《具有高耐盐性和油脂降解率的微生物菌剂及其制备方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《具有高耐盐性和油脂降解率的微生物菌剂及其制备方法.pdf（15页完整版）》请在专利查询网上搜索。
1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810966218.0 (22)申请日 2018.08.23 (71)申请人 苏州微宏生物科技有限公司 地址 215106 江苏省苏州市吴中区临湖镇 渡村新区腾飞路33号 (72)发明人 丁国春李季王博 (74)专利代理机构 苏州谨和知识产权代理事务 所(特殊普通合伙) 32295 代理人 叶栋 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C12N 1/18(2006.01) C12N 1/14(2006.01) C05F 11/08(2006.01) C。
2、05F 9/04(2006.01) C12R 1/125(2006.01) C12R 1/07(2006.01) C12R 1/25(2006.01) C12R 1/865(2006.01) C12R 1/11(2006.01) C12R 1/465(2006.01) C12R 1/69(2006.01) (54)发明名称 具有高耐盐性和油脂降解率的微生物菌剂 及其制备方法 (57)摘要 本发明涉及一种具有高耐盐性和油脂降解 率的微生物菌剂及其制备方法， 该微生物菌剂通 过斜面培养、 一级种子培养、 二级种子培养和混 合发酵培养所制备得到， 其包括枯草芽孢杆菌、 解淀粉芽孢杆菌、 植物乳酸菌、。
3、 酿酒酵母、 巨大芽 胞杆菌、 白浅灰链霉菌以及米曲霉。 该具有高耐 盐性和油脂降解率的微生物菌剂复合6种菌种原 料， 能够对厨余垃圾的主要成分(纤维素、 油脂、 淀粉、 蛋白质)进行有效降解， 使厨余垃圾能够充 分发酵， 能够解决厨余垃圾中盐分含量较高以及 餐厨垃圾油脂降解率低、 发酵周期长、 产品腐熟 度差的问题。 权利要求书2页 说明书11页 附图1页 CN 109022321 A 2018.12.18 CN 109022321 A 1.一种具有高耐盐性和油脂降解率的微生物菌剂， 其特征在于， 包括枯草芽孢杆菌、 解 淀粉芽孢杆菌、 植物乳酸菌、 酿酒酵母、 巨大芽胞杆菌、 白浅灰链霉菌。
4、以及米曲霉。 2.如权利要求1所述的具有高耐盐性和油脂降解率的微生物菌剂， 其特征在于， 所述微 生物菌剂中各成分的浓度为： 枯草芽孢杆菌， 4.01091.01010cfu/mL； 解淀粉芽孢杆 菌， 4.01091.01010cfu/mL； 植物乳酸菌， 1.01095.0109cfu/mL； 酿酒酵母， 5.0 1081.0109cfu/mL； 巨大芽胞杆菌， 1.01095.0109cfu/mL； 白浅灰链霉菌， 5.0108 1.0109cfu/mL； 米曲霉， 5.01081.0109cfu/mL。 3.一种根据权利要求1或2所述的具有高耐盐性和油脂降解率的微生物菌剂的制备方 法，。
5、 其特征在于， 包括以下步骤： S1、 提供菌种原料和培养基， 所述菌种原料包括草芽孢杆菌、 解淀粉芽孢杆菌、 植物乳 酸菌、 酿酒酵母、 巨大芽胞杆菌、 白浅灰链霉菌以及米曲霉； 所述培养基包括固体培养基、 液 体培养基和发酵培养基； S2、 斜面培养： 在无菌条件下， 将所述菌种原料接种于所述固体培养基中， 在25-35下 培养1-3天； S3、 一级种子培养： 在无菌条件下， 将S2中培养好的菌种接种于所述液体培养基中， 在 25-35下培养1-3天， 当菌种液体培养OD600值为3.0-4.0时停止培养， 得到一级种子液； S4、 二级种子培养： 在无菌条件下， 将所述一级种子液分别接。
6、种于装有对应液体培养基 的锥形瓶中， 在25-35下培养1-3天， 当菌种液体培养OD600值为3.0-4.0时停止培养， 得到 二级种子液； S5、 混合发酵培养： 在无菌条件下， 先将步骤S4中植物乳酸菌、 酿酒酵母、 巨大芽胞杆 菌、 白浅灰链霉菌、 米曲霉的二级种子液接种于所述发酵培养基进行培养， 再接种枯草芽孢 杆菌的二级种子液进行培养， 最后接种解淀粉芽孢杆菌的二级种子液进行培养， 得到所述 微生物菌剂。 4.如权利要求3所述的具有高耐盐性和油脂降解率的微生物菌剂的制备方法， 其特征 在于， 步骤S1中， 所述固体培养基包括牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、 马铃薯葡萄糖琼脂培养基 以及乳酸。
7、细菌固体培养基； 所述液体培养基包括牛肉膏蛋白胨液体培养基、 马铃薯葡萄糖 液体培养基以及乳酸细菌液体培养基； 所述发酵培养基为： 糖蜜3、 玉米浆粉8、 硫酸镁 0.2、 氢氧化钠0.15、 磷酸氢二钾0.1、 磷酸二氢钾0.1， 余量为水。 5.如权利要求4所述的具有高耐盐性和油脂降解率的微生物菌剂的制备方法， 其特征 在于， 步骤S2中， 具体包括以下步骤： 在无菌条件下， 将所述枯草芽孢杆菌、 解淀粉芽孢杆菌和巨大芽胞杆菌接种于所述牛 肉膏蛋白胨琼脂培养基中进行培养， 将所述植物乳酸菌接种于所述乳酸细菌固体培养基中 进行培养， 将所述酿酒酵母、 白浅灰链霉菌和米曲霉接种于所述马铃薯葡萄。
8、糖琼脂培养基 中进行培养； 其中， 将所述植物乳酸菌、 酿酒酵母、 巨大芽胞杆菌、 白浅灰链霉菌、 米曲霉于 2535条件下培养2-3天， 将所述枯草芽孢杆菌、 解淀粉芽孢杆菌于2535条件下培养 1-2天。 6.如权利要求4所述的具有高耐盐性和油脂降解率的微生物菌剂的制备方法， 其特征 在于， 步骤S3中， 具体包括以下步骤： 在无菌条件下， 将步骤S2中培养好的枯草芽孢杆菌、 解淀粉芽孢杆菌和巨大芽胞杆菌 权利要求书 1/2 页 2 CN 109022321 A 2 接种于所述牛肉膏蛋白胨液体培养基中进行培养， 将培养好的植物乳酸菌接种于所述乳酸 细菌液体培养基中进行培养， 将培养好的酿酒。
9、酵母、 白浅灰链霉菌和米曲霉接种于所述马 铃薯葡萄糖液体培养基中进行培养； 其中， 将植物乳酸菌、 酿酒酵母、 巨大芽胞杆菌、 白浅灰 链霉菌、 米曲霉在2535条件下， 160r/min摇床培养23天， 将枯草芽孢杆菌、 解淀粉芽 孢杆菌在2535条件下， 130r/min摇床培养12天， 当菌种液体培养OD600值为3.0-4.0 时停止培养， 制得所述一级种子液。 7.如权利要求4所述的具有高耐盐性和油脂降解率的微生物菌剂的制备方法， 其特征 在于， 步骤S4中， 具体包括以下步骤： 在无菌条件下， 将步骤S3所制得的枯草芽孢杆菌、 解淀粉芽孢杆菌和巨大芽胞杆菌的 一级种子液接种于装有所。
10、述牛肉膏蛋白胨液体培养基的锥形瓶中进行培养， 将所制得的植 物乳酸菌的一级种子液接种于装有所述乳酸细菌液体培养基的锥形瓶中进行培养， 将所制 得的酿酒酵母、 白浅灰链霉菌和米曲霉的一级种子液接种于装有所述马铃薯葡萄糖液体培 养基的锥形瓶中进行培养； 其中， 将植物乳酸菌、 酿酒酵母、 巨大芽胞杆菌、 白浅灰链霉菌、 米曲霉在2535条件下， 160r/min摇床培养23天， 将枯草芽孢杆菌、 解淀粉芽孢杆菌均 2535条件下， 150r/min摇床培养12天， 当菌种液体培养OD600值为3.0-4.0时停止培 养， 制得所述二级种子液。 8.如权利要求4所述的具有高耐盐性和油脂降解率的微生物。
11、菌剂的制备方法， 其特征 在于， 步骤S5中， 具体包括以下步骤： 在无菌条件下， 先将步骤S4所制得的植物乳酸菌、 酿酒酵母、 巨大芽胞杆菌、 白浅灰链 霉菌、 米曲霉的二级种子液接种于所述发酵培养基中培养1天， 再接种枯草芽孢杆菌的二级 种子液培养1天， 最后接种解淀粉芽孢杆菌的二级种子液后再培养2天， 共培养4天时间， 得 到所述微生物菌剂。 9.如权利要求8所述的具有高耐盐性和油脂降解率的微生物菌剂的制备方法， 其特征 在于， 步骤5中， 所述混合发酵培养包括： 第一阶段： 起始024小时内， 间隔通气， 保持在有氧条件发酵， 其中， 通气量1 1.5VVM， 调控发酵溶解氧15-20。
12、， 搅拌转速150-200r/min， 温度2535； 第二阶段： 2496小时， 连续通气， 搅拌转速150200r/min， 保证溶氧达到30利用 6mol/L的NaOH/HCl溶液调节pH， 使pH保持在7.08.0之间， 温度2030。 10.如权利要求3至9中任一项所述的具有高耐盐性和油脂降解率的微生物菌剂的制备 方法， 其特征在于， 步骤S4中， 所述一级种子液的接种量为体积比4-6； 步骤S5中， 所述二 级种子液的接种量为体积比1-3。 权利要求书 2/2 页 3 CN 109022321 A 3 具有高耐盐性和油脂降解率的微生物菌剂及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及。
13、一种具有高耐盐性和油脂降解率的微生物菌剂及其制备方法。 背景技术 0002 餐厨垃圾是指家庭、 饮食服务和单位供餐等活动中产生的食物残渣和废料。 统计 显示， 我国餐厨垃圾占城市生活垃圾比重大致范围为37-62， 中国主要城市每年产生的 餐厨垃圾量约为6000万吨， 以北京为例， 2014年， 北京餐厨垃圾产生量约为2600多吨/日。 餐 厨垃圾分为厨余和泔脚两种类型： 厨余垃圾是食品加工过程中产生的食物残余； 主要来源 于居民生活区、 食品批零市场和各垃圾站点。 泔脚垃圾是饮食消费后的食物残余； 主要来源 于餐饮行业、 宾馆和企事业单位的食堂。 餐厨垃圾的成分组成以米和面粉类食物残余、 蔬 。
14、菜、 动植物油、 肉骨等为主； 化学组成以淀粉、 纤维素、 蛋白质、 脂肪和无机盐等有机无机物 为主。 0003 我国厨余垃圾存在高有机物含量， 高含水率， 高油脂含量， 高盐分的特性。 按照厨 余垃圾绝对干物质重量百分比计算， 有机物含量约为80， 水分含量约为75， 粗脂肪含量 约为25， 蛋白质含量约为20以上， 盐分含量约为2-3。 0004 目前， 厨余垃圾的处理途径主要包括： 1.用作动物饲料； 2.好氧发酵后制备有机肥 或土壤调理剂； 3.厌氧发酵后产生沼气， 沼渣制作有机肥； 4.油脂分离后生产生物柴油； 5. 进行焚烧或填埋。 虽然厨余垃圾用作动物饲料、 焚烧、 填埋是最直接。
15、简便的处理方式， 但其 弊端也十分明显， 会产生可资源化利用率低、 二次污染等问题。 因此， 好氧发酵、 厌氧产沼气 和生物柴油是目前各个国家针对餐厨垃圾处理的主要技术途径。 饲料化处理技术主要采用 生物转化手段将厨余垃圾经过生物转化、 烘干处理、 杀毒灭菌、 除去盐分等。 最终生成蛋白 饲料添加剂等可利用物质。 0005 好氧堆肥处理技术是在有氧条件下， 利用好氧微生物对厨余垃圾进行吸收、 氧化 和分解的生命代谢活动， 是一种传统好氧堆肥技术与外源微生物强化结合的现代堆肥技 术。 但是， 目前针对厨余垃圾处理的好氧发酵工艺仍然存在一些不足的方面。 例如， 厨余垃 圾中油脂(11-18)和盐分。
16、含量(2-3)较高， 由于过高的盐分含量会对好氧堆肥过程中 的微生物生长和功能发挥产生抑制作用， 所以导致了很多复合微生物菌剂接种于堆体后无 法完全发挥发酵功能， 因而出现了厨余垃圾堆肥的发酵周期变长， 堆肥产品腐熟度较差等 问题， 严重制约了好氧堆肥工艺处理厨余垃圾的效果。 0006 厌氧能源化处理技术是在缺氧条件下， 通过厌氧微生物的代谢活动将有机物降解 为沼气和无机物的方法。 然而， 这些技术中也存在着一些技术瓶颈需要突破， 例如厨余垃圾 好氧发酵存在的发酵周期长、 腐熟度低； 厌氧发酵处理量小、 处理效率低； 生物柴油生产成 本高等主要问题。 发明内容 0007 本发明的目的在于提供一。
17、种具有高耐盐性和油脂降解率的微生物菌剂及其制备 说明书 1/11 页 4 CN 109022321 A 4 方法， 能够解决厨余垃圾中盐分含量较高以及餐厨垃圾油脂降解率低、 发酵周期长、 产品腐 熟度差的问题。 0008 为达到上述目的， 本发明提供如下技术方案： 一种微生物菌剂， 包括枯草芽孢杆 菌、 解淀粉芽孢杆菌、 植物乳酸菌、 酿酒酵母、 巨大芽胞杆菌、 白浅灰链霉菌以及米曲霉。 0009 进一步地， 所述微生物菌剂中各成分的浓度为： 枯草芽孢杆菌， 4.01091.0 1010cfu/mL； 解淀粉芽孢杆菌， 4.01091.01010cfu/mL； 植物乳酸菌， 1.01095.0。
18、 109cfu/mL； 酿酒酵母， 5.01081.0109cfu/mL； 巨大芽胞杆菌， 1.01095.0109cfu/ mL； 白浅灰链霉菌， 5.01081.0109cfu/mL； 米曲霉， 5.01081.0109cfu/mL。 0010 本发明还提供一种微生物菌剂的制备方法， 包括以下步骤： 0011 S1、 提供菌种原料和培养基， 所述菌种原料包括草芽孢杆菌、 解淀粉芽孢杆菌、 植 物乳酸菌、 酿酒酵母、 巨大芽胞杆菌、 白浅灰链霉菌以及米曲霉； 所述培养基包括固体培养 基、 液体培养基和发酵培养基； 0012 S2、 斜面培养： 在无菌条件下， 将所述菌种原料接种于所述固体培养。
19、基中， 在25-35 下培养1-3天； 0013 S3、 一级种子培养： 在无菌条件下， 将S2中培养好的菌种接种于所述液体培养基 中， 在25-35下培养1-3天， 当菌种液体培养OD600值为3.0-4.0时停止培养， 得到一级种子 液； 0014 S4、 二级种子培养： 在无菌条件下， 将所述一级种子液分别接种于装有对应液体培 养基的锥形瓶中， 在25-35下培养1-3天， 当菌种液体培养OD600值为3.0-4.0时停止培养， 得到二级种子液； 0015 S5、 混合发酵培养： 在无菌条件下， 先将步骤S4中植物乳酸菌、 酿酒酵母、 巨大芽胞 杆菌、 白浅灰链霉菌、 米曲霉的二级种子液。
20、接种于所述发酵培养基进行培养， 再接种枯草芽 孢杆菌的二级种子液进行培养， 最后接种解淀粉芽孢杆菌的二级种子液进行培养， 得到所 述微生物菌剂。 0016 进一步地， 步骤S1中， 所述固体培养基包括牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、 马铃薯葡萄 糖琼脂培养基以及乳酸细菌固体培养基； 所述液体培养基包括牛肉膏蛋白胨液体培养基、 马铃薯葡萄糖液体培养基以及乳酸细菌液体培养基； 所述发酵培养基为： 糖蜜3、 玉米浆 粉8、 硫酸镁0.2、 氢氧化钠0.15、 磷酸氢二钾0.1、 磷酸二氢钾0.1， 余量为水。 0017 进一步地， 步骤S2中， 具体包括以下步骤： 0018 在无菌条件下， 将所述枯草芽孢杆。
21、菌、 解淀粉芽孢杆菌和巨大芽胞杆菌接种于所 述牛肉膏蛋白胨琼脂培养基中进行培养， 将所述植物乳酸菌接种于所述乳酸细菌固体培养 基中进行培养， 将所述酿酒酵母、 白浅灰链霉菌和米曲霉接种于所述马铃薯葡萄糖琼脂培 养基中进行培养； 其中， 将所述植物乳酸菌、 酿酒酵母、 巨大芽胞杆菌、 白浅灰链霉菌、 米曲 霉于2535条件下培养2-3天， 将所述枯草芽孢杆菌、 解淀粉芽孢杆菌于2535条件下 培养1-2天。 0019 进一步地， 步骤S3中， 具体包括以下步骤： 0020 在无菌条件下， 将步骤S2中培养好的枯草芽孢杆菌、 解淀粉芽孢杆菌和巨大芽胞 杆菌接种于所述牛肉膏蛋白胨液体培养基中进行培养。
22、， 将培养好的植物乳酸菌接种于所述 乳酸细菌液体培养基中进行培养， 将培养好的酿酒酵母、 白浅灰链霉菌和米曲霉接种于所 说明书 2/11 页 5 CN 109022321 A 5 述马铃薯葡萄糖液体培养基中进行培养； 其中， 将植物乳酸菌、 酿酒酵母、 巨大芽胞杆菌、 白 浅灰链霉菌、 米曲霉在2535条件下， 160r/min摇床培养23天， 将枯草芽孢杆菌、 解淀 粉芽孢杆菌在2535条件下， 130r/min摇床培养12天， 当菌种液体培养OD600值为3.0- 4.0时停止培养， 制得所述一级种子液。 0021 进一步地， 步骤S4中， 具体包括以下步骤： 0022 在无菌条件下， 将。
23、步骤S3所制得的枯草芽孢杆菌、 解淀粉芽孢杆菌和巨大芽胞杆 菌的一级种子液接种于装有所述牛肉膏蛋白胨液体培养基的锥形瓶中进行培养， 将所制得 的植物乳酸菌的一级种子液接种于装有所述乳酸细菌液体培养基的锥形瓶中进行培养， 将 所制得的酿酒酵母、 白浅灰链霉菌和米曲霉的一级种子液接种于装有所述马铃薯葡萄糖液 体培养基的锥形瓶中进行培养； 其中， 将植物乳酸菌、 酿酒酵母、 巨大芽胞杆菌、 白浅灰链霉 菌、 米曲霉在2535条件下， 160r/min摇床培养23天， 将枯草芽孢杆菌、 解淀粉芽孢杆 菌均2535条件下， 150r/min摇床培养12天， 当菌种液体培养OD600值为3.0-4.0时停。
24、 止培养， 制得所述二级种子液。 0023 进一步地， 步骤S5中， 具体包括以下步骤： 0024 在无菌条件下， 先将步骤S4所制得的植物乳酸菌、 酿酒酵母、 巨大芽胞杆菌、 白浅 灰链霉菌、 米曲霉的二级种子液接种于所述发酵培养基中培养1天， 再接种枯草芽孢杆菌的 二级种子液培养1天， 最后接种解淀粉芽孢杆菌的二级种子液后再培养2天， 共培养4天时 间， 得到所述微生物菌剂。 0025 进一步地， 步骤5中， 所述混合发酵培养包括： 0026 第一阶段： 起始024小时内， 间隔通气， 保持在有氧条件发酵， 其中， 通气量1 1.5VVM， 调控发酵溶解氧15-20， 搅拌转速150-20。
25、0r/min， 温度2535； 0027 第二阶段： 2496小时， 连续通气， 搅拌转速150200r/min， 保证溶氧达到30利 用6mol/L的NaOH/HCl溶液调节pH， 使pH保持在7.08.0之间， 温度2030。 0028 进一步地， 步骤S4中， 所述一级种子液的接种量为体积比4-6； 步骤S5中， 所述二 级种子液的接种量为体积比1-3。 0029 与现有技术相比， 本发明的有益效果在于： 0030 1)由于高盐环境会对微生物的生长和功能性产生巨大的影响， 从而使厨余垃圾在 堆肥过程中出现发酵周期长、 发酵腐熟度低等问题， 本发明通过筛选和富集耐盐微生物制 作而成的微生物。
26、菌剂适用于具有保温、 换气和搅拌功能的小型厨余垃圾反应器， 能够在 15盐分条件下正常生长以及发挥功能性， 能够使厨余垃圾的好氧堆肥发酵在10天内完 成， 并达到完全腐熟程度(发芽指数80)， 也能够实现一次投菌长期使用的目的， 从而有 效降低厨余垃圾接种微生物菌剂的购买成本； 0031 2)油脂的大量排放会产生恶臭物质和亚硝酸盐等有害物质， 引起土壤性质发生改 变， 危害农作物的种植， 本发明的微生物菌剂通过筛选和富集耐盐油脂降解细菌， 在堆肥结 束后对厨余垃圾的油脂降解率达到60以上， 从而有效降低堆肥成品中的油脂含量； 0032 3)由于厨余垃圾的化学组成较为复杂， 单一或少量的微生物无。
27、法对厨余垃圾的主 要成分全部进行有效降解。 本发明微生物菌剂复合6种微生物， 能够对厨余垃圾的主要成分 (纤维素、 油脂、 淀粉、 蛋白质)进行有效降解， 使厨余垃圾能够充分发酵。 0033 上述说明仅是本发明技术方案的概述， 为了能够更清楚了解本发明的技术手段， 说明书 3/11 页 6 CN 109022321 A 6 并可依照说明书的内容予以实施， 以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。 附图说明 0034 图1为本发明所示的具有高耐盐性和油脂降解率的微生物菌剂的制备方法的流程 步骤图。 具体实施方式 0035 下面结合附图和实施例， 对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。 。
28、以下实施 例用于说明本发明， 但不用来限制本发明的范围。 0036 本发明的具有高耐盐性和油脂降解率的微生物菌剂， 包括枯草芽孢杆菌、 解淀粉 芽孢杆菌、 植物乳酸菌、 酿酒酵母、 巨大芽胞杆菌、 白浅灰链霉菌以及米曲霉。 其中， 各成分 的浓度为： 枯草芽孢杆菌， 4.01091.01010cfu/mL； 解淀粉芽孢杆菌， 4.01091.0 1010cfu/mL； 植物乳酸菌， 1.01095.0109cfu/mL； 酿酒酵母， 5.01081.0109cfu/ mL； 巨大芽胞杆菌， 1.01095.0109cfu/mL； 白浅灰链霉菌， 5.01081.0109cfu/ mL； 米曲霉。
29、， 5.01081.0109cfu/mL。 0037 发明人对上述各菌种之间经过微生物平板拮抗试验反复验证， 平板均无出现拮抗 圈， 说明所述菌种之间无拮抗作用， 可以混合使用。 0038 请参见图1， 本发明的具有高耐盐性和油脂降解率的微生物菌剂的制备方法， 包括 以下步骤： 0039 S1、 提供菌种原料和培养基， 菌种原料包括草芽孢杆菌、 解淀粉芽孢杆菌、 植物乳 酸菌、 酿酒酵母、 巨大芽胞杆菌、 白浅灰链霉菌以及米曲霉； 培养基包括固体培养基、 液体培 养基和发酵培养基， 其中， 固体培养基包括牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、 马铃薯葡萄糖琼脂培 养基以及乳酸细菌固体培养基； 液体培养基包括。
30、牛肉膏蛋白胨液体培养基、 马铃薯葡萄糖 液体培养基以及乳酸细菌液体培养基； 发酵培养基为： 糖蜜3、 玉米浆粉8、 硫酸镁 0.2、 氢氧化钠0.15、 磷酸氢二钾0.1、 磷酸二氢钾0.1， 余量为水； 0040 S2、 斜面培养： 在无菌条件下， 将枯草芽孢杆菌、 解淀粉芽孢杆菌和巨大芽胞杆菌 接种于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基中进行培养， 将植物乳酸菌接种于乳酸细菌固体培养基中 进行培养， 将酿酒酵母、 白浅灰链霉菌和米曲霉接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基中进行培 养； 其中， 将植物乳酸菌、 酿酒酵母、 巨大芽胞杆菌、 白浅灰链霉菌、 米曲霉于2535条件 下培养2-3天， 将枯草芽孢杆菌、 解。
31、淀粉芽孢杆菌于2535条件下培养1-2天， 优选的， 将 上述菌种原料在30下培养2天； 0041 S3、 一级种子培养： 在无菌条件下， 将步骤S2中培养好的枯草芽孢杆菌、 解淀粉芽 孢杆菌和巨大芽胞杆菌接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中进行培养， 将培养好的植物乳酸 菌接种于乳酸细菌液体培养基中进行培养， 将培养好的酿酒酵母、 白浅灰链霉菌和米曲霉 接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中进行培养； 其中， 上述液体培养基的浓度优选为50mL/ 250mL， 将植物乳酸菌、 酿酒酵母、 巨大芽胞杆菌、 白浅灰链霉菌、 米曲霉在2535条件下， 160r/min摇床培养23天， 优选为在30条件下， 16。
32、0r/min摇床培养2天； 将枯草芽孢杆菌、 解淀粉芽孢杆菌在2535条件下， 130r/min摇床培养12天， 优选为30条件下， 130r/ min摇床培养2天； 当菌种液体培养OD600值为3.0-4.0时停止培养， 制得一级种子液； 说明书 4/11 页 7 CN 109022321 A 7 0042 S4、 二级种子培养： 在无菌条件下， 将步骤S3所制得的枯草芽孢杆菌、 解淀粉芽孢 杆菌和巨大芽胞杆菌的一级种子液接种于装有牛肉膏蛋白胨液体培养基的锥形瓶中进行 培养， 将所制得的植物乳酸菌的一级种子液接种于装有乳酸细菌液体培养基的锥形瓶中进 行培养， 将所制得的酿酒酵母、 白浅灰链霉。
33、菌和米曲霉的一级种子液接种于装有马铃薯葡 萄糖液体培养基的锥形瓶中进行培养； 其中， 一级种子液的接种量为体积比4-6， 将植物 乳酸菌、 酿酒酵母、 巨大芽胞杆菌、 白浅灰链霉菌、 米曲霉在2535条件下， 160r/min摇床 培养23天， 优选为在30条件下， 160r/min摇床培养2天； 将枯草芽孢杆菌、 解淀粉芽孢杆 菌均2535条件下， 150r/min摇床培养12天， 优选为在30条件下， 150r/min摇床培养 2天； 当菌种液体培养OD600值为3.0-4.0时停止培养， 制得二级种子液； 0043 S5、 混合发酵培养： 在无菌条件下， 先将步骤S4所制得的植物乳酸菌、。
34、 酿酒酵母、 巨 大芽胞杆菌、 白浅灰链霉菌、 米曲霉的二级种子液接种于所述发酵培养基中培养1天， 再接 种枯草芽孢杆菌的二级种子液培养1天， 最后接种解淀粉芽孢杆菌的二级种子液后再培养2 天， 共培养4天时间， 得到微生物菌剂， 其中， 二级种子液的接种量为体积比1-3。 0044 在本发明步骤S4中， 锥形瓶的容积可选用1.5L3L。 在本发明步骤S5中， 混合发酵 培养包括： 第一阶段： 起始024小时内， 间隔通气， 保持在有氧条件发酵， 其中， 通气量1 1.5VVM， 调控发酵溶解氧15-20， 搅拌转速150-200r/min， 温度2535； 第二阶段： 24 96小时， 连续。
35、通气， 搅拌转速150200r/min， 保证溶氧达到30利用6mol/L的NaOH/HCl溶 液调节pH， 使pH保持在7.08.0之间， 温度2030。 0045 本发明所制得的具有高耐盐性和油脂降解率的微生物菌剂在应用于高盐高油脂 餐厨垃圾时， 可以将该微生物菌剂按重量比2的接种量接种于高盐高油脂餐厨垃圾中， 充 分混合后， 发酵5-7天。 0046 下面将结合具体实施例来对本发明进行进一步详细地说明。 以下实施例中所涉及 的枯草芽孢杆菌与解淀粉芽孢杆菌由发明人筛选与培育； 植物乳酸菌、 酿酒酵母、 巨大芽胞 杆菌、 白浅灰链霉菌、 米曲霉均为北京沃土天地生物科技有限公司出售的菌株， 本。
36、领域技术 人员可购买得到。 当然， 上述菌种原料的来源在其他实施例中可根据实际情况进行选择， 不 作为对本发明的限制。 0047 实施例一至五为不同成分浓度的微生物菌剂制备 0048 实施例一 0049 S1、 斜面培养： 在无菌条件下， 将枯草芽孢杆菌、 解淀粉芽孢杆菌和巨大芽胞杆菌 接种于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基中进行培养， 将植物乳酸菌接种于乳酸细菌固体培养基 (MRS)中进行培养， 将酿酒酵母、 白浅灰链霉菌和米曲霉接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基 (PDA)中进行培养， 其中， 将植物乳酸菌、 酿酒酵母、 巨大芽胞杆菌、 白浅灰链霉菌、 米曲霉、 枯草芽孢杆菌、 解淀粉芽孢杆菌于30条件下。
37、培养2天； 0050 S2、 一级种子培养： 将步骤S1培养的菌种在无菌条件下分别挑取单菌落接种于 50mL/250mL液体培养基， 植物乳酸菌、 酿酒酵母、 巨大芽胞杆菌、 白浅灰链霉菌、 米曲霉在30 条件下， 160r/min摇床培养2天， 枯草芽孢杆菌、 解淀粉芽孢杆菌均30条件下， 150r/min 摇床培养2天， 当菌种液体培养OD600值为3.0-4.0之间时停止培养， 制得一级种子液； 0051 S3、 二级种子培养： 按液体培养基的体积比为5的接种量， 将一级种子液分别接 种于装有对应液体培养基的1.5L锥形瓶中， 植物乳酸菌、 酿酒酵母、 巨大芽胞杆菌、 白浅灰 说明书 5。
38、/11 页 8 CN 109022321 A 8 链霉菌、 米曲霉在30条件下， 160r/min摇床培养2天， 枯草芽孢杆菌、 解淀粉芽孢杆菌均30 条件下， 150r/min摇床培养2天， 当菌种液体培养OD600值为3.0-4.0之间时停止培养， 制 得二级种子液； 0052 S4、 混合发酵培养： 发酵培养基于121高温高压下灭菌30分钟， 冷却后， 按液体培 养基的体积比为2的接种量， 将二级种子液依次接种到300L的发酵罐中， 发酵罐内的培养 基装量为70， 发酵培养基： 糖蜜3、 玉米浆粉8、 硫酸镁0.2、 氢氧化钠0.15、 磷酸氢 二钾0.1、 磷酸二氢钾0.1， 余量为水。
39、； 采用分批培养方式进行高密度发酵培养， 第一阶 段： 起始024小时内， 保持通气量为1.2VVM， 搅拌转速150r/min， 调控发酵溶氧浓度为 20， pH值为6.57.0， 温度30； 第二阶段： 第24小时至96小时， 通气量为1.5VVM搅拌转速 180r/min， 保证溶氧达到30， 利用6mol/L的NaOH/HCl溶液调节pH， 使pH保持在7.08.0之 间， 温度2030。 0053 根据上述的制备方法获得菌剂总浓度为2.7108cfu/mL， 通过活菌数测定， 高盐 高脂厨余垃圾处理微生物菌剂的构成为： 0054 0055 实施例二 0056 本实施例的制备方法与实施。
40、例一基本类似， 其区别之处在于将步骤S3中接种量 5改为4， 得到本实施例的高盐高脂厨余垃圾处理微生物菌剂， 其活菌构成为： 0057 0058 实施例三 说明书 6/11 页 9 CN 109022321 A 9 0059 本实施例的制备方法与实施例一基本类似， 其区别之处在于将步骤S3中1.5L锥形 瓶改为3L锥形瓶， 得到本实施例的高盐高脂厨余垃圾处理微生物菌剂， 其活菌构成为： 0060 0061 实施例四 0062 本实施例的制备方法与实施例一基本类似， 其区别之处在于将步骤S4中接种量 2改为3， 得到本实施例的高盐高脂厨余垃圾处理微生物菌剂， 其活菌构成为： 0063 0064 。
41、实施例五和六为微生物菌剂在处理高盐高脂厨余垃圾的应用 0065 实施例五 0066 组成： 厨余垃圾80锯末20本发明高盐高脂厨余垃圾处理微生物菌剂。 0067 制作过程： 0068 配料时须先将本微生物菌剂用自来水稀释50-100倍制得复合菌剂稀释液， 然后将 稀释液用液体喷雾装置(如喷壶或喷枪)均匀喷洒于处理对象表面， 并充分翻搅(用搅拌机 最好)均匀。 0069 物料堆成条状山形或梯形进行发酵。 如堆成条状山形， 则堆高为7080cm， 底部宽 为120150cm， 长度不限； 如堆成梯形， 则堆高为4550cm， 长宽不限。 分别设置CK对照组、 VT1000、 1高盐高脂厨余垃圾处理。
42、微生物菌剂和2高盐高脂厨余垃圾处理微生物菌剂接 种于厨余垃圾堆体表面， VT1000的接种量为1， CK对照为自然堆肥处理。 分别于0、 4、 8小时 取样， 倍比稀释后测定活菌数量， 记录结果如表1 说明书 7/11 页 10 CN 109022321 A 10 0070 表1高盐高脂厨余垃圾接种于厨余垃圾后活菌数量 0071 0072 由上表可以看出， 餐厨垃圾中在接种不同接种量的高盐高脂厨余垃圾处理微生物 菌剂后， 活菌数量较对照组和VT-1000菌剂有不同的增加， 说明耐盐微生物在厨余垃圾中有 较好的生长繁殖， 为厨余垃圾后续处理奠定了良好的微生物基础， 通过下面的实施例六可 进一步验。
43、证本发明的微生物菌剂对厨余垃圾的实际处理效果。 用实施例2、 3、 4所得高盐高 脂厨余垃圾处理微生物菌剂进行同样堆肥实验， 高盐高脂厨余垃圾处理微生物菌剂的活菌 数量均高于CK对照与VT-1000菌剂。 0073 实施例六 0074 组成： 厨余垃圾80、 锯末20、 本发明高盐高脂厨余垃圾处理微生物菌剂。 0075 制作过程： 0076 配料时须先将本微生物菌剂用自来水稀释50-100倍制得复合菌剂稀释液， 然后将 稀释液用液体喷雾装置(如喷壶或喷枪)均匀喷洒于处理对象表面， 并充分翻搅(用搅拌机 最好)均匀。 0077 物料水分一般控制在55左右， C/N比调节到2530： 1， pH值。
44、呈中性或弱碱性。 发 酵时， 物料堆成条状山形或梯形进行发酵。 如堆成条状山形， 则堆高为7080cm， 底部宽为 120150cm， 长度不限； 如堆成梯形， 则堆高为4550cm， 长宽不限。 (这里的C/N指的是物料 当中的总碳量和总氮量比值。 C/N值高， 通过添加含N量高的物料进行调节， C/N值低， 通过添 加含C量高的物料进行调节。 )分别设置CK对照组、 VT1000、 1高盐高脂厨余垃圾处理微生 物菌剂和2高盐高脂厨余垃圾处理微生物菌剂接种于厨余垃圾堆体表面， VT1000的接种 量为1， CK对照自然堆肥处理。 0078 发酵过程中， 应观察物料温度变化， 当温度升至50以。
45、上后， 物料每23天翻堆一 次， 连续翻堆34次。 发酵710天基本完成。 0079 堆肥过程中升温至50以上所需时间： 如表2所示， 未加入任何菌剂的CK组升温至 50以上需3.5天， 而加入1、 2高盐高脂厨余垃圾处理微生物菌剂升温至50以上仅需 1.5天和2天， 说明微生物受厨余垃圾中的盐分胁迫较小， 接种于堆体后使堆体迅速升温， 能 够有效缩短堆肥发酵升温时间。 用实施例二、 三、 四所得高盐高脂堆肥接种剂进行同样堆肥 实验， 取得同样的缩短发酵周期的效果。 0080 表2添加高盐高脂厨余垃圾处理微生物菌剂温度随时间的变化 说明书 8/11 页 11 CN 109022321 A 11。
46、 0081 0082 实施例七 0083 组成： 厨余垃圾80、 锯末20、 本发明高盐高脂厨余垃圾处理微生物菌剂。 0084 制作过程： 0085 配料时须先将本微生物菌剂用自来水稀释50-100倍制得复合菌剂稀释液， 然后将 稀释液用液体喷雾装置(如喷壶或喷枪)均匀喷洒于处理对象表面， 并充分翻搅(用搅拌机 最好)均匀。 0086 物料水分一般控制在55左右， C/N比调节到2530： 1， pH值呈中性或弱碱性。 发 酵时， 物料堆成条状山形或梯形进行发酵。 如堆成条状山形， 则堆高为7080cm， 底部宽为 120150cm， 长度不限； 如堆成梯形， 则堆高为4550cm， 长宽不限。
47、。 (这里的C/N指的是物料 当中的总碳量和总氮量比值。 C/N值高， 通过添加含N量高的物料进行调节， C/N值低， 通过添 加含C量高的物料进行调节)分别设置CK对照组、 VT1000、 1高盐高脂厨余垃圾处理微生物 菌剂和2高盐高脂厨余垃圾处理微生物菌剂接种于厨余垃圾堆体表面， VT1000的接种量 为1， CK对照自然堆肥处理。 0087 发酵过程中， 应观察物料温度变化， 当温度升至50以上后， 物料每23天翻堆一 次， 连续翻堆34次， 发酵10天后结束。 0088 厨余垃圾中油脂含量的测定 0089 (1)将装有处理后厨余垃圾试样的滤纸筒放入脂肪抽提器的体筒内， 连接已干燥 至恒。
48、重的接收瓶， 由抽提器冷凝管上端加入石油醚至瓶内容积的2/3处， 于水浴上加热， 使 石油醚不断回流提取6-12小时； 0090 (2)取下接收瓶， 回收石油醚。 待接收瓶内石油醚剩1-2ml时在水浴上蒸干， 再于 1005的烘箱内干燥2h， 放于干燥器内冷却30分钟后称量， 重复以上操作直至恒重； 厨余 垃圾中油脂含量按式(1)计算： 0091 0092 式中： 0093 X-厨余垃圾试样中油脂的含量， 单位为 0094 m1-接收瓶和油脂的质量， 单位为克(g) 说明书 9/11 页 12 CN 109022321 A 12 0095 m0-接收瓶质量， 单位为克(g) 0096 m2-厨。
49、余垃圾试样的质量， 单位为克(g) 0097 在测定时， 重复性条件下的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 10。 0098 厨余垃圾发芽指数测定 0099 (1)将堆肥样品与蒸馏水按1g:10ml配制混合液振荡2h浸提， 浸提液在5000r/min 下离心20min， 取上清液过滤待用。 0100 (2)将一张滤纸平铺于干净无菌的培养皿中， 滤纸上均匀整齐摆放好20粒种子。 准 确移取5ml滤液于培养皿中。 每个样品做3个重复， 并设蒸馏水作对照。 0101 (3)将培养皿置于25恒温箱中培养48h后取出， 记录发芽种子的个数， 发芽种子 的个数与种子总数的比值即发芽率。 用游标卡尺测定每个发芽种子的根长并计算根长的算 术平均数， 即种子平均根长。 0102 堆肥样品的发芽指数GI()， 按照公式(2)进行计算： 0103 0104 式中： 0105 GI发芽指数； 0106 w1堆肥浸提液培养的种子发芽率； 0107 l1堆肥浸提液培养的种子平均根长； 0108 w2蒸馏水培养的种子发芽率； 0109 l2蒸馏水培养的种子平均根长。 0110 发酵结束后， 对餐厨垃圾的油脂降解率、 发芽指数指标测定， 并记录了感官描述， 结果如表3： 0111 表3厨余垃圾堆肥产品相关指标及感官描述 0112 0113 由上表可以看出， 厨余垃圾中在接。