一种中国南瓜内参基因及其应用.pdf

本发明公开了一个用于中国南瓜内参基因的18S rRNA序列，在此基础上设计定量特异引物，中国南瓜18S rRNA基因在中国南瓜各生长发育阶段及各种非生物胁迫条件下均能稳定表达，适合在中国南瓜基因表达研究中作为内参基因。本发明首次将18S rRNA基因作为内参基因用于中国南瓜基因表达分析，有利于提高中国南瓜基因表达分析研究的稳定性、可靠性和重复性；本发明提出的检测引物具有特异性，大大的提高了检测效率，提高了检测结果的可信度。

1.  一种中国南瓜内参基因，其特征在于：所述内参基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；且该内参基因是以中国南瓜DNA为模板、并以如下引物对进行PCR扩增反应所得的；
其中引物对为：
正向引物5'-CCAATCATACTCAAAAGAAGAGTT-3'，
反向引物5'-AGGATTCAATCCAGCCACAGGTT-3'。

2.  一种实时荧光定量PCR引物，其特征在于：以权利要求1中所述内参基因的核苷酸序列为基础，利用Primer Premier5.0软件、并遵循实时荧光定量PCR引物设计的原则设计出一对荧光定量特异引物，该对荧光定量特异引物即为所述实时荧光定量PCR引物；
且该实时荧光定量PCR引物为：
正向引物5'-AAACCTTACCAGCCCTTGAC-3'，
反向引物5'-CGCTCGTTATAGGACTTGACC-3'。

一种中国南瓜内参基因及其应用
【技术领域】
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种中国南瓜内参基因及其应用，具体地，利用该中国南瓜内参基因的核苷酸序列为基础设计一对荧光定量特异引物。
【背景技术】
中国南瓜(Cucurbita moschata Duch.)为葫芦科(Cucurbitaceae)南瓜属(Cucurbita spp.)中3个主要栽培种之一。中国南瓜适应性强，分布地域广，种类繁多，产品营养丰富，是我国人民喜爱的传统蔬菜。随着其分子生物学研究的不断深入和发展，基因表达分析正逐渐应用于揭示中国南瓜基因调控机理的研究中。在基因表达分析时，为了消除不同组织细胞间初始模板量、RNA质量、酶促反应效率等的偏差，往往需要引入内参基因对其进行校正。理想的内参基因应该在不同组织类型、生长阶段及不同实验条件下表达水平均保持一致，实际研究中常选择稳定表达的看家基因，如肌动蛋白基因(actin)、甘油醛-3-磷酸-脱氢酶基因(GAPDH)、微管蛋白基因(tubulin)、泛素基因(ubiquitin)、18S核糖体RNA(18S rRNA)等作为内参基因。
18S rRNA存在于所有的真核生物细胞中，几乎在所有组织中都高水平表达，在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的，且其作为内参基因在分析植物基因表达以及检测植物体内的病原物研究中应用广泛。但目前关于中国南瓜18S rRNA基因的克隆和作为关于中国南瓜内参基因的研究还未见报道。
【发明内容】
本发明所要解决的技术问题在于提供一种中国南瓜内参基因，并揭露了利用该中国南瓜内参基因为基础设计的实时荧光定量PCR引物。
本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：一种中国南瓜内参基因，所述内参基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；且该内参基因是以 中国南瓜DNA为模板、并以如下引物对进行PCR扩增反应所得的；
其中引物对为：
正向引物5'-CCAATCATACTCAAAAGAAGAGTT-3'，
反向引物5'-AGGATTCAATCCAGCCACAGGTT-3'。
进一步地，以所述内参基因的核苷酸序列为基础，利用Primer Premier5.0软件、并遵循实时荧光定量PCR引物设计的原则设计出一对荧光定量特异引物，该对荧光定量特异引物即为所述实时荧光定量PCR引物；
且该实时荧光定量PCR引物为：
正向引物5'-AAACCTTACCAGCCCTTGAC-3'，
反向引物5'-CGCTCGTTATAGGACTTGACC-3'。
本发明的有益效果在于：
本发明提供了一种中国南瓜内参基因，同时揭露了利用该中国南瓜内参基因为基础设计的实时荧光定量PCR引物，所设计的实时荧光定量PCR引物用于中国南瓜基因表达分析时，能够提高中国南瓜基因表达分析研究的稳定性、可靠性和重复性；此外，所设计的实时荧光定量PCR引物特异性强，从而能够大大的提高了采用实时荧光定量检测中国南瓜时的检测效率，并提高了检测结果的可信度。
【附图说明】
下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的描述。
图1是本发明中实施例1的1％琼脂糖凝胶电泳图。
图2是本发明中实施例2的1％琼脂糖凝胶电泳图。
图3是本发明中实施例3的PCR扩增曲线图。
图4是本发明中实施例3的溶解曲线图。
图5是本发明中实施例4的1％的琼脂糖凝胶电泳图。
【具体实施方式】
本发明列举了以下几个代表性实施例，这些实施例仅是示例性的，且不用于限制本发明的范围，这些实施例仅用于对本发明进行说明。且各实施例中所采用的仪器与试剂如下：美国ABI7500实时定量PCR仪，美国ABI Veriti 96-well热循环仪，美国ABI PowerGreen PCR Master Mix,pMD18-T-vector、cDNA第一链合成试剂盒(PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit)、Marker DL 2000、Taq DNA Polymerase、dNTP均为宝生物工程(大连)有限公司产品，胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒为Omega公司产品，引物合成和克隆测序由铂尚生物技术(上海)有限公司完成，其余生化试剂均为国产分析纯。
实施例1内参基因的获得
步骤(1)、根据Genbank公布的西瓜、甜瓜及西葫芦的18S rRNA基因设计一对引物，并利用clustalx软件对所设计的该引物对进行序列比对，且由铂尚生物技术(上海)有限公司合成该对引物，具体地，该对引物(如SEQ ID NO：1、2所示)：正向引物5'-CCAATCATACTCAAAAGAAGAGTT-3'，反向引物5'-AGGATTCAATCCAGCCACAGGTT-3'。
步骤(2)、DNA提取：称取中国南瓜叶片0.5g于研钵中，加入液氮和0.1克的PVP快速充分研磨至粉末状，将粉末移至1.5mL离心管中；每管加入600μL预热至65℃的2％CTAB提取缓冲液，同时加入7μL 2-琉基乙醇，充分混匀，65℃水浴30min，且每隔10min颠倒一次；取出离心管，冷至室温，接着加入等体积的氯仿/异戊醇(氯仿/异戊醇中氯仿、异戊醇二者的体积比为24:1)，轻缓颠倒混匀，静置10min，室温下12000rpm离心10min；取上清液至另一离心管，加2/3体积的异丙醇，轻缓颠倒混匀，室温放置15min，于4℃条件下12000rpm离10min；用体积分数70％的乙醇洗涤DNA沉淀2-3次，然后风干；风干后将所得DNA溶于500μL TE溶液，加入终浓度50mg/mL的RNase A 2uL，并于37℃保温30min，之后用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测DNA质量；最后将DNA稀释至50ng/μL，并于-20℃冰箱中保存备用。
步骤(3)、PCR扩增：以经步骤(3)处理所得的DNA为模板，并以步骤(1)中获得的引物为引物对进行PCR扩增反应，得到PCR扩增产物。
PCR反应体系：反应体系的总体积为25μL，含50ng/μL DNA 0.5μL、10 μmol/L正向和反向引物各1μL、10mmol/L dNTP 0.5μL、5U/μL Taq DNA聚合酶0.25μL、1.5mmol/L MgCl₂的10×PCR缓冲液2.5μL、其余成分为灭菌的超纯水。
PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，35个循环；最后72℃下延伸10min；于4℃下保存。
步骤(5)、取步骤(4)所得PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测后，得到如图1所示大小的片段，回收该片段并进行纯化后连接到pMD18-T载体上转化，挑取阳性克隆子，PCR检测后送至测序，所测得的序列即为内参基因的核苷酸序列，其如SEQ ID NO：3所示。
实施例2实时荧光定量PCR设计和常规PCR检测
以实施例1获得的内参基因的核苷酸序列为基础，利用Primer Premier5.0软件，并遵循实时荧光定量PCR引物设计的原则设计出一对荧光定量特异引物，其扩增片段为132bp，该对荧光定量特异引物即为所述实时荧光定量PCR引物(如SEQ ID NO：4、5所示)：正向引物5'-AAACCTTACCAGCCCTTGAC-3'，反向引物5'-CGCTCGTTATAGGACTTGACC-3'。
提取中国南瓜总RNA，并按照PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒的方法合成cDNA第一链，即将RNA反转录为cDNA；之后以所得cDNA为模板、以实时荧光定量PCR引物为引物对进行PCR扩增，且PCR扩增的反应体系与反应程序如下：
PCR反应体系：反应体系的总体积为25μL，含50ng/μL cDNA 0.5μL、10μmol/L正向和反向引物各1μL、10mmol/L dNTP 0.5μL、5U/μL Taq DNA聚合酶0.25μL、1.5mmol/L MgCl₂的10×PCR缓冲液2.5μL、其余成分为灭菌的超纯水。
PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；最后72℃下延伸10min；于4℃下保存。
将PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图2所示； 由图2可知，PCR扩增得到一条单一条带，没有出现非特异性扩增条带(图2)，经测序大小为132bp，符合预期大小；则可继续下游的实时荧光定量PCR引物验证。
实施例3实时荧光定量PCR引物验证
提取中国南瓜总RNA，并按照PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒的方法合成cDNA第一链，即将RNA反转录为cDNA；之后以所得cDNA为模板、按照PowerGreen PCR Master Mix说明书在ABI7500实时定量PCR仪上进行PCR反应，PCR反应的反应体系与反应程序如下：
反应体系为：反应体系的总体积为25μL，12.5μL PowerGreen PCR Master Mix，1μL模板，实施例2中实时荧光定量PCR引物的正向引物0.5μL(浓度为10μmol/L)，实施例2中实时荧光定量PCR引物的反向引物0.5μL(浓度为10μmol/L)，补蒸馏水至总体积25μL。
反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火1min，共40个循环；4℃保存；每个反应做3个重复。
反应的结果如图3(其中，ΔRn指荧光强度、cycle指循环数)所示，从图3可以看出，3次重复的荧光定量PCR扩增曲线均很好。且为检验反应的特异性，申请人在PCR后进行融解曲线分析，分析结果如图4所示，从图4可显示出，3次重复的Tm(溶解温度)分别为82.89℃、82.89℃、82.7℃，且均只有一个特异峰，表明无引物二聚体，扩增条带单一，特异性强，没有非特异性扩增出现，从而表明所设计的一对引物特异性强(即实施例2中的实时荧光定量PCR引物)，扩增效率高，特异性强，能够用于中国南瓜荧光定量PCR的内参引物实验。
实验例4中国南瓜18S rRNA基因表达稳定性分析
分别提取中国南瓜根、茎、叶、花、幼瓜、老瓜、高温处理(38℃)叶片、低温处理(8℃)叶片、强光处理(2000umol·m^-2·s^-1)叶片、及弱光处理 (200umol·m^-2·s^-1)叶片的总RNA，之后分别按照PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒的方法合成cDNA第一链，以获得各自的cDNA；利用实施例2中的实时荧光定量特异引物为引物对，以获得的10种的cDNA为模板，分别进行PCR扩增，PCR扩增体系与扩增程序如下：
PCR扩增体系：反应体系的总体积为25μL，含50ng/μL cDNA 0.5μL、10μmol/L正向和反向引物各1μL、10mmol/L dNTP 0.5μL、5U/μL Taq DNA聚合酶0.25μL、1.5mmol/L MgCl2的10×PCR缓冲液2.5μL、其余成分为灭菌的超纯水。
PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，28个循环；最后72℃下延伸10min；于4℃下保存。
将PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图5所示，且图5中标识1至10分别为中国南瓜根、茎、叶、花、幼瓜、老瓜、高温处理(38℃)叶片、低温处理(8℃)叶片、强光处理(2000umol·m-2·s-1)叶片、及弱光处理(200umol·m-2·s-1)叶片的PCR扩增反应结果；由图5显示，采用实施例2中的实时荧光定量特异引物为引物对时，扩增所得的10个条带亮度基本一致，从而表明在中国南瓜不同组织、各生长发育阶段、及各种非生物胁迫条件下均能稳定表达，即说明了实时荧光定量特异引物在中国南瓜基因表达中的稳定性，从而适用于中国南瓜基因表达的研究。
综上，本发明提供了一种中国南瓜内参基因，并揭露了利用该中国南瓜内参基因为基础设计的实时荧光定量PCR引物，所设计的实时荧光定量PCR引物用于中国南瓜基因表达分析时，能够提高中国南瓜基因表达分析研究的稳定性、可靠性和重复性；此外，所设计的实时荧光定量PCR引物特异性强，从而能够大大的提高了采用实时荧光定量检测中国南瓜时的检测效率，并提高了检测结果的可信度。