技术领域
本发明属于细胞生物学领域，更具体地，本发明涉及一种非人灵长类动物血管内皮祖细胞的高效扩增培养体系。
背景技术
细胞治疗是近年来兴起的疾病治疗新技术，是利用某些具有特定功能的细胞特性，通过体外扩增、特殊培养等处理后，达到治疗疾病的目的。内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells，EPCs)是血管内皮细胞的前体细胞，主要存在于脐带血、成人外周血、骨髓。近年来的研究显示，内皮祖细胞在心脑血管疾病、外周血管疾病、肿瘤血管形成及创伤愈合等方面均发挥重要作用，同时，因其在扩增和分化过程中表达FVIII以及游走的移植特性，可作为一种细胞治疗途径用于FVIII缺乏的甲型血友病，已有报道称可通过同源移植正常的内皮祖细胞缓解hemophilia A小鼠的出血症状，提高存活率。
正常情况下，内皮祖细胞在血液循环系统中的数量极少，只占外周血中的0.005-0.01％，脐带血中也只有0.2-1％，直接获取的数量无法满足临床治疗以及科研的需要。近年来的研究表明可通过基因干预或添加特定细胞因子、小分子化合物及化学成分的方式在一定程度上促进其扩增效率。
目前，血管内皮祖细胞的体外培养主要是通过密度梯度离心法分离脐血、外周血、骨髓中的单个核细胞，进一步采用CD34、CD133免疫磁珠阳性筛选后在内皮生长因子(VEGF、EGF、IGF等)诱导下进行扩增与分化。此前，本发明人通过新建的培养技术(一种人血管内皮祖细胞的高效扩增培养体系201410397090.2)已经实现人脐血及动员后外周血中血管内皮祖细胞的体外高效、安全的扩增。
但是，本领域当前尚无针对非人灵长类动物来源血管内皮祖细胞的扩增手段，为了更好地在非人灵长类动物水平上进行临床前体内功能性研究，一 种优化的非人灵长类动物血管内皮祖细胞培养技术亟待建立。
发明内容
本发明的目的在于提供一种非人灵长类动物血管内皮祖细胞的高效扩增培养体系。
在本发明的第一方面，提供一种培养非人灵长类动物血管内皮祖细胞的方法(为非治疗性方法)，所述方法包括：
(1)利用干细胞扩增培养基扩增非人灵长类动物CD34+单个核细胞；
(2)将步骤(1)扩增后的细胞转移到内皮祖细胞培养基中培养，获得非人灵长类动物血管内皮祖细胞；
其中，所述的干细胞扩增培养基包括：干细胞基础培养基以及如下细胞因子：
干细胞因子(SCF)：50-500ng/mL；
Flt3-配体(FLT-3L)：50-500ng/mL；
血小板因子(TPO)：5-200ng/mL；
白介素3(IL-3)：5-50ng/mL；
粒细胞集落刺激生物因子(GM-CSF)：5-25ng/mL；
粒细胞集落刺激因子(G-CSF)：5-25ng/mL
Sall样蛋白4B(Sall4B)：1-10ng/mL；和
血管内皮生长因子(VEGF)：15-150ng/mL。
其中，所述的内皮祖细胞培养基包括：内皮细胞基础培养基以及如下组分：
血管内皮生长因子(VEGF)：5-100ng/mL；
胰岛素样生长因子(IGF)：5-100ng/mL；
表皮细胞生长因子(EGF)：2-20ng/mL；
成纤维细胞生长因子(b-FGF)：5-100ng/mL；
抗坏血酸(Ascorbic Acid)：0.5-6μg/mL；
肝素(Heparin)：40-200U/mL；
氢化可的松(Hydrocortisone)：80-300ng/mL；和
L谷胺酰胺(L-glutamine)：1-6mM。
在一个优选例中，所述的干细胞基础培养基选自(但不限于)：Modified IMDM培养基或Modified StemSpan培养基；或所述的内皮细胞基础培养基选自(但不限于)：EBM-2培养基、M199、M200培养基等类似培养基(较佳地含有5-25％胎牛血清)。
在另一优选例中，步骤(1)包括：CD34+单个核细胞加入到所述的干细胞扩增培养基中，使得细胞浓度为3-20×105个细胞/mL(较佳地为6-12×105个细胞/mL)；培养2-4天后根据细胞数目增加量进行分孔并添加所述的干细胞扩增培养基使得细胞浓度为3-20×105个细胞/mL(较佳地为6-12×105个细胞/mL)；步骤(1)进行5-7天。
在另一优选例中，步骤(2)包括：步骤(1)进行5-7天后，将获得的细胞转移到所述的内皮祖细胞培养基中、置于包被有纤维连接蛋白的培养板中培养，细胞在培养基中密度为0.3-3×106个细胞/mL(较佳地0.5-2×106个细胞/mL)，继续培养2-4天后吹散细胞，选择贴壁细胞继续培养；后续每2-3天更换1次内皮祖细胞培养基；更换3-6次后收获细胞。
在另一优选例中，所述的非人灵长类动物包括：猴。
在本发明的另一方面，提供一种以扩增CD34+单个核细胞为主的干细胞扩增培养基，其中包括：干细胞基础培养基以及如下细胞因子：
干细胞因子(SCF)：50-500ng/mL；
Flt3-配体(FLT-3L)：50-500ng/mL；
血小板因子(TPO)：5-200ng/mL；
白介素3(IL-3)：5-50ng/mL；
粒细胞集落刺激生物因子(GM-CSF)：5-25ng/mL；
粒细胞集落刺激因子(G-CSF)：5-25ng/mL
Sall样蛋白4B(Sall4B)：1-10ng/mL；和
血管内皮生长因子(VEGF)：15-150ng/mL。
在一个优选例中，所述的用于扩增CD34+单个核细胞的干细胞扩增培养基中包括如下细胞因子：
干细胞因子：100-400ng/mL；
Flt3-配体：100-400ng/mL；
血小板因子：10-150ng/mL；
白介素3：5-30ng/mL；
粒细胞集落刺激生物因子：8-20ng/mL；
粒细胞集落刺激因子：8-20ng/mL
Sall样蛋白4B：2-8ng/mL；和
血管内皮生长因子(VEGF)：20-100ng/mL。
在本发明的另一方面，提供一种用于培养非人灵长类动物血管内皮祖细胞的培养基，其中包括：内皮细胞基础培养基以及如下组分：
血管内皮生长因子(VEGF)：5-100ng/mL；
胰岛素样生长因子(IGF)：5-100ng/mL；
表皮细胞生长因子(EGF)：2-20ng/mL；
成纤维细胞生长因子(b-FGF)：5-100ng/mL；
抗坏血酸(Ascorbic Acid)：0.5-6μg/mL；
肝素(Heparin)：40-200U/mL；
氢化可的松(Hydrocortisone)：80-300ng/mL；和
L谷胺酰胺(L-glutamine)：1-6mM。
在一个优选例中，所述的用于培养非人灵长类动物血管内皮祖细胞的培养基中，所述组分包括：
血管内皮生长因子：10-80ng/mL；
胰岛素样生长因子：10-80ng/mL；
表皮细胞生长因子：4-16ng/mL；
成纤维细胞生长因子：8-80ng/mL；
抗坏血酸：1-4μg/mL；
肝素：80-200U/mL；
氢化可的松：100-250ng/mL；和
L谷胺酰胺：2-5mM。
在本发明的另一方面，提供前面任一所述的培养基的用途，用于制备非人灵长类动物血管内皮祖细胞。
在本发明的另一方面，提供一种用于制备非人灵长类动物血管内皮祖细胞的试剂盒，所述试剂盒中包括：
(a)所述的以扩增CD34+单个核细胞为主的干细胞扩增培养基；和
(b)所述的用于培养非人灵长类动物血管内皮祖细胞的培养基。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、本发明对猴骨髓CD34+干细胞来源的内皮祖细胞扩增情况(I)。
图1A、内皮祖细胞的扩增数目。
图1B、内皮祖细胞的扩增倍数。
图2、本发明对猴骨髓CD34+干细胞来源的内皮祖细胞扩增及分化结果的形态学观察和功能鉴定。
图2A、猴骨髓来源的内皮祖细胞扩增及分化的细胞形态图。
图2B、猴骨髓来源的内皮祖细胞扩增及分化的鉴定图。
图3、本发明对猴动员后外周血CD34+干细胞来源的内皮祖细胞扩增情况(I)。
图3A、内皮祖细胞的扩增数目。
图3B、内皮祖细胞的扩增倍数。
图4、本发明对猴动员后外周血CD34+干细胞来源的内皮祖细胞扩增及分化结果的形态学观察和功能鉴定。
图4A、猴动员后外周血来源的内皮祖细胞扩增及分化的细胞形态图。
图4B、猴动员后外周血来源的内皮祖细胞扩增及分化的鉴定图。
具体实施方式
为了克服现有技术中没有针对非人灵长类动物血管内皮祖细胞的培养体系的缺陷，本发明人深入研究后，开发了一种新型的非人灵长类动物血管内皮祖细胞高效扩增培养技术，从而可极大地推动内皮祖细胞在进入人体移植临床实验前的研究进展。
如本文所用，术语“含有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成(制成)”、“基本上由……构成”和“由……构成”。
如本文所用，所述的“非人灵长类动物”是指人以外的灵长类动物，包括：猴，猩猩，猿等。
本发明人根据人血管内皮祖细胞扩增培养的不同阶段，提供了不同的培养基，包括：干细胞扩增培养基和内皮祖细胞培养基。
所述的干细胞扩增培养基包括：干细胞因子(SCF)、Flt3-配体(FLT-3L)、血小板因子(TPO)、白介素3(IL-3)、粒细胞集落刺激生物因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，Sall样蛋白4B(Sall4B)和血管内皮生长因子(VEGF)。上述各细胞因子以适合的比例添加到干细胞基础培养基中，可为CD34+单个核细胞提供适合的离体生长环境的培养基，促进CD34+单个核细胞的生长和扩增。作为本发明的优选方式，用于配制本发明的干细胞扩增培养基的各组分的用量如表1所示。
表1
表1配方的细胞因子被添加于干细胞基础培养基中，得到干细胞扩增培养基，从而为CD34+单个核细胞提供适宜的生长和扩增环境。所述的细胞培养基可以选择Modified IMDM培养基、Modified StemSpan培养基或类似的细胞培养基。
所述的内皮祖细胞培养基包括：血管内皮生长因子(VEGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、表皮细胞生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(b-FGF)、抗坏血酸(Ascorbic Acid)、肝素(Heparin)、氢化可的松(Hydrocortisone)和L谷胺酰胺(L-glutamine)。上述各组分以适合的比例添加到内皮细胞基础培养基中，获得本发明的内皮祖细胞培养基。作为本发明的优选方式，用于配制本发明的内皮祖细胞培养基的各组分的用量如表2所示。
表2
含量 优选量 更优选量 血管内皮生长因子(VEGF) 5-100ng/mL 10-80 ng/mL 25 ng/mL 胰岛素样生长因子(IGF) 5-100ng/mL 10-80ng/mL 20ng/mL 表皮细胞生长因子(EGF) 2-20ng/mL 4-16ng/mL 10ng/mL 成纤维细胞生长因子(b-FGF) 5-100ng/mL 8-80ng/mL 10ng/mL 抗坏血酸(Ascorbic Acid) 0.5-6μg/mL 1-4μg/mL 2μg/mL 肝素(Heparin) 40-200U/mL 80-200U/mL 100U/mL 氢化可的松(Hydrocortisone) 80-300ng/mL 100-250ng/mL 100ng/mL L谷胺酰胺(L-Glutamine) 1-6mM 2-5mM 4mM
表2配方的组分被添加于内皮细胞基础培养基中，得到本发明的内皮细胞培养基，从而为内皮祖细胞提供了优选的简化的培养基配方。
经本发明人优化后的上述培养基，含有足够且合理的促进细胞生长和扩增的成份、以及有利于细胞保持干性或实现分化的成分，有利于内皮祖细胞的培养。
用于配制培养基的Sall4B、SCF、TPO、Flt-3L、IL3、GM-CSF、G-CSF、VEGF、IGF、EGF、b-FGF等细胞因子均是本领域技术人员易于获得的，例如可通过商业途径购买，或可通过人工合成或重组表达获得。
在本发明的优选实施方式中，所述的非人灵长类动物是猴。本发明人首先提取食蟹猴股骨髓及动员后外周血中的CD34+单个核细胞，针对猴血液干细胞的生长特性，在人内皮祖细胞扩增培养体系的基础上进行了细胞因子组合、培养方式的调整及优化，首创性地对非人灵长类动物来源的血管内皮祖细胞进行大规模的扩增及分化，获得的猴内皮祖/内皮细胞可在培养的不同阶段冻存和复苏，并能够进一步扩增为满足不同移植需求的功能性内皮细胞，从而应用于多种疾病模型的同源移植治疗。
通过不同阶段调整细胞因子组合及浓度，上述方法可以使单次采集的猴骨髓(6-10mL)样本中内皮祖细胞通过12天的培养扩增到2.33×107个，扩增倍数为1142倍；到第18天时扩增数目可达到1.28×108个，倍数达到6275倍；与此同时，还可以使G-CSF/SCF动员后的外周血(15-20mL)样本中的内皮祖细胞通过24天的培养扩增到1.83×107个，扩增倍数为1274倍。
本发明的方法可以高效地获得具有内皮活性功能的内皮祖细胞/内皮细胞，从而满足在灵长类动物自体回输移植的临床前研究中所需要的细胞数量，为内皮祖细胞扩增培养技术应用于临床上治疗缺血性疾病、血友病提供了可靠的实验室研究基础。
本发明首创性地在体外实现非人灵长类动物来源的血管内皮祖细胞的高效扩增，在灵长类动物水平上建立起了利用骨髓及血液干细胞制备安全有效的血管内皮祖细胞/内皮细胞的技术。本发明为内皮祖细胞用于非人灵长类动物自体移植及同源异体移植的实验研究提供宝贵的资源，同时也为人到人的移植提供临床前数据支持，进一步将推动人源内皮祖细胞作为一种可以在体外安全、高效制备的细胞制剂用于缺血类疾病及甲型血友病的临床治疗和科研需求。
本发明的主要特点和优势还包括：第一，本发明在整个培养体系采用临床级别的细胞生长因子，不插入外源性基因，因此不改变原干细胞的基因组 稳定性，无致瘤风险；第二，本发明可使非人灵长类动物骨髓和动员后外周血CD34+干细胞在体外分别通过12天和24天的培养，使得内皮祖细胞的数量超过107，扩增倍数均在1000倍以上，并且能够进一步呈指数生长地扩增和分化为成熟的内皮细胞，发挥成血管作用及分泌功能蛋白的作用。第三，本发明前期培养中加入的多种干细胞生长因子可以较好的维持细胞的干性，使得扩增后的内皮祖细胞保持高增殖活性，有助于移植后向病灶的游走及功能发挥。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、培养基的配制
本发明的培养体系包含CD34+干细胞扩增、内皮祖细胞贴壁扩增分化两个部分：
一、CD34+干细胞扩增期：干细胞扩增培养基
采用Modified IMDM培养基(无血清)作为基础培养基，在其中添加选自表3中任一配方的细胞因子：
表3(单位：ng/mL)
配方A 配方B 配方C SCF 200 100 400 FLT-3L 200 100 400 TPO 20 10 150 IL-3 10 5 20 GM-CSF 12.5 8 20 G-CSF 12.5 8 20 Sall4B 3 2 8 VEGF 50 25 75
二、贴壁扩增期：内皮祖细胞扩增分化培养基
采用EBM-2培养基(10％或20％胎牛血清)作为基础培养基，在其中添加选自表4中任一配方的细胞因子和其他成分：
表4(除另外标示的以外，单位为ng/mL)
配方D 配方E 配方F VEGF 25 10 75 IGF 20 10 80 EGF 10 4 16 b-FGF 10 20 80 抗坏血酸 2μg/mL 1μg/mL 4μg/mL 肝素 100U/mL 50U/mL 200U/mL 氢化可的松 100ng/mL 150ng/mL 250ng/mL L谷胺酰胺 4mM 2mM 5mM
实施例2、对猴骨髓CD34+干细胞来源的内皮祖细胞的扩增及分化(I)
第0天：
(1)配制CD34+干细胞扩增培养基
在Modified IMDM培养基(无血清)中加入各种细胞因子，使细胞因子终浓度为SCF 200ng/mL、Flt-3L 200ng/mL、IL-310ng/mL、TPO 20ng/mL、Sall4B3ng/mL、GM-CSF 12.5ng/mL、G-CSF 12.5ng/mL、VEGF 50ng/mL(即实施例1中配方A)作为扩增培养基。
(2)分离纯化骨髓中CD34+干细胞
从健康青年食蟹猴髂前上棘处取股骨髓8-10mL，PBS稀释10倍，采用密度梯度离心法获取单个核细胞后使用BD公司的CD34抗体(APC-mouse anti-human CD34)及美天旎公司MACS磁珠(Rat anti-mouse IgG)两步分选法分离CD34+单个核细胞，获得细胞数量为1.4×106个细胞。采用CD34+干细胞扩增培养基将细胞重悬，调细胞浓度为6×105个细胞/mL，加入24孔板中，每孔1mL，即6×105个细胞/孔。用显微镜观察然后将管置于培养箱中(37℃，5％CO2)。
(3)流式检测
各取步聚(2)中磁珠分选后的5×104个细胞置于1.5mL EP管中，共3个EP管(管1，2，3)，每管加入1mL含1％BSA的PBS洗涤液，室温下1200rpm离心5分钟，弃去上清，用100μL含1％BSA的PBS重悬细胞沉淀，管1加入2μLVEGFR-2抗体(PE-Mouseanti-humanVEGFR-2),管2加入相对应的同型对照(PE-Mouse anti-human IgG1κ，管3加入2μLCD34抗体(APC-Mouse anti-human CD34)，另取(2)中CD34+分选之前的单个核细胞5×104个同前操作并加入2μL同型对照(APC-Mouse anti-human IgG1κ)。抗体加入后室温避光孵育15分钟，而后每管加入1mL PBS洗涤，1200rpm离心5分钟，弃去上清，用300μL PBS重悬细胞，用流式细胞仪分析细胞表面CD34和VEGFR-2的表达情况。
第3天：
(1)细胞计数，用流式细胞仪分析细胞表面CD34、VEGFR-2的表达情况，并统计总细胞数目，CD34+和VEGFR-2+细胞数目及扩增倍数。
(2)根据细胞数目进行分孔(控制细胞密度低于1×106个/mL)，扩大培养体系并每孔添加新鲜培养基至1mL(添加实施例1中配方A)。
第6天：
培养至第6天更换内皮祖细胞培养基进行贴壁培养。
(1)细胞计数，用流式细胞仪分析细胞表面CD34和VEGFR-2的表达情况，并统计VEGFR-2+细胞数目及扩增倍数。
(2)配制内皮祖细胞培养基，在EBM-2培养基(20％胎牛血清)中加入以下成分，各成分终浓度为：VEGF 25ng/mL、IGF20ng/mL、EGF10ng/mL、b-FGF10ng/mL、抗坏血酸2μg/mL、肝素100U/mL、氢化可的松100ng/mL、L-谷胺酰胺4mM(即实施例1中配方D)
(3)包被培养板：采用人纤维连接蛋白按2.5μg/cm2的浓度对24孔板进行包被，37℃孵育2小时，PBS洗15min，3遍。
(4)培养：按照1×106个细胞/mL的密度将扩增后的所有细胞更换至内皮祖细胞培养基中培养，分别培养至第18天。
第9-18天：
(1)第9天时吹散细胞，将悬浮细胞移出，选择贴壁细胞继续培养。每3天更换一次新鲜培养基(即实施例1中配方D)。
(2)分别在第9，12，15，18天，采用0.25％的胰酶消化贴壁细胞计数，统计贴壁细胞绝对数目，第12天时贴壁的内皮祖细胞绝对数目为2.33×107±2.15×106(n＝3)，第18天时为1.28×108±1.67×107(n＝3)，见图1A。与第0天起始的内皮祖细胞相比(VEGFR2+:1.7％)，第12天的扩增倍数为1142±121，第18天的扩增倍数为6275±792(n＝3)，见图1B。同时记录第3-18天的细胞形态图，结果见图2A。
(3)细胞鉴定：培养至第18天的细胞，按5×104个/孔的密度接种于24孔板，待贴壁后，以无血清的内皮培养基处理24小时，加入10μg/mL的Dil-ac-LDL，37℃孵育4小时，PBS洗3遍；4℃的4％多聚甲醛固定15分钟，加入10μg/mL的FITC-lectin，37℃孵育2小时，PBS洗3遍后用显微镜拍照。如图2B显示，80％以上的贴壁细胞可见红色荧光的DIL-ac-LDL和绿色荧光的FITC-lectin双表达。说明从猴骨髓来源的CD34+干细胞中扩增得到内皮祖/内皮细胞具有表达内皮活性功能的特性，可进一步用于体内移植实验。
实施例3、对猴骨髓CD34+干细胞来源的内皮祖细胞的扩增及分化(II)
第0天：
(1)配制CD34+干细胞扩增培养基
在Modified IMDM培养基(无血清)中加入各种细胞因子，使细胞因子终浓度为SCF 100ng/mL、Flt-3L 100ng/mL、IL-35ng/mL、TPO 10ng/mL、Sall4B2ng/mL、GM-CSF 8ng/mL、G-CSF 8ng/mL、VEGF 25ng/mL(即实施例1中配方B)作为扩增培养基。
(2)分离纯化骨髓中CD34+干细胞
从健康青年食蟹猴髂前上棘处取股骨髓6-8mL，PBS稀释10倍，采用实施例2相应方法分选CD34+细胞，获得细胞数量为1.2×106个细胞。采用CD34+干细胞扩增培养基将细胞重悬，调细胞浓度为5×105个细胞/mL，加入24孔板中，每孔1mL，即5×105个细胞/孔。用显微镜观察然后将管置于培养箱中(37℃，5％CO2)。
(3)流式检测：同实施例2中相应部分(第0天，(3))。
第3天：
(1)细胞计数，用流式细胞仪分析细胞表面CD34、VEGFR-2的表达情况，并统计总细胞数目，CD34+和VEGFR-2+细胞数目及扩增倍数。
(2)根据细胞数目进行分孔(控制细胞密度低于1×106个/mL)，扩大培养体系并每孔添加新鲜培养基至1mL(添加实施例1中配方B)。
第6天：
培养至第6天更换内皮祖细胞培养基进行贴壁培养。
(1)细胞计数，用流式细胞仪分析细胞表面CD34和VEGFR-2的表达情况，并统计VEGFR-2+细胞数目及扩增倍数。
(2)配制内皮祖细胞培养基，在EBM-2培养基(20％胎牛血清)中加入以下成分，各成分终浓度为：VEGF 10ng/mL、IGF10ng/mL、EGF 4ng/mL、b-FGF20ng/mL、抗坏血酸1μg/mL、肝素50U/mL、氢化可的松150ng/mL、L-谷胺酰胺2mM(即实施例1中配方E)
(3)包被培养板：采用人纤维连接蛋白按2.5μg/cm2的浓度对24孔板进行包被，37℃孵育2小时，PBS洗15min，3遍。
(4)培养：按照1×106个细胞/mL的密度将扩增后的所有细胞更换至内皮祖细胞培养基中培养，分别培养至第18天。
第9-18天：
(1)第9天时吹散细胞，将悬浮细胞移出，选择贴壁细胞继续培养。每3天更换一次新鲜培养基(即实施例1中配方E)。
(2)分别在第9，12，15，18天，采用0.25％的胰酶消化贴壁细胞计数，统计贴壁细胞绝对数目，第12天时贴壁的内皮祖细胞绝对数目为6.83×106±4.66×105(n＝3)，第18天时为3.15×107±3.07×106(n＝3)。与第0天起始的内皮祖细胞相比(VEGFR2+:1.3％)，第12天的扩增倍数为523±46，第18天的扩增倍数为2423±322(n＝3)。
实施例4、对猴动员后外周血CD34+干细胞来源的内皮祖细胞的扩增及分化(I)
猴动员后外周血采集：采集前5天，采用皮下注射给予健康青年G-CSF(100μg/kg)+SCF(50μg/kg)，连续动员5天，每次采集15-20mL外周血。
第0天：
(1)配制CD34+干细胞扩增培养基
在Modified IMDM培养基(无血清)中加入各种细胞因子，使细胞因子终浓度为SCF200ng/mL、Flt-3L200ng/mL、IL-310ng/mL、TPO 20ng/mL、Sall4B3ng/mL、GM-CSF 12.5ng/mL、G-CSF 12.5ng/mL、VEGF 50ng/mL(即实施例1中配方A)作为扩增培养基。
(2)分离纯化外周血中CD34+干细胞
采用新鲜的动员后外周血15-20mL，PBS稀释5倍，采用实施例2相应方法分选CD34+细胞，获得细胞数量为1.5×106个细胞。采用CD34+干细胞扩增培养基将细胞重悬，调细胞浓度为6×105个细胞/mL，加入24孔板中，每孔1mL，即6×105个细胞/孔。用显微镜观察然后将管置于培养箱中(37℃，5％CO2)。
(3)流式检测：同实施例2中相应部分(第0天，(3))。
第3天：
(1)细胞计数，用流式细胞仪分析细胞表面CD34、VEGFR-2的表达情况，并统计总细胞数目，CD34+和VEGFR-2+细胞数目及扩增倍数。
(2)根据细胞数目进行分孔(控制细胞密度低于1×106个/mL)，扩大培养体系并每孔添加新鲜培养基至1mL(添加实施例1中配方A)。
第6天：
培养至第6天更换内皮祖细胞培养基进行贴壁培养。
(1)细胞计数，用流式细胞仪分析细胞表面CD34和VEGFR-2的表达情况，并统计VEGFR-2+细胞数目及扩增倍数。
(2)配制内皮祖细胞培养基，在EBM-2培养基(20％胎牛血清)中加入以下成分，各成分终浓度为：VEGF 25ng/mL、IGF20ng/mL、EGF10ng/mL、 b-FGF10ng/mL、抗坏血酸2μg/mL、肝素100U/mL、氢化可的松100ng/mL、L-谷胺酰胺4mM(即实施例1中配方D)
(3)包被培养板：采用人纤维连接蛋白按2.5μg/cm2的浓度对24孔板进行包被，37℃孵育2小时，PBS洗15min，3遍。
(4)培养：按照1×106个细胞/mL的密度将扩增后的所有细胞更换至内皮祖细胞培养基中培养，培养至第24天。
第9-24天：
(1)第9天时吹散细胞，将悬浮细胞移出，选择贴壁细胞继续培养。每3天更换一次新鲜培养基(即实施例1中配方D)。
(2)分别在第9，12，15，18，21，24天，采用0.25％的胰酶消化贴壁细胞计数，统计贴壁细胞绝对数目，第24天时贴壁的内皮祖细胞绝对数目为1.83×107±2.89×106(n＝3)，见图3A。与第0天起始的内皮祖细胞相比(VEGFR2+:1.2％)，第24天的扩增倍数为1274±154(n＝3)，见图3B。同时记录第3-24天的细胞形态图，结果见图4A。
(3)细胞鉴定：方法同实施例2，结果见图4B。85％以上的贴壁细胞可见红色荧光的DIL-ac-LDL和绿色荧光的FITC-lectin双表达。说明从猴动员后外周血来源的CD34+干细胞中扩增得到内皮祖/内皮细胞具有表达内皮活性功能的特性，可进一步用于体内移植实验。
实施例5、对猴动员后外周血CD34+干细胞来源的内皮祖细胞的扩增及分化(II)
猴动员后外周血采集：同实施案例4中相应部分。
第0天：
(1)配制CD34+干细胞扩增培养基
在Modified IMDM培养基(无血清)中加入各种细胞因子，使细胞因子终浓度为SCF400ng/mL、Flt-3L400ng/mL、IL-3200ng/mL、TPO 150ng/mL、Sall4B 8ng/mL、GM-CSF 20ng/mL、G-CSF 20ng/mL、VEGF 75ng/mL(即实施例1中配方C)作为扩增培养基。
(2)分离纯化外周血中CD34+干细胞
采用新鲜的动员后外周血15-20mL(n＝3)，PBS稀释5倍，采用实施例2相应方法分选CD34+细胞，获得细胞数量为2.1×106个细胞。采用CD34+干细胞扩增培养基将细胞重悬，调细胞浓度为8×105个细胞/mL，加入24孔板中，每孔1mL，即8×105个细胞/孔。用显微镜观察然后将管置于培养箱中(37℃，5％CO2)。
(3)流式检测：同实施例2中相应部分(第0天，(3))。
第3天：
(1)细胞计数，用流式细胞仪分析细胞表面CD34、VEGFR-2的表达情况，并统计总细胞数目，CD34+和VEGFR-2+细胞数目及扩增倍数。
(2)根据细胞数目进行分孔(控制细胞密度低于1×106个/mL)，扩大培养体系并每孔添加新鲜培养基至1mL(添加实施例1中配方C)。
第6天：
培养至第6天更换内皮祖细胞培养基进行贴壁培养。
(1)细胞计数，用流式细胞仪分析细胞表面CD34和VEGFR-2的表达情况，并统计VEGFR-2+细胞数目及扩增倍数。
(2)配制内皮祖细胞培养基，在EBM-2培养基(20％胎牛血清)中加入以下成分，各成分终浓度为：VEGF 75ng/mL、IGF80ng/mL、EGF16ng/mL、b-FGF80ng/mL、抗坏血酸4μg/mL、肝素200U/mL、氢化可的松250ng/mL、L-谷胺酰胺5mM(即实施例1中配方F)
(3)包被培养板：采用人纤维连接蛋白按2.5μg/cm2的浓度对24孔板进行包被，37℃孵育2小时，PBS洗15min，3遍。
(4)培养：按照1×106个细胞/mL的密度将扩增后的所有细胞更换至内皮祖细胞培养基中培养，培养至第24天。
第9-24天：
(1)第9天时吹散细胞，将悬浮细胞移出，选择贴壁细胞继续培养。每3天更换一次新鲜培养基(即实施例1中配方F)。
(2)分别在第9，12，15，18，21，24天，采用0.25％的胰酶消化贴壁 细胞计数，统计贴壁细胞绝对数目，第24天时贴壁的内皮祖细胞绝对数目为2.56×107±3.10×106(n＝3)。与第0天起始的内皮祖细胞相比(VEGFR2+:1.0％)，第24天的扩增倍数为1600±257(n＝3)。
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