技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及蛋鸭环状RNA circ_13034及其检测试剂、方法与应用。
背景技术
环状RNA(circular RNA，circRNA)是一类新发现的内源性非编码RNA，其由一种共价键形成闭环结构的RNA分子，不受RNA外切酶影响，表达更稳定、不易降解。已有研究表明，circRNA大部分属于非编码RNA，主要由外显子衍生而来，且circRNAs在动物中具有组织特异性。近年来的研究发现，在多种生物细胞和组织中，有超过10％的表达基因能够产生circRNAs。在功能上，近年来的研究表明circRNA具有较高的丰富性，富含microRNA(miRNA)的结合位点，在细胞中起到miRNA海绵作用，可以通过吸附miRNA，竞争性抑制miRNA与靶基因结合的能力。
卵泡发育与蛋鸭的产蛋性能密切相关，直接影响蛋鸭的产蛋量。已有研究表明，禽类卵泡发育是极为复杂的生物学过程，目前人们已对家禽的卵泡发育模式有了一定的了解，但是作为决定产蛋量的重要因素，卵泡发育的具体调控机理仍需深入研究。颗粒细胞的生长状况直接影响到卵泡的发育情况，卵泡颗粒细胞可以分泌性腺激素及生长因子调控卵泡膜细胞和卵母细胞的生长、分化和成熟，同时也精确的调控卵泡的生长发育。因此，保障良好的卵泡发育、掌握卵泡发育的调控规律有助于进一步提高蛋鸭的繁殖力，对于提高蛋鸭生产性能具有重要意义。然而目前关于蛋鸭组织特异性环状RNA的研究尤其是蛋鸭卵泡环状RNA及其调控机制的研究尚未见报道。因此，迫切需要提高蛋鸭卵泡环状RNA研究水平和完整性，从而为蛋鸭基因组及其非编码RNA的研究提供科学的理论依据，以便更为深入了解蛋鸭卵泡发育的调控机制，为提高蛋鸭的繁殖性能提供理论支撑。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术之缺陷，提供了蛋鸭环状RNA circ_13034及其检测试剂、方法与应用。
为实现上述目的，本发明是这样实现的：
在本发明的第一方面，提供了一种蛋鸭环状RNA circ_13034，所述蛋鸭环状RNA circ_13034对应的cDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明的蛋鸭环状RNA circ_13034是申请人基于前期完成的蛋鸭卵泡组织全转录组测序结果，通过对不同发育时期两组卵泡组织样品的测序结果进行大量生物信息学分析筛选获得的一个新的环状RNA分子。申请人将其命名为蛋鸭环状RNA circ_13034，所述蛋鸭环状RNA circ_13034对应的cDNA序列的长度为1068bp。
在本发明的第二方面，提供了所述的蛋鸭环状RNA circ_13034作为分子标志物在用于鉴别蛋鸭卵泡发育情况中的应用。
经过研究，申请人发现，本发明的蛋鸭环状RNA circ_13034分子在蛋鸭白卵泡中的表达量显著高于蛋鸭黄卵泡中的表达量，由此本发明的蛋鸭环状RNA circ_13034可作为分子标志物用于鉴别蛋鸭卵泡的发育情况。并且，该环状RNA具有闭合的环状结构，不容易受核酸外切酶攻击，在生物体内非常稳定，是理想的分子标志物。
在本发明的第三方面，提供了所述的蛋鸭环状RNA circ_13034作为分子标志物在用于检测蛋鸭卵泡颗粒细胞中细胞增殖分化状况中的应用。
经过研究，申请人发现，本发明的蛋鸭环状RNA circ_13034分子组成的过表达载体转染进入蛋鸭卵泡颗粒细胞中，与空载体组相比，过表达蛋鸭环状RNA circ_13034基因后，细胞增殖标记基因CyclinD1的表达量极显著增加(P<0.01)，细胞凋亡标志基因BCL2的表达量极显著降低(P<0.01)，从而可以得出该环状RNA可作为分子标志物应用于检测蛋鸭卵泡颗粒细胞中细胞增殖分化状况。并且，该环状RNA具有闭合的环状结构，不容易受核酸外切酶攻击，在生物体内非常稳定，是理想的分子标志物。
在本发明的第四方面，提供了蛋鸭环状RNA circ_13034基因的荧光定量PCR检测引物对，包括：
上游引物RNA circ_13034-F，如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；
下游引物RNA circ_13034-R，如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。
在本发明的第五方面，提供了蛋鸭环状RNA circ_13034基因的荧光定量PCR检测试剂盒，包括所述的荧光定量PCR检测引物对。
作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述试剂盒还包括RNA提取试剂、逆转录反应体系和荧光定量PCR反应体系，其中所述荧光定量PCR反应体系包括THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix、ddH2O、所述逆转录反应体系逆转录得到的cDNA以及所述的检测引物对。
作为以上具体实施方式，所述荧光定量PCR反应体系如下：THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix 10μL,10uM蛋鸭环状RNA circ_13034上游引物0.4μL，10uM蛋鸭环状RNA circ_13034下游引物0.4μL，待检测cDNA模板2.0μL，ddH2O 7.2μL，总体积20μL。
在本发明的第六方面，提供了所述试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
步骤1、提取待检测样品中的RNA，首先进行环状RNA的酶切(RNase R)，然后进行逆转录得到cDNA；
步骤2、利用权利要求4中所述的引物对，对待检测样品cDNA进行荧光定量PCR扩增，采用2-ΔΔCT方法计算并获得不同来源卵泡样本中环状RNA circ_13034基因的相对表达量；
步骤3、根据PCR扩增产物及基因相对表达量判断待检测样本是否存在蛋鸭环状RNA circ_13034基因及其表达情况。
作为以上具体实施方式，所述步骤2中的荧光定量PCR反应条件为，98℃，10s；94℃，15s，54℃，15s，60℃，15s，40个循环；95℃，10s；65℃，60s，97℃，1s，1个循环。
在本发明的第七方面，提供了蛋鸭环状RNA circ_13034基因过表达载体，所述载体包括所述蛋鸭环状RNA circ_13034对应的cDNA序列。
本发明具有的有益效果是：
1、本发明提供的一种蛋鸭环状RNA circ_13034的荧光定量PCR检测引物对及检测试剂盒，根据蛋鸭环状RNA circ_13034基因序列，设计特异性环状引物，利用荧光定量PCR检测该环状RNA的表达，然后根据PCR扩增产物及基因相对表达量判断待检测样本是否存在蛋鸭环状RNA circ_13034基因及其表达情况。
2、本发明提供一种蛋鸭环状RNA circ_13034，(1)该环状RNA作为分子标志物在用于鉴别蛋鸭卵泡发育情况上的应用：本发明利用荧光定量PCR检测引物对及检测试剂盒，可以准确检测不同发育阶段卵泡组织中环状RNA circ_13034的不同表达情况，从而分析首次发现蛋鸭环状RNA circ_13034基因与蛋鸭卵泡发育相关，弥补了本领域现有的空缺，为解析蛋鸭卵泡发育的遗传机理提供理论基础和科学依据，对于研究蛋鸭繁殖性状的遗传本质及提高蛋鸭繁殖力具有重要的意义。(2)该环状RNA作为分子标志物在检测蛋鸭卵泡颗粒细胞中细胞增殖分化状况中的应用：本发明中用蛋鸭环状RNA circ_13034基因过表达载体可以稳定表达蛋鸭环状RNA circ_13034基因，检测指标反映蛋鸭环状RNA circ_13034基因的表达量，与空载体组相比，过表达蛋鸭环状RNA circ_13034基因后，细胞增殖标记基因CyclinD1的表达量极显著增加(P<0.01)，细胞凋亡标志基因BCL2的表达量极显著降低(P<0.01)，从而可以得出该环状RNA可作为分子标志物应用于检测蛋鸭卵泡颗粒细胞中细胞增殖分化状况。
3、本发明提供的蛋鸭环状RNA circ_13034基因过表达载体，含有环状RNA circ_13034基因的全长序列片段，该载体可以稳定表达蛋鸭的环状RNA circ_13034，可以通过荧光定量检测反映蛋鸭环状RNA circ_13034基因的表达量，可以应用于相关技术领域；本发明提供的上述蛋鸭环状RNA circ_13034基因过表达载体的构建方法操作简单、快速易得，可以通过筛选准确得到带有目的基因的重组载体，制备得到的重组载体可以稳定表达目的基因。
附图说明
图1为实施例1中的蛋鸭环状RNA circ_13034基因全长片段PCR电泳结果图；附图标记说明，图中泳道M为DL2000DNAmarker，泳道1、2为环状RNA circ_13034基因扩增片段；
图2为本发明实施例2提供的蛋鸭环状RNA circ_13034基因的荧光定量PCR检测引物对及其检测试剂盒中蛋鸭环状RNA circ_13034基因的相对定量表达结果；
图3为实施例3中提供的蛋鸭环状RNA circ_13034基因过表达载体中的pLCDH-ciR载体的结构示意图；
图4为实施例3提供的蛋鸭环状RNA circ_13034基因过表达载体的菌落PCR电泳结果图；附图标记说明，图中泳道M为DL2000DNA marker，泳道1、2为环状RNA circ_013034过表达载体菌液扩增片段；
图5为实施例4中过表达蛋鸭环状RNA circ_13034后，过表达载体组与空载体组中环状RNA circ_13034基因表达变化情况；
图6为实施例4中过表达蛋鸭环状RNA circ_13034后，过表达载体组与空载体组中细胞增殖与凋亡关键基因表达变化情况。
具体实施方式
实施例1蛋鸭环状RNA circ_13034基因
一、蛋鸭环状RNA circ_13034
本实施例所述蛋鸭环状RNA circ_13034对应的cDNA序列如SEQ ID NO:1所示，本发明的蛋鸭环状RNA circ_13034是申请人基于前期完成的蛋鸭卵泡组织全转录组测序结果，通过对不同发育时期两组卵泡组织样品的测序结果进行大量生物信息学分析筛选获得的一个新的环状RNA分子。申请人将其命名为蛋鸭环状RNA circ_13034，所述蛋鸭环状RNA circ_13034对应的cDNA序列的长度为1068bp。
二、蛋鸭环状RNA circ_13034基因全长序列片段的制备
1、引物设计与合成
根据全转录组测序结果中环状RNA circ_13034基因序列的全长片段，采用Premier Premier 5.0软件设计引物，环状RNA circ_13034基因扩增引物序列如下：
circ_13034-F:CACTAAAATAAAATCTGTTCAATTAACGAATTCGGAATATTCTATCACTCTGATGGTAA(SEQ ID NO：4)；
circ_13034-R:GGCGTTATCATCCCAAATTAGTGGATCCTCAAAAAGGAAAATAAGCACCA(SEQ ID NO：5)；
上述引物由北京奥科生物技术有限公司合成。目标片段DNA大小为1068bp。
2、样本采集
采集产蛋高峰期蛋鸭白卵泡和黄卵泡样品各3份，PBS清洗干净后用针头刺破卵泡挤出卵泡液，放入无酶的1.5mL EP管中，做好标记后投入液氮或-80℃冰箱保存。
3、样品总RNA提取
利用传统的TRIzol、氯仿法提取卵泡组织总RNA，具体步骤如下：
1)液氮研磨，取50-100mg组织样品放于研钵中，倒入液氮少许，迅速研磨，待液氮挥发干净再加入少量液氮，直至组织样品研为粉末，将组织样品转入1.5mL离心管中，加入1mLTrizol，试温放置5min，使其充分裂解；
2)4℃12000g离心10min，将上清转入干净的无RNAase的1.5mL离心管中；
3)按照每1ml匀浆液加0.2ml氯仿，剧烈15s，室温放置15min；
4)4℃12000g离心10min；
5)小心吸出上层无色溶液于另一个1.5ml无RNAase的离心管中，加入0.5倍的异丙醇混匀，试温静置5-10min；
6)4℃12000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底；
7)加入1mL75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀；
8)4℃8000g离心5min，弃上清；
9)加入1mL无水乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀；
10)4℃8000g离心5min，弃上清，室温晾干；
11)使用30-50μL无RNAase去离子水溶解RNA，-80℃保存备用。
4、RNA样品质量检测分析
使用NanoDrop 1000微量分光光度计检测RNA样品浓度与OD值，利用1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。
5、环状RNA的酶切(RNase R)
将总RNA(5μg)加入PCR管(灭菌)中，按照3U/ug向其中管中加入RNase R。放到PCR仪中37℃加热30min，随后进行反转录。
6、反转录
采用Takara公司的反转录试剂盒RT reagent Kit with gDNA Eraser的说明书步骤进行反转录获得cDNA模板。
1)基因组DNA的除去反应
表1
反应条件如下：
42℃2min；
4℃保存。
2)反转录反应
反应液配制过程在冰上进行。
表2
反应条件如下：
37℃ 15min
85℃ 5sec
4℃保存
7、蛋鸭环状RNA circ_13034的获得与验证
进行Tounchdown PCR，PCR扩增反应体系如下(总体积50μL)：
表3
反应程序为：94℃预变性2min，首先循环内98℃变性10s，从65℃每个循环降0.5℃退火30s，68℃延伸1min，30个循环；再98℃变性10s，50℃退火30s，68℃延伸1min，进行30个循环；最后68℃延伸7min，4℃保存。
PCR反应结束后取5μL PCR产物进行琼脂糖电泳分析，结果如图1所示，图1中M表示DL2000DNA marker，图1中1、2表示目的片段环状RNA circ_13034基因的全长序列片段。将获得的目的片段环状RNA circ_13034PCR产物直接送测序，测序结果与预期的完全一致。由此可以看出，本实验成功PCR扩增得到带有EcoRI和BamHI限制性内切酶酶切位点的蛋鸭环状RNA circ_13034基因的全长序列片段。
实施例2蛋鸭环状RNA circ_13034基因的荧光定量PCR检测引物对及其检测试剂盒与方法
本实施例设计荧光定量PCR检测引物对并识别鉴定实施例1所述蛋鸭环状RNA circ_13034在蛋鸭卵泡颗粒细胞中的客观存在。本实施例识别鉴定的方法包括以下步骤：
1、样本采集
同实施例1中方法。
2、样品总RNA提取
同实施例1中RNA提取方法。
3、RNA样品质量检测分析
同实施例1中方法。
4、环状RNA的酶切(RNase R)
同实施例1中方法。
5、反转录
同实施例1中方法。
6、荧光定量PCR反应
环状RNA circ_13034基因荧光定量检测引物核苷酸序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。
利用Takara公司的Real time试剂盒THUNDERBIRD SYBR qPCRMix说明书步骤进行荧光定量PCR，反应体系如下(20μL)：
表4
利用Roche96SW 1.1三步法进行荧光定量PCR，扩增条件为：98℃，10s；94℃，15s，54℃，15s，60℃，15s，40个循环；95℃10s，65℃60s，97℃1s，1个循环。
反应结束后导出数据，结果利用2-ΔΔCT方法进行分析。利用Graphad Prism软件对分析结果进行作图。
白卵泡和黄卵泡组织中环状RNA circ_13034基因表达结果见图2，结果显示，第一，白卵泡中以及黄卵泡中均有环状RNA circ_13034基因的表达，所述蛋鸭环状RNA circ_13034在蛋鸭卵泡颗粒细胞中的客观存在。第二，白卵泡中环状RNA circ_13034基因的表达量极显著高于黄卵泡中(P<0.01)。因此，可以看出，环状RNA circ_13034基因与卵泡的发育具有重要的相关性。
实施例3蛋鸭环状RNA circ_13034基因过表达载体构建
本实施例提供蛋鸭环状RNA circ_13034基因过表达载体，所述载体包括所述蛋鸭环状RNA circ_13034对应的cDNA序列。载体构建具体包括如下步骤：
(1)pLCDH-ciR载体的双酶切处理
pLCDH-ciR载体的结构示意图如图3所示，载体含有限制性内切酶EcoRI和BamHI酶切位点。用两种酶切酶EcoRI和BamHI对上述载体进行双酶切，酶切反应体系如下，体系总体积为50μL：
表5
反应条件为：37℃酶切6h，随后对酶切产物进行纯化回收。
(2)蛋鸭环状RNA circ_13034基因全长片段的双酶切
对验证正确的PCR产物进行纯化，用两种内切酶EcoRI和BamHI对回收的上述PCR产物进行双酶切，酶切反应体系如下，体系的总体积为50μL：
表6
反应条件为：37℃酶切6h，随后对酶切产物进行纯化回收。
(3)蛋鸭环状RNA circ_13034基因过表达载体的构建
将PCR扩增并双酶切后的环状RNA circ_13034基因片段与同样经过双酶切后的载体进行连接，连接反应体系如下(总体积10μL)：
表7
反应条件为：16℃过夜连接。
将连接产物转化入感受态细胞，对阳性克隆进行菌落PCR鉴定，结果如图4所示，图中M表示DL2000DNA marker，图中1-2表示单菌落的菌落PCR结果；进一步地，对重组载体蛋鸭环状RNA circ_13034基因过表达载体进行测序验证，测序结果如SEQ ID NO：1所示；菌落PCR和测序结果均正确的个体即为成功构建的重组载体，命名为circ_13034-pLCDH-ciR。
实施例4环状RNA circ_13034基因过表达结果检测与分析
一、蛋鸭卵泡颗粒细胞分离
蛋鸭卵泡颗粒细胞的分离采用如下步骤：
1、选择产蛋高峰期的产蛋鸭，颈静脉放血处死；取出整个卵巢组织，置于装有预冷PBS的无菌培养皿中；
2、用加有双抗的PBS缓冲液冲洗血污，漂洗3次；
3、将漂洗干净的卵泡移入装有预冷PBS缓冲液的平皿中，剥净卵泡外膜、结缔组织及血管网；
4、用手术刀在卵泡表面划一道1-2cm长的切口(动作要快)，释放卵黄，用PBS缓冲液将剩余的卵黄液漂洗干净，剩下的卵泡膜即为：基膜和卵泡颗粒细胞层；
5、将漂洗干净的卵泡膜尽量剪碎，置于15mL离心管中，加4mL培养基，用1mL移液枪反复吹打1min，4℃1000rpm离心后弃上清；
6、向沉淀中加入4mL 0.2％Ⅱ型胶原酶，重悬沉淀，置于37℃恒温摇床80rpm消化30min；
7、消化结束，加入4mL M199完全培养基(含10％血清)终止消化；用200目不锈钢筛过滤，并用2mL M199完全培养基清洗网筛，收集滤液，4℃1000rpm离心10min；
8、弃上清，加入10mL M199完全培养基，4℃1000rpm离心10min；
9、弃上清，加入M199完全培养基(含10％FBS及1％双抗)重悬后，测定细胞密度，调整悬浮液细胞密度为1×106个/mL，接种于6孔培养皿，置于37℃、5％CO2培养箱内静置培养；
10、颗粒细胞培养24小时后，换新鲜含有胎牛血清的M199培养基，贴壁细胞可用于进一步研究中。
二、细胞转染
1、分别取125μL Opti-MEM培养基稀释实施例3所得的环状RNA circ_13034基因过表达载体circ_13034-pLCDH-ciR和空载体pLCDH-ciR，并向其中加入5μL P3000；
2、取250μL Opti-MEM培养基稀释3000试剂，充分混匀；
3、分别向(1)中两管混合物中加入125μL(2)中的混合物，室温孵育5min；
4、将250μL混合物转入细胞。
各实验组设置3个重复孔，转染细胞分组如下：①转染pLCDH-ciR(空载体组)，②转染circ_13034-pLCDH-ciR(环状RNA circ_13034基因过表达载体组)。各转染组转染细胞24h后，利用Trizol消化细胞，提取细胞总RNA后用于过表达后荧光定量分析。
三、荧光定量分析
1、细胞中总RNA的提取
参照实施例1中总RNA的提取方法提取细胞中总RNA。
2、环状RNA的酶切(RNase R)
同实施例1中环状RNA酶切方法。
3、反转录
同实施例1中反转录的方法。
4、荧光定量PCR反应
(1)荧光定量PCR反应条件和方法同实施例1，其中环状RNA circ_13034基因荧光定量引物核苷酸序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示，扩增条件为：98℃，10s；94℃，15s，54℃，15s，60℃，15s，40个循环；95℃10s，65℃60s，97℃1s，1个循环；
(2)细胞增殖标志基因cyclinD1荧光定量引物核苷酸序列如SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示，扩增条件为：98℃，10s；94℃，15s，56℃，15s，60℃，15s，40个循环；95℃10s，65℃60s，97℃1s，1个循环；
(3)细胞凋亡标志基因BCL2荧光定量引物核苷酸序列如SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示，扩增条件为：98℃，10s；94℃，15s，54℃，15s，60℃，15s，40个循环；95℃10s，65℃60s，97℃1s，1个循环。
4、结果分析
反应结束后导出数据，结果利用2-ΔΔCT方法进行分析。利用Graphad Prism软件对分析结果进行作图。转染蛋鸭环状RNA circ_13034过表达载体后环状RNA circ_13034基因的表达量及细胞增殖、凋亡标志基因的表达量分析结果见图5-6。
由图5可以看出，过表达蛋鸭环状RNA circ_13034基因后，与空载体组相比，过表达蛋鸭环状RNA circ_13034基因后环状RNA circ_13034的表达量极显著高于空载体组(P<0.01)；由此可知，本发明中的蛋鸭环状RNA circ_13034基因过表达载体可以稳定表达蛋鸭环状RNA circ_13034基因。
由图6可以看出，过表达蛋鸭环状RNA circ_13034基因后，与空载体组相比，过表达蛋鸭环状RNA circ_13034基因后，细胞增殖标记基因CyclinD1的表达量极显著增加(P<0.01)，细胞凋亡标志基因BCL2的表达量极显著降低(P<0.01)。从而可以得出该环状RNA可作为分子标志物应用于检测蛋鸭卵泡颗粒细胞中细胞增殖分化状况。并且，该环状RNA具有闭合的环状结构，不容易受核酸外切酶攻击，在生物体内非常稳定，是理想的分子标志物。
综上所述，本发明中的蛋鸭环状RNA circ_13034基因过表达载体可以稳定表达蛋鸭环状RNA circ_13034基因，可以作为检测指标反映蛋鸭环状RNA circ_13034基因的表达量，可以应用于检测蛋鸭卵泡颗粒细胞中细胞增殖分化状况。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所
<120> 蛋鸭环状RNA circ_13034及其检测试剂、方法与应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1068
<212> DNA
<213> cDNA(Artificial Sequence)
<400> 1
ggaatattct atcactctga tggtaacaga ccaggcagca gaaccactca ctggaatatg 60
tcagataaat gttatcattc tggatcaaaa tgacaatgat ctcaggtttg aaaacaacca 120
ctataaatgt aattgagagt cattggatag aatttcagtg ccttgagtgt gagcttaact 180
gatgtctaaa attattggat ttttgtcttt catagcagta aattctgtga ctaattgagt 240
gattgaagcc agaggtgcac ttatcttagt taattgcaga attgtatgta taatattcat 300
taaaaacctg gtatttctca gttagttata atatacaaat ccaagaaagt agttcctgat 360
tttgtgcaat aagctaaaat tccatttgct tatatttcat acaaagcaat tagtccttta 420
gtttaaaaaa aaaaaaaaaa aagcaaaacc agaaaactgg aaaaagtaat agactgaata 480
agaattccag tttatgaatg tgataataca aagttaaatg tgatccatag ctcagatatt 540
ctagagcctc aaaaataatc aagtctgtgc tacacttacc aaaattgacg tattctgtgt 600
agtattctcc ggaataacaa cttcatagct gtccctttcc cactgtggag gttggctttt 660
tgcactggta atagtaacag ctcttgaaac aactggtaat cataacagct cttgaaaaca 720
tcgtttgatt ttatgggcat tgttccaagg ggtaaaaagt ggtatcttcc atacattttt 780
actttagtat ttcttcatat ttcttagtaa gatgttcatg gtactttagt gaattaatga 840
tcagcttgaa ataaccttcc cttacgttag atttcctaag ggaagacaca atagttggga 900
ccagctttct tcgtgttgca gcccctgatg atgactacgg ctcaaatgct gtcattacat 960
actccatagc gaatgaagaa ccagattatt tacagattaa ccctactaca tgctggatgt 1020
ttgtcaacca acccatatct caggtatggt gcttattttc ctttttga 1068
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgtttgtcaa ccaacccat 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctgctgcctg gtctgttac 19
<210> 4
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cactaaaata aaatctgttc aattaacgaa ttcggaatat tctatcactc tgatggtaa 59
<210> 5
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggcgttatca tcccaaatta gtggatcctc aaaaaggaaa ataagcacca 50
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cttggatgct ggaggttt 18
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggcttttctt gaggggtt 18
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
acggctctcg ctcctgct 18
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cggttgacgc tctccacg 18