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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610519970.1 (22)申请日 2016.07.04 (71)申请人 中国科学院海洋研究所 地址 266071 山东省青岛市南海路7号 (72)发明人 孙黎隋智海 (74)专利代理机构 沈阳科苑专利商标代理有限 公司 21002 代理人 李颖周秀梅 (51)Int.Cl. C07K 14/46(2006.01) C12N 15/12(2006.01) C12N 15/70(2006.01) (54)发明名称 一种鱼类CD59的重组蛋白的应用 (57)摘要 本发明涉及。
2、免疫学领域， 具体的说是鱼类 (半滑舌鳎)CD59的重组蛋白的应用。 CD59的重组 蛋白rCD59在制备抑制血清补体激活制剂中的应 用。 CD59重组蛋白是以半滑舌鳎cDNA为模板， 用 引物F1和R1进行PCR扩增CD59基因， 扩增产物经 诱导表达、 纯化即为重组蛋白。 本发明CD59重组 蛋白能够显著抑制血清补体激活。 权利要求书1页 说明书3页 序列表1页 附图1页 CN 106046139 A 2016.10.26 CN 106046139 A 1.一种鱼类CD59的重组蛋白的应用， 其特征在于： CD59的重组蛋白rCD59在制备抑制血 清补体激活制剂中的应用。 2.按权利要求1。
3、所述鱼类CD59的重组蛋白的应用， 其特征在于： CD59的重组蛋白rCD59 在制备抑制鱼类血清补体激活制剂中的应用。 3.按权利要求1或2所述鱼类CD59的重组蛋白的应用， 其特征在于： 所述CD59的重组蛋 白rCD59： 以半滑舌鳎cDNA为模板， 用引物F1和R1进行PCR扩增CD59基因， 扩增产物经诱导表 达、 纯化即为重组蛋白， 所述F1为5 -AGCGGATATCCTGCAGTGTTATTCCTGTC-3 ； R1为5 - AGCGGATATCTCCAAAAAAATTCTTGAA-3 。 权利要求书 1/1 页 2 CN 106046139 A 2 一种鱼类CD59的重组蛋白。
4、的应用 技术领域 0001 本发明涉及免疫学领域， 具体的说是鱼类(半滑舌鳎)CD59的重组蛋白的应用。 背景技术 0002 CD59是一种膜蛋白分子， 通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定在细胞膜上， 属于Ly-6蛋 白超家族的成员。 在哺乳动物中， CD59广泛存在于红细胞、 淋巴细胞和内皮细胞等细胞表 面， 也广泛分布在肝脏、 脾脏和肾脏等大部分组织中。 在哺乳动物中， CD59具有抑制补体激 活的活性； CD59可以结合C5b-8复合物中C8的 链， 也可以结合C9的b结构域， 从而抑制C9的 多聚化， 阻止补体膜攻击复合物的形成,保护自身细胞免遭补体介导的裂解细胞作用。 目 前， CD5。
5、9已经在斑马鱼、 罗非鱼等鱼类中报道， 但是其功能和应用研究尚缺乏。 发明内容 0003 本发明目的在于提供一种鱼类CD59的重组蛋白的应用。 0004 为实现上述目的， 本发明采用的技术方案为： 0005 一种鱼类CD59的重组蛋白的应用， CD59的重组蛋白rCD59在制备抑制血清补体激 活制剂中的应用。 0006 所述CD59的重组蛋白rCD59在制备抑制鱼类(半滑舌鳎)血清补体激活制剂中的应 用。 0007 所述CD59重组蛋白为在大肠杆菌中表达获得重组蛋白。 0008 所述重组CD59蛋白为以半滑舌鳎cDNA为模板， 采用F1/R1为引物进行PCR扩增,PCR 产物经过与载体T-Si。
6、mple连接转换后与载体pET32a连接， 获得质粒pEtCD59， 转化大肠杆菌 BL21(DE3)即可表达重组CD59。 0009 所 述F1 为 5 - AG CG G AT AT C C TG C AG TG T T AT TC C TG TC - 3 ； R 1 为 5 - AGCGGATATCTCCAAAAAAATTCTTGAA-3 。 0010 本发明具有如下优点： 本发明的CD59重组蛋白， 能够显著抑制鱼类(半滑舌鳎)血 清补体激活。 附图说明 0011 图1为本发明实施例提供的重组CD59(rCD59)电泳图。 A图： 泳道1， 分子量标准； 泳 道2,rCD59。 B图：。
7、 泳道1， 分子量标准； 泳道2,rTrx。 0012 下面结合实施例对本发明作进一步说明。 实施例旨在对本发明进行举例描述， 而 非以任何形式对本发明进行限制。 0013 在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法： 0014 1.质粒提取、 DNA(PCR)产物纯化、 DNA片段从凝胶中回收皆使用 “天根生化科技(北 京)有限公司” 的相应试剂盒。 0015 2.大肠杆菌用Hanahan方法(SambrookandRussell:MolecularCloning:A 说明书 1/3 页 3 CN 106046139 A 3 LaboratoryMannual.ColdSprin。
8、gHarborLaboratoryPress2001)。 0016 3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于 “纽英伦生物技术有限公司” ， 北京。 0017 实施例1 0018 CD59重组蛋白rCD59的制备 0019 1)表达CD59重组蛋白rCD59的质粒pEtCD59的构建： 0020 本发明的CD59序列已公布(GenBankaccessionnumberXP_008329743.1)。 0021 CD59由107个氨基酸组成， 具有一个典型的GPI-anchoringregion结构(氨基酸残 基92-106)。 0022 以半滑舌鳎cDNA为模板， 用引物F1和R1进行PCR扩增C。
9、D59基因。 PCR条件为： 94 60s预变性模板DNA,然后9440s,4860s,7265s,5个循环， 然后9440s,60 60s,7265s,30个循环后再在72延伸反应710min。 PCR产物用天根的相应试剂盒纯 化。 表达载体pET32a(Novagen,SanDiego,USA)是一个常用的原核表达载体， 带有一个标签 蛋白Trx， 该蛋白与被表达的蛋白形成融合蛋白， 可提升某些难以表达的蛋白的表达效率。 将pET32a用限制性内切酶EcoRV酶切后回收， 将其与上述纯化的PCR产物用T4DNA连接酶连 接， 连接液转化入大肠杆菌DH5 ， 在含有氨苄青霉素(ampicil。
10、lin)(100ug/ml)的LB培养基 上培养1824小时 ,筛选转化子提取质粒， 命名为pEtCD59。 通过DNA测序分析证明了 pEtCD59为含有上述GPI-anchoringregion结构域的CD59序列的表达质粒， 其中CD59基因 与pET32a的标签蛋白Trx基因融合， 因此该质粒表达的rCD59蛋白是CD59和Trx的融合蛋白。 0023 所述LB组成成分按重量百分比计： 1.0蛋白胨,0.5酵母粉,1.0氯化钠, 97 .5蒸馏水。 所述F1为5 -AGCGGATATCCTGCAGTGTTATTCCTGTC-3 ； R1为5 - AGCGGATATCTCCAAAAAAA。
11、TTCTTGAA-3 。 0024 2)rCD59和对照蛋白rTrx(重组标签蛋白Trx)的诱导表达和纯化 0025 将上述的质粒pEtCD59和pET32a分别用常规方法转化大肠杆菌BL21(DE3)(购自于 “天根生化科技有限公司” ， 北京)， 在含有氨苄青霉素(ampicillin)(100ug/ml)的LB固体培 养基上培养1824小时,挑取转化子， 将其命名为BL21/pEtCD59和BL21/pET32a。 将BL21/ pEtCD59和BL21/pET32a于含有氨苄青霉素(ampicillin)(50ug/ml)的LB液体培养基中过夜 培养； 取1ml过夜后的培养液,加入10。
12、0ml新鲜的含有氨苄青霉素(ampicillin)(50ug/ml)的 LB液体培养基中， 于37下转速200rpm摇动培养至OD600为0.6,加入终浓度为0.1mM的IPTG， 16继续以转速160rpm摇动培养16h， 而后以5000g， 4离心10min， 收集菌液， 加入5ml裂解 液， 在室温于摇床上缓慢摇动1-2小时， 直至菌悬液变澄清为止。 将菌液以10000g， 4离心 30min， 回收上清。 将上清中的蛋白用亲和层析柱HisTrapHPColumns(购于美国GE Healthcare公司)回收纯化。 将纯化的蛋白在PBS中透析20-24h。 将纯化的蛋白经SDS-PAG。
13、E 电泳检测(8v/cm电压下电泳2530min， 随后15v/cm电压下电泳22.5h)， 测定其分子量大 小(参见图1)。 发现rCD9和rTrx的蛋白质质量分别与CD59和Trx相同。 0026 所述裂解液为终浓度的10mMNaH2PO4、 10mMTris和8M尿素,pH8.0。 0027 所述PBS组成成分按重量百分比 计 ： 0 .8NaCl ,0 .02KCl ,0 .358 Na2HPO4.12H2O,0.024NaH2PO4， 余量为水。 0028 实施例2 0029 rCD59抑制血清补体激活的作用 说明书 2/3 页 4 CN 106046139 A 4 0030 半滑舌。
14、鳎血清在含有0.01MMgCl2的Hank sBalancedSaltSolution(HBSS)(购 于北京Solarbio公司)中稀释8倍， 即为稀释血清。 兔血红细胞(购于GuangzhouFuture TechnologyCo.,Ltd,)在HBSS中悬浮至1x109cells/ml， 即为血红细胞悬液。 30ul血红细胞 悬液与300ul稀释血清混合， 将混合液等体积分为三份， 命名为A,B和C。 在A和B中分别加入 10ul300 g/ml的rCD59和rTrx， 在C中加入10ulPBS(对照组)。 将三组在22保温20min,随 后离心(600g)10min。 取上清， 在OD450检测吸光值。 吸光值越高则表示血清中激活的补体量 越多。 结果表明， C组(对照组)的吸光值设为100， 则B组的吸光值为98， 与C组类似， 而A 组的吸光值为58， 显著低于C组。 0031 这些结果说明本发明的rCD59能够显著抑制血清补体激活。 说明书 3/3 页 5 CN 106046139 A 5 0001 序列表 1/1 页 6 CN 106046139 A 6 图1 说明书附图 1/1 页 7 CN 106046139 A 7 。