo-Lactamase Gene, blaNDM-1, and a Novel Erythromycin Esterase Gene Carried on a Unique Genetic Structure in Klebsiella pneumoniae Sequence Type 14 from India .ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY .2009, 第 53 卷 ( 第 12 期 ), 第 5046-5054 页 . 徐利娟等 。
3、.“超级细菌” NDM-1 的研究现 状 . 动物医学进展 .2010, 第 31 卷 ( 第 11 期 ), 第 100-103 页 . Seydina M. Diene 等 .Real-time PCR assay allows detection of the New Delhi metallo-lactamase (NDM-1)-encoding gene in France.International Journal of Antimicrobial Agents .2011, 第 37 卷第 544-546 页 . (54) 发明名称 一种抗生素耐药 NDM-1 基因的荧光检测试剂。
4、 盒及检测方法 (57) 摘要 本发明提供了一种抗生素耐药 NDM-1 基因 的荧光检测试剂盒及检测方法。所述试剂盒中 特异性引物和荧光探针序列如下 ： 上游引物 ： 5 -CAG CCA CCA AAA GCG ATG T-3 ， 下 游 引物 ： 5 -CGG CCACAC CAG TGA CAA TA-3， 荧光探针 ： 5 -FAM-TGC CGT CGA TCCCAA CGG TG-TAMRA-3， 其中 FAM 为荧光报告基团， TAMRA 为荧光淬灭基团。 本发明的有益效果主要体现在 ： 使用本发明检测试剂盒， 抗生素耐药 NDM-1 基因 的检测敏感性高， 特异性好， 降低了常。
5、规 PCR 扩增 的假阳性率 ； 可实现对抗生素耐药 NDM-1 基因的 快速、 准确、 特异检测。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 武雪梅 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 2 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 2 页 附图 2 页 1/1 页 2 1. 一种抗生素耐药 NDM-1 基因的荧光检测试剂盒， 所述试剂盒主要包括特异性引物和 荧光探针、 PCR 缓冲液、 脱氧三磷酸核苷混合物和 DNA 聚合酶， 其特征在于所述特异性引物 和荧光探针序列如下 ： 上游引物 ： 5 -CA。
6、GCCACCAAAAGCGATGT-3 下游引物 ： 5 -CGGCCACACCAGTGACAATA-3 荧光探针 ： 5 -FAM-TGCCGTCGATCCCAACGGTG-TAMRA-3 其中 FAM 为荧光报告基团， TAMRA 为荧光淬灭基团。 2. 如权利要求 1 所述的试剂盒， 其特征在于所述试剂盒中还包括抗生素耐药 NDM-1 基 因标准品， 所述标准品序列如下 ： agc gac ttg gcc ttg ctgtcc ttg atc agg cag cca cca aaa gcg atg tcg gtg ccg tcg atc cca acg gtg ata ttgtca ct。
7、g gtg tgg ccg ggg ccg ggg taa aat acc ttg agc ggg cca。 权 利 要 求 书 CN 102002528 B 2 1/5 页 3 一种抗生素耐药 NDM-1 基因的荧光检测试剂盒及检测方法 ( 一 ) 技术领域 0001 本发明涉及一种抗生素耐药 NDM-1 基因的荧光检测试剂盒及检测方法。 ( 二 ) 背景技术 0002 NDM-1 全称 New Delhi metallo-lactamase 1( 新德里金属 - 内酰胺分解 酶 )， 因为最初发现在印度和巴基斯坦等南亚地区， NDM-1 的名称里包含它的发现地。这种 酶可分解 - 内酰胺环。
8、结构， 因此可使任何含 - 内酰胺环结构的蛋白质失效。近期一种 可抗绝大多数抗生素的耐药性超级细菌 NDM-1 在英美印度等国家小规模爆发， 这种细菌其 实是一种特殊的酶， 它能够进入大多数细菌的 DNA 线粒体中存活， 从而使细菌产生广泛的 耐药性。 由于目前为止临床最常用的抗生素， 包括青霉素与头孢菌素， 以及新发展的头霉素 类、 硫霉素类、 单环 - 内酰胺类等其他非典型 - 内酰胺类抗生素， 都含有 - 内酰胺环 结构， 因此携带这种酶的细菌可以使几乎所有抗生素失效。超级细菌是指携带编写 NDM-1 酶基因的细菌。大多数 NDM-1 超级病菌出现在大肠杆菌和肺炎克雷伯菌中。NDM-1 。
9、基因存 在于 DNA 的结构中， 被称为质体。研究人员称， 质体可以在细菌中自由复制和移动， 从而使 “超级细菌” 的菌种有多种可能， 具有传播和变异的惊人潜能。 0003 目前， NDM-1 基因已经从南亚扩散到欧美等国家， 如英国、 美国、 加拿大、 澳大利亚、 荷兰等， 全球已经报道有 170 多人被感染， 光是英国就已经有超过 50 例患者 ； 而 8 月 14 日 比利时一名男子的死亡， 则成为世界上首例由它引起的死亡病例。科研工作者在印度、 巴 基斯坦、 英国等开展了较大范围的流行病学调查， 产 NDM-1 肠杆菌科细菌占所监测细菌的 1.2 -13， 主要菌种为大肠埃希菌和肺炎克。
10、雷伯菌， 其他细菌还有阴沟肠杆菌、 变形杆 菌、 弗劳地枸橼酸菌、 产酸克雷伯菌、 摩根摩根菌、 普罗威登菌等。这些细菌主要引起尿路、 血流、 伤口、 肺部和导管相关感染等。在美国、 加拿大、 日本、 韩国、 澳大利亚、 比利时以及我 国香港、 台湾地区等都已经有感染病例报道。 ( 三 ) 发明内容 0004 本发明目的是根据抗生素耐药NDM-1基因设计引物和TaqMan探针， 提供一种检测 抗生素耐药 NDM-1 基因的荧光检测试剂盒及其检测方法， 可实现对细菌体内携带的 NDM-1 基因进行快速、 准确、 特异检测。 0005 本发明采用的技术方案是 ： 0006 一种抗生素耐药 NDM-。
11、1 基因的荧光检测试剂盒， 所述试剂盒主要包括特异性引物 和荧光探针、 PCR 缓冲液、 脱氧三磷酸核苷混合物和 DNA 聚合酶， 所述特异性引物和荧光探 针序列如下 ： 0007 上游引物 ： 5 -CAGCCACCAAAAGCGATGT-3 0008 下游引物 ： 5 -CGGCCACACCAGTGACAATA-3 0009 荧光探针 ： 5 -FAM-TGCCGTCGATCCCAACGGTG-TAMRA-3 0010 其中 FAM 为荧光报告基团， TAMRA 为荧光淬灭基团。 说 明 书 CN 102002528 B 3 2/5 页 4 0011 本发明关键在于特异性引物和荧光探针序列。
12、的设计， 试剂盒中其他组成， 可按本 领域常规进行选择， 该试剂盒可用作抗生素耐药 NDM-1 基因的定性检测， 也可加入标准品 进行定量检测。 0012 优选的， 所述试剂盒中还可包括抗生素耐药 NDM-1 基因标准品， 所述标准品序列 如下 ： agc gac ttg gcc ttg ctg tcc ttg atc agg cag cca cca aaa gcgatg tcg gtg ccg tcg atc cca acg gtg ata ttg tca ctg gtg tgg ccg ggg ccg ggg taaaat acc ttg agc ggg cca。以标准品的梯度浓度的 DN。
13、A 溶液进行荧光 PCR 检测， 根据拷贝浓度的对数值与标 准品 Ct 值的关系可绘制得到标准曲线， 测得样品 DNA 的 Ct 值后， 对照标准曲线即可获得样 品 DNA 的拷贝浓度。 0013 本发明还涉及一种抗生素耐药 NDM-1 基因的荧光检测方法， 所述方法包括 ： 0014 (1) 提取待测样本 DNA ； 0015 (2) 取特异性扩增引物及特异性探针、 PCR 缓冲液、 脱氧三磷酸核苷混合物和 DNA 聚合酶， 分别加入阴性对照品或待测样品 DNA 配成 PCR 反应体系， 于同等条件下进行 PCR 扩 增反应， 反应管置于定量荧光 PCR 仪进行荧光检测 ； 0016 所述特。
14、异性引物和荧光探针序列如下 ： 0017 上游引物 ： 5 -CAGCCACCAAAAGCGATGT-3 0018 下游引物 ： 5 -CGGCCACACCAGTGACAATA-3 0019 荧光探针 ： 5 -FAM-TGCCGTCGATCCCAACGGTG-TAMRA-3 0020 其中 FAM 为荧光报告基团， TAMRA 为荧光淬灭基团 ； 0021 所述阴性对照品可按本领域常规方法选择， 通常选择不含靶基因 (NDM-1) 和对多 种抗生素敏感的非靶细菌， 如副溶血性弧菌、 志贺菌、 沙门菌等。 0022 (3)选择荧光检测模式FAM荧光， 基线调整取315个循环的荧光信号， 以阈值。
15、线 刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线 ； 若待测样品荧光增长曲线超过阈值线， 并呈 良好的对数增长， 0023 则判断为阳性。 0024 为达到定量检测的要求， 所述方法同时以梯度浓度的标准品 DNA 溶液在与样品 DNA 相同条件下进行 PCR 扩增反应， 以标准品 DNA 溶液拷贝浓度的对数值为横坐标、 标准品 Ct值为纵坐标绘制标准曲线 ； 根据样品DNA测得的Ct值， 对照标准曲线， 获得样品DNA的拷 贝浓度 ； 所述标准品序列如下 ： agc gac ttg gcc ttg ctg tcc ttg atc agg cag cca cca aaa gcgatg tcg gtg 。
16、ccg tcg atc cca acg gtg ata ttg tca ctg gtg tgg ccg ggg ccg ggg taaaat acc ttg agc ggg cca。 0025 所述 PCR 反应条件可按参照本领域常规荧光定量 PCR 方法， 优选的， 所述 PCR 扩增 反应条件如下 ： 95变性 2 分钟， 95 15 秒、 60 30 秒进行 40 个循环扩增。 0026 PCR 反应液通常按如下组成配制 ( 终浓度 ) ： PCR buffer 终浓度为 1、 0.3 0.5M 的引物、 0.1 0.3M 的荧光探针、 1 2.5U 的 DNA 聚合酶、 0.2 0.4。
17、mM 的 dNTPs， 通常取 2L( 约 50ng/l) 的模板， 反应总体积通常为 20 50L。PCR buffer 终浓度 为1， 是指缓冲液中各组分终浓度与1PCR buffer相同， 通常采用市购2PCR buffer， 体积用量为 PCR 反应液体系总体积的 1/2。1PCR buffer 组成如下 ： KCl 50mM， Tris-HCl 10mM， TritonX-1000.1， MgCl2 1.5mM。 说 明 书 CN 102002528 B 4 3/5 页 5 0027 本发明建立了利用 TaqMan 荧光定量 PCR 技术检测抗生素耐药 NDM-1 基因的方法， 并经。
18、检测人工全基因合成的标本， 表明该方法切实可行。由于本方法采用了 PCR 扩增技术， 使得抗生素耐药 NDM-1 基因的检测敏感性大大提高， 而且由于荧光探针的应用， 使得其特 异性亦大大提高， 降低了常规 PCR 扩增的假阳性率， 使得我们可以在极少的标本中获得足 够的监测信息。 0028 本发明采用了目前较先进的特异性荧光探针杂交定量 PCR 检测技术， 在保持高敏 感性的前提下尽量减少假阳性干扰。在实时荧光定量 PCR 检测技术出现之前， 人们对 PCR 模板的定量不论是直接 PCR 还是竞争性 PCR， 基本上都要通过 PCR 产物电泳， 再将电泳结果 经计算机图像处理， 根据电泳条带。
19、的亮度来确定最终 PCR 产物量的多少， 或将带标记的 PCR 产物以 ELISA 的方式进行检测， 再由此推测起始模板的量， 但这些方法实际上都属于半定 量水平， 因为即使 PCR 条件已优化到最佳程度， 电泳及后续步骤的操作的不稳定性仍会给 结果分析带来影响， 从而影响定量这的结果。随着实时荧光定量 PCR 技术的出现， 人们可以 真正地做到对PCR模板的精确定量， 这种定量不仅保持了常规PCR的高灵敏性， 而且由于特 异性荧光探针杂交技术的应用， 使得被检测基因的特异性大大提高。 0029 本发明的有益效果主要体现在 ： 使用本发明检测试剂盒， 抗生素耐药 NDM-1 基因 的检测敏感性。
20、高， 特异性好， 降低了常规 PCR 扩增的假阳性率 ； 可实现对抗生素耐药 NDM-1 基因快速、 准确、 特异检测。 ( 四 ) 附图说明 0030 图 1 为实时荧光定量 PCR 标准品检测 ： 抗生素耐药 NDM-1 基因实时荧光定量 PCR 标准品检测结果， 从左至右分别为 107、 106、 105、 104、 103、 102、 101copies/L 标准品。 0031 图 2 为实时荧光定量 PCR 标准曲线。标准曲线为 Y -3.559lgX+36.34 ； Y ： 对 应的 CT 值 ； X ： 抗生素耐药 NDM-1 基因的 copies。 0032 图 3 为不同浓度。
21、的 5 例人工合成全基因标本荧光定量 PCR 检测结果， CT 值 分 别 为 24.78、 25.90、 27.26、 27.29 和 28.05，拷 贝 数 分 别 为 1.307105copies/L、 4.72104copies/L、 1.17104copies/L、 1.13104copies/L 和 4.70103copies/ L。 ( 五 ) 具体实施方式 0033 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述， 但本发明的保护范围并不仅限于 此 ： 0034 实施例 1 ： 0035 特异性引物、 荧光探针和标准品的获得 0036 1、 材料 ： 0037 细菌基因组 DNA 提。
22、取试剂购自大连宝生物工程有限公司 ； 限制性内切酶购自美国 LTI/Gibco公司， pGEM-T-Easy克隆系统、 Taq DNA聚合酶购自美国Promega公司， 测序试剂、 377 型测序仪、 Bio-Rad icycler PCR 仪、 Rotor Gene Q 5-plex 型定量 PCR 仪 (Qiagen 公 司 )。 0038 2、 引物及探针设计与合成 ： 说 明 书 CN 102002528 B 5 4/5 页 6 0039 以抗生素耐药 NDM-1 基因序列 ( 注册号为 AB571289) 为模板， 使用 Primer ExpressTM(V2.0， 美国 ABI 公。
23、司 ) 软件分析 TaqMan 引物和探针位点， 从中选择最佳组合。 0040 标准品 PCR 序列 ： 0041 上游引物 ： 5 -TGGCCTTGCTGTCCTTGATC-3 ， 0042 下游引物 ： 5 -TGGCCCGCTCAAGGTATTTT-3 ， 0043 检测用 PCR 序列为 ： 0044 上游引物 ： 5 -CAGCCACCAAAAGCGATGT-3 0045 下游引物 ： 5 -CGGCCACACCAGTGACAATA-3 0046 荧光探针 ： 5 -FAM-TGCCGTCGATCCCAACGGTG-TAMRA-3 0047 其中 FAM 为荧光报告基团， TAMR。
24、A 为荧光淬灭基团。 0048 均由上海辉睿生物科技有限公司合成。 0049 3、 检测标准品制备 ： 0050 采用 ABI394 寡核苷酸合成仪根据抗生素耐药 NDM-1 基因序列中标准品 PCR 序列 的位置， 全基因合成123bp的寡核苷酸片段。 用标准品上下游引物在Bio-Rad icycler PCR 仪上进行 PCR 扩增 ： 0051 PCR 反应液组成如下 ： 0052 2PCR buffer 10.0L 0053 标准品上游引物 (10M) 1L 0054 标准品下游引物 (10M) 1L 0055 DNA 聚合酶 (5U/L) 0.2L 0056 dNTPs( 各 250。
25、mM) 1.6L 0057 (dATP、 dTTP、 dCTP、 dGTP 物质的量比 1 1 1 1) 0058 模板 DNA(50ng/L) 1L 0059 水补足至 20L。 0060 PCR 条件为 ： 94 5 分钟变性， 94 20 秒、 55 20 秒、 72 20 秒进行 35 个循环扩 增， 最后于 72延伸 5 分钟后置 4。 0061 PCR 产物经电泳检测后即用克隆系统插入 pGEM-T-Easy 克隆载体， 并将阳性克隆 经测序验证。回收 123bp 片段， 即为标准品， 测定浓度并换算成 ( 拷贝数 / 体积 )。 0062 4、 结果 ： 0063 经测序， 上述。
26、设计标准品完全与预期相符， 回收的标准品片段序列如下 ： agc gac ttg gcc ttg ctg tcc ttg atc agg cag cca cca aaa gcg atg tcg gtg ccgtcg atc cca acg gtg ata ttg tca ctg gtg tgg ccg ggg ccg ggg taa aat acc ttg agcggg cca(SEQ ID No.4)。 0064 实施例 2 ： 荧光定量 PCR 法检测人工模拟样本 0065 1、 标本检测 ： 0066 5 例人工模拟标本， 采用基因组 DNA 提取试剂提取基因组 DNA， 分别取 1.0。
27、L 做模 板， 用检测用上下游引物在Rotor Gene Q 5-plex型定量PCR仪(Qiagen公司)上进行PCR 扩增。 0067 PCR 反应液组成如下 ： 说 明 书 CN 102002528 B 6 5/5 页 7 0068 2PCR buffer 10.0L 0069 检测用上游引物 (10M) 1L 0070 检测用下游引物 (10M) 1L 0071 检测用荧光探针 (10M) 0.5L 0072 DNA 聚合酶 (5U/L) 0.2L 0073 dNTPs( 各 250mM) 1.60L 0074 (dATP、 dTTP、 dCTP、 dGTP 物质的量比 1 1 1 1。
28、) 0075 模板 DNA(50ng/L) 1L 0076 水补足至 20L。 0077 PCR 反应条件为 ： 95预变性 2 分钟， 95 15 秒、 60 30 秒进行 40 个循环扩增。 0078 以非靶细菌肺炎克雷伯氏菌(ATCC 700603)为阴性对照于相同条件下进行PCR检 测， 以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线 ； 若待测样品荧光增长曲线超过 阈值线， 并呈良好的对数增长， 则判断为阳性。 0079 同时在相同条件下以不同浓度标准品进行检测， 并绘制标准曲线。 0080 待测样本的测定结果经仪器处理根据标准曲线计算出检测样本中的抗生素耐药 NDM-1 基因的数量。
29、。 0081 以副溶血性弧菌 (ATCC 17802)、 志贺菌 (ATCC 12022)、 沙门菌 (ATCC 50035)、 金 黄色葡萄球菌(ATCC 25933)、 鲍曼不动杆菌(ATCC25004)和空肠弯曲菌(ATCC 33560)菌株 按照上述方法进行 PCR 检测， 检测结果均呈阴性， 说明本发明方法特异性好。 0082 2、 样品检测结果 0083 标准品检测结果参见图 1， 标准曲线参见图 2。 0084 5 例人工模拟标本检出抗生素耐药 NDM-1 基因阳性， 检测结果参见图 3 ： 5 例 阳性标本荧光定量 PCR 检测结果， CT 值分别为 24.78、 25.90、。
30、 27.26、 27.29 和 28.05， 拷 贝 数 分 别 为 1.307105copies/L、 4.72104copies/L、 1.17104copies/L、 1.13104copies/L 和 4.70103copies/L。 0085 本发明是结合最佳实施例进行描述的， 然而在阅读了本发明的上述内容后， 本领 域技术人员可以对本发明作各种改动或修改， 这些等价形式同样落于本申请所附权利要求 书所限定的范围。 说 明 书 CN 102002528 B 7 1/2 页 8 SEQUENCE LISTING 浙江省疾病预防控制中心 一种抗生素耐药 NDM-1 基因的荧光检测试剂盒及。
31、检测方法 4 PatentIn version 3.4 1 19 DNA Unknown 人工序列 1 cagccaccaa aagcgatgt 19 2 20 DNA Unknown 人工序列 2 cggccacacc agtgacaata 20 3 20 序 列 表 CN 102002528 B 8 2/2 页 9 DNA Unknown 人工序列 3 tgccgtcgat cccaacggtg 20 4 123 DNA Unknown 人工序列 4 agcgacttgg ccttgctgtc cttgatcagg cagccaccaa aagcgatgtc ggtgccgtcg 60 atcccaacgg tgatattgtc actggtgtgg ccggggccgg ggtaaaatac cttgagcggg 120 cca 123 序 列 表 CN 102002528 B 9 1/2 页 10 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102002528 B 10 2/2 页 11 图 3 说 明 书 附 图 CN 102002528 B 11 。