技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，涉及一种凝结芽孢杆菌和酿酒酵母混菌固态发酵的方法。
背景技术
酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae）是我国农业部2003年318号公告中允许使用的微生物菌种之一，是一类单细胞真核微生物，以活菌形式通过消化道发挥作用，可显著提高动物肠道的淀粉酶、脂肪酶和胃蛋白酶的活，从而提高动物的消化能力，提高饲料报酬，具有较强的免疫调节功能、降低胆固醇以及抗氧化作用，酵母菌可以耐受一定剂量的抗生素，能逐渐帮助动物从抗生素到无抗生素的饲料过渡。
凝结芽孢杆菌（bacillus coagulans），我国农业部2013年12月公布的新版《饲料添加剂品种目录（2013）》将其正式列入，使用于猪、鸡、水产动物，除了具有耐高酸、耐高热、耐高渗透压、易保存等芽孢杆菌属的特点，还产生乳酸，具有乳酸菌和芽孢杆菌的双重优良特性，耐储存、不易失活，可促进动物生长，改善动物产品质量，在调节肠道菌群平衡、刺激免疫等方面效果显著，是替代抗生素的优势菌种之一。
目前，已有报道凝结芽孢杆菌的混菌固态发酵方法，混合的菌种以植物乳杆菌、干酪乳杆菌和枯草芽孢杆菌为主，且多数为多菌种分步发酵。凝结芽孢杆菌和酿酒酵母混菌固态发酵方法却少有报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种凝结芽孢杆菌和酿酒酵母混菌固态发酵的方法，在混菌固态发酵中，两株菌互利共生，混合发酵的菌数、酶活力、产酸及底物利用率方面显著高于单株菌的固态发酵，具有设备投资少、节能、工艺简化、操作简便的优点。
本发明的技术解决方案是：
一种凝结芽孢杆菌和酿酒酵母混菌固态发酵的方法，其具体步骤是：
（1）凝结芽孢杆菌菌种的培养
挑取凝结芽孢杆菌斜面种子一环于种子液体培养基中进行培养，培养温度35℃-40℃，转速160-200rpm，培养时间18-24h；
（2）酿酒酵母的培养
挑取凝结芽孢杆菌斜面种子一环于种子液体培养基中进行培养，培养温度30℃-35℃，转速160 rpm -200rpm，培养时间16h-24h；
（3）制作固体发酵培养基
固态发酵培养基重量比例组成为：玉米面：麸皮：豆饼粉：稻壳=10:(6-10): (2-4):(3-4)，水分控制在40%-65%，pH 6.8-7.2；
（4）固体发酵培养
灭菌后的固体发酵培养基，按固体发酵培养基重量的5%-10%接种凝结芽孢杆菌种子液，按固体发酵培养基重量的3%-5%接种酿酒酵母种子液，将接菌后的物料置于不透气材料制成的锥形瓶状的半封闭装置中，培养温度35-37℃，培养时间44-48h。发酵结束，55℃烘干，粉碎，过筛，得到含凝结芽孢杆菌和酿酒酵母的复合菌剂。
进一步的，所述凝结芽孢杆菌和酿酒酵母的种子的培养基，g/L：葡萄糖20-50，蛋白胨10-50，酵母膏10-50,pH 6.8-7.2。
进一步的，固体发酵培养时，培养装置盛装培养基的重量与培养装置的体积比为1:5 g/mL -1:30 g/mL。
进一步的，所述的凝结芽孢杆菌为市购凝结芽孢杆菌LCCC10025，酿酒酵母为市购酿酒酵母LCCC20003，凝结芽孢杆菌LCCC10025保藏于辽宁省微生物菌种保藏中心，编号为LCCC10025，酿酒酵母LCCC20003保藏于辽宁省微生物菌种保藏中心，编号为LCCC20003。
进一步的，含凝结芽孢杆菌和酿酒酵母的复合菌剂中凝结芽孢杆菌芽孢数≥2.0×109CFU/g，酵母菌数≥1.4×109CFU/g。
本发明的有益效果：
1.混合发酵中两株菌互利共生，酿酒酵母能为凝结芽孢杆菌的生长提供厌氧环境，凝结芽孢杆菌为酿酒酵母的生长提供营养物质，混菌培养方法可以得到较高的凝结芽孢杆菌和酿酒酵母的活菌数。该发酵方法得到的复合菌剂中凝结芽孢杆菌芽孢数≥2.0×109CFU/g，酵母菌数≥1.4×109CFU/g。
2、半封闭培养方式同时满足了凝结芽孢杆菌和酿酒酵母对氧气的需求量。本方法在固体培养基中引入稻壳成分，用以调节菌种生长所需的通气量。
3、凝结芽孢杆菌和酿酒酵母混合发酵，生长过程中分泌较高的蛋白酶和淀粉酶，通过这种方法制备的复合菌剂可显著提高动物的消化能力和饲料报酬；生产的复合菌剂既有酵母的酯香味，又有凝结芽孢杆菌的酸味，适口性好。
4、采用一步法固态混合发酵凝结芽孢杆菌和酿酒酵母，具有设备简单、投资少、工艺流程操作简便、能耗低的优势。
具体实施方式
下面结合实例，对本发明进一步说明，下述实例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实例来限定本发明的保护范围。
1、菌种的种子液制备
所述凝结芽孢杆菌和酿酒酵母的种子的培养基（g/L）：葡萄糖20-50，蛋白胨10-50，酵母膏10-50,pH 6.8-7.2；
菌种选择：凝结芽孢杆菌LCCC10025和酿酒酵母LCCC20003；市购，凝结芽孢杆菌LCCC10025在辽宁省微生物菌种保藏中心，保藏编号为LCCC10025，酿酒酵母LCCC20003在辽宁省微生物菌种保藏中心，保藏编号为LCCC20003；
所述菌种的培养条件为：
凝结芽孢杆菌：培养温度35-40℃，转速160-200rpm，培养时间18-24h；
酿酒酵母：培养温度30-35℃，转速160-200rpm，培养时间16-24h；
2、混菌固态发酵
所述固态发酵培养基比例（重量）组成为：玉米面：麸皮：豆饼粉：稻壳=10:(6-10): (2-4):(3-4)，水分控制在40%-60%，pH 6.8-7.2。
所述固态发酵培养方法为：灭菌后的培养基按其重量的5%-10%接种凝结芽孢杆菌种子液，按其重量的3%-5%接种酿酒酵母种子液，将接菌后的物料置于不透气材料制成的锥形瓶状的半封闭装置中，培养温度35℃-37℃，培养时间44h-48h。发酵结束，55℃烘干，粉碎，过筛，得到含凝结芽孢杆菌和酿酒酵母的复合菌剂。
本发明实施例活菌数的测定方法
采用稀释平板涂布计数法，操作步骤为：称取制备好的复合菌剂10g，置于90ml的无菌生理盐水三角瓶中，于磁力搅拌器上搅拌20min,用移液枪取1ml的菌液加入到9ml无菌生理盐水的试管中，依次做十倍梯度稀释。取合适梯度的稀释液0.1ml于已凝固的培养基中，涂布均匀，做三个平行样，置于37℃培养箱中培养48h。
实施例1
（1）凝结芽孢杆菌和酿酒酵母的种子的培养基（g/L）：葡萄糖25，蛋白胨15，酵母膏10,pH 7；
菌种选择：凝结芽孢杆菌LCCC10025和酿酒酵母LCCC20003；
凝结芽孢杆菌和酿酒酵母的种子培养条件：
凝结芽孢杆菌：培养温度38℃，转速180rpm,培养时间20h；
酿酒酵母：培养温度32℃，转速180rpm，培养时间20h；
（2）固态发酵培养基比例（重量）组成为：玉米面：麸皮：豆饼粉：稻壳=10:10:4:4，水分60%，pH 7；
固态发酵培养：
灭菌后的培养基按培养基重量的5%接种凝结芽孢杆菌种子液，按培养基重量的5%接种酿酒酵母种子液，将接菌后的物料置于不透气材料制成的锥形瓶状的半封闭装置中，培养基的重量和培养装置的体积比例为1:15（g/mL），培养温度35℃，培养时间44h；发酵结束，55℃烘干，粉碎，过筛，得到含凝结芽孢杆菌和酿酒酵母的复合菌剂。凝结芽孢杆菌芽孢数3.5×109CFU/g，酵母菌数6.2×109CFU/g。
实施例2
（1）凝结芽孢杆菌和酿酒酵母的种子的培养基（g/L）：葡萄糖20，蛋白胨10，酵母膏12,pH 6.8；
菌种选择：凝结芽孢杆菌LCCC10025和酿酒酵母LCCC20003；
凝结芽孢杆菌和酿酒酵母的种子培养条件：
凝结芽孢杆菌：培养温度35-40℃，转速160-200rpm,培养时间18-24h；
酿酒酵母：培养温度30℃，转速160rpm，培养时间16h；
（2）固态发酵培养基比例（重量）组成为：玉米面：麸皮：豆饼粉：稻壳=10:10:4:4，水分60%，pH 7。
固态发酵培养：
灭菌后的培养基按其重量的7%接种凝结芽孢杆菌种子液，按其重量的3%接种酿酒酵母种子液，将接菌后的物料置于不透气材料制成的锥形瓶状的半封闭装置中，所装的培养基的重量和培养装置的体积比例为1:15（g/mL），培养温度35℃，培养时间44h；发酵结束，55℃烘干，粉碎，过筛，得到含凝结芽孢杆菌和酿酒酵母的复合菌剂。凝结芽孢杆菌芽孢数9.5×109CFU/g，酵母菌数1.4×109CFU/g。
实施例3
（1）凝结芽孢杆菌和酿酒酵母的种子的培养基（g/L）：葡萄糖50，蛋白胨50，酵母膏50,pH 7；
菌种选择：凝结芽孢杆菌LCCC10025和酿酒酵母LCCC20003；
凝结芽孢杆菌和酿酒酵母的种子培养条件：
凝结芽孢杆菌：培养温度35℃，转速200rpm,培养时间18h；
酿酒酵母：培养温度35℃，转速200rpm,培养时间24h；
（2）固态发酵培养基比例（重量）组成为：玉米面：麸皮：豆饼粉：稻壳=10:10:4:4，水分60%，pH 7.2。
固态发酵培养：
灭菌后的培养基按其重量的6%接种凝结芽孢杆菌种子液，按其重量的4%接种酿酒酵母种子液，将接菌后的物料置于不透气材料制成的锥形瓶状的半封闭装置中，所装的培养基的重量和培养装置的体积比例为1:15（g/mL），培养温度35℃，培养时间44h。发酵结束，55℃烘干，粉碎，过筛，得到含凝结芽孢杆菌和酿酒酵母的复合菌剂。凝结芽孢杆菌芽孢数6.5×109CFU/g，酵母菌数2.8×109CFU/g。
实施例4凝结芽孢杆菌和酿酒酵母混合固态发酵方法（培养基不同比例配方）
（1）凝结芽孢杆菌和酿酒酵母的种子的培养基（g/L）：葡萄糖25，蛋白胨15，酵母膏10,pH 7.2；
菌种选择：凝结芽孢杆菌LCCC10025和酿酒酵母LCCC20003；
凝结芽孢杆菌和酿酒酵母的种子培养条件：
凝结芽孢杆菌：培养温度38℃，转速180rpm,培养时间20h；
酿酒酵母：培养温度32℃，转速180rpm,培养时间20h；
（2）固态发酵培养基比例（重量）组成为：玉米面：麸皮：豆饼粉：稻壳=10:9:2:3，水分60%，pH 7；
固态发酵培养：灭菌后的培养基按其重量的7%接种凝结芽孢杆菌种子液，按其重量的3%接种酿酒酵母种子液，将接菌后的物料置于不透气材料制成的锥形瓶状的半封闭装置中，所装的培养基的重量和培养装置的体积比例为1:5（g/mL），培养温度35℃，培养时间44h；发酵结束，55℃烘干，粉碎，过筛，得到含凝结芽孢杆菌和酿酒酵母的复合菌剂；复合菌剂种凝结芽孢杆菌芽孢数7.5×109CFU/g，酵母菌数3.2×109CFU/g。
实施例5 凝结芽孢杆菌和酿酒酵母混合固态发酵方法（培养基不同比例配方）
（1）凝结芽孢杆菌和酿酒酵母的种子的培养基（g/L）：葡萄糖25，蛋白胨15，酵母膏10,pH 7；
菌种选择：凝结芽孢杆菌LCCC10025和酿酒酵母LCCC20003；
凝结芽孢杆菌和酿酒酵母的种子培养条件：
凝结芽孢杆菌：培养温度38℃，转速180rpm,培养时间20h；
酿酒酵母：培养温度32℃，转速180rpm,培养时间20h；
（2）固态发酵培养基比例（重量）组成为：玉米面：麸皮：豆饼粉：稻壳=10:6:3:4，水分60%，pH 6.8；
固态发酵培养：
灭菌后的培养基按其重量的6%接种凝结芽孢杆菌种子液，按其重量的4%接种酿酒酵母种子液，将接菌后的物料置于不透气材料制成的锥形瓶状的半封闭装置中，所装的培养基的重量和培养装置的体积比例为1:30（g/mL），培养温度35℃，培养时间44h；发酵结束，55℃烘干，粉碎，过筛，得到含凝结芽孢杆菌和酿酒酵母的复合菌剂；复合菌剂种凝结芽孢杆菌芽孢数12.6×109CFU/g，酵母菌数2.9×109CFU/g。
实施例6 凝结芽孢杆菌和酿酒酵母混合固态发酵方法（培养基不同比例配方）
（1）凝结芽孢杆菌和酿酒酵母的种子的培养基（g/L）：葡萄糖25，蛋白胨15，酵母膏10,pH 7；
菌种选择：凝结芽孢杆菌LCCC10025和酿酒酵母LCCC20003；
凝结芽孢杆菌和酿酒酵母的种子培养条件：
凝结芽孢杆菌：培养温度38℃，转速180rpm,培养时间20h；
酿酒酵母：培养温度32℃，转速180rpm,培养时间20h；
（2）固态发酵培养基比例（重量）组成为：玉米面：麸皮：豆饼粉：稻壳=10:10:4:4，水分50%，pH 7；
菌种选择：凝结芽孢杆菌LCCC10025和酿酒酵母LCCC20003；
固态发酵培养：
灭菌后的培养基按其重量的7%接种凝结芽孢杆菌种子液，按其重量的3%接种酿酒酵母种子液，将接菌后的物料置于不透气材料制成的锥形瓶状的半封闭装置中，所装的培养基的重量和培养装置的体积比例为1:10（g/mL），培养温度35℃，培养时间44h。发酵结束，55℃烘干，粉碎，过筛，得到含凝结芽孢杆菌和酿酒酵母的复合菌剂。复合菌剂种凝结芽孢杆菌芽孢数6.8×109CFU/g，酵母菌数4.6×109CFU/g。
实施例7 凝结芽孢杆菌和酿酒酵母混合固态发酵方法（培养基不同比例配方）
（1）凝结芽孢杆菌和酿酒酵母的种子的培养基（g/L）：葡萄糖25，蛋白胨15，酵母膏10,pH 7；
菌种选择：凝结芽孢杆菌LCCC10025和酿酒酵母LCCC20003；
凝结芽孢杆菌和酿酒酵母的种子培养条件：
凝结芽孢杆菌：培养温度38℃，转速180rpm,培养时间20h；
酿酒酵母：培养温度32℃，转速180rpm,培养时间20h；
（2）固态发酵培养基比例（重量）组成为：玉米面：麸皮：豆饼粉：稻壳=10:10:4:4，水分65%，pH 7；
固态发酵培养：
灭菌后的培养基按其重量的7%接种凝结芽孢杆菌种子液，按其重量的3%接种酿酒酵母种子液，将接菌后的物料置于不透气材料制成的锥形瓶状的半封闭装置中，所装的培养基的重量和培养装置的体积比例为1:10（g/mL），培养温度35℃，培养时间44h；发酵结束，55℃烘干，粉碎，过筛，得到含凝结芽孢杆菌和酿酒酵母的复合菌剂；复合菌剂种凝结芽孢杆菌芽孢数9.9×109CFU/g，酵母菌数3.8×109CFU/g。
对比例1单一凝结芽孢杆菌的固态培养
（1）凝结芽孢杆菌种子的培养基（g/L）：葡萄糖25，蛋白胨15，酵母膏10,pH7；
凝结芽孢杆菌和酿酒酵母的种子培养条件：凝结芽孢杆菌：培养温度38℃，转速180rpm,培养时间20h；
（2）固态发酵培养基比例组成为：玉米面：麸皮：豆饼粉：稻壳=10:10:1:1，水分50%，pH 7；
菌种选择：凝结芽孢杆菌LCCC10025；
固态发酵培养：
灭菌后的培养基按其重量的5%接种凝结芽孢杆菌种子液，将接菌后的物料置于不透气材料制成的锥形瓶状的半封闭装置中，所装的培养基的重量和培养装置的体积比例为1:15（g/mL），培养温度35℃，培养时间44h。发酵结束，55℃烘干，粉碎，过筛，得到凝结芽孢杆菌菌剂，凝结芽孢杆菌芽孢,3.1×108CFU/g。
对比例2 单一酿酒酵母的固态培养。
（1）酿酒酵母的种子的培养基（g/L）：葡萄糖25，蛋白胨15，酵母膏10,pH 7；
菌种选择：酿酒酵母LCCC20003；
酿酒酵母的种子培养条件：培养温度32℃，转速180rpm,培养时间20h；
（2）固态发酵培养基比例组成为：玉米面：麸皮：豆饼粉：稻壳=10:10:1:1，水分50%，pH 7；
固态发酵培养：
灭菌后的培养基按其重量的5%接种酿酒酵母种子液，将接菌后的物料置于不透气材料制成的锥形瓶状的半封闭装置中，所装的培养基的重量和培养装置的体积比例为1:10（g/mL），培养温度30℃，培养时间44h；发酵结束，55℃烘干，粉碎，过筛，得到酿酒酵母菌剂。酵母菌数8.7×108CFU/g。
对比例3 凝结芽孢杆菌和酿酒酵母混合固态发酵方法（培养基配方中不加稻壳）。
（1）凝结芽孢杆菌和酿酒酵母的种子的培养基（g/L）：葡萄糖25，蛋白胨15，酵母膏10,pH 7；
菌种选择：凝结芽孢杆菌LCCC10025和酿酒酵母LCCC20003；
凝结芽孢杆菌和酿酒酵母的种子培养条件：凝结芽孢杆菌：培养温度38℃，转速180rpm,培养时间20h；
酿酒酵母：培养温度32℃，转速180rpm,培养时间18h；
（2）固态发酵培养基比例（重量）组成为：玉米面：麸皮：豆饼粉=10:10:1，水分60%，pH 7。
所述固态发酵培养：
灭菌后的培养基按其重量的5%接种凝结芽孢杆菌种子液，按其重量的5%接种酿酒酵母种子液，将接菌后的物料置于不透气材料制成的锥形瓶状的半封闭装置中，所装的培养基的重量和培养装置的体积比例为1:20（g/mL），培养温度35℃，培养时间44h；发酵结束，55℃烘干，粉碎，过筛，得到含凝结芽孢杆菌和酿酒酵母的复合菌剂；凝结芽孢杆菌芽孢数7.5×108CFU/g，酵母菌数9.8×108CFU/g。
由本发明实施例1-实施例7和对比例1-对比例2可以得出，混菌培养方法可以得到较高的凝结芽孢杆菌和酿酒酵母的活菌数，该发酵方法得到的复合菌剂中凝结芽孢杆菌芽孢数≥2.0×109CFU/g，酵母菌数≥1.4×109CFU/g。混合发酵中两株菌互利共生，酿酒酵母能为凝结芽孢杆菌的生长提供厌氧环境，凝结芽孢杆菌为酿酒酵母的生长提供营养物质，因此，可以获得较高的活菌数。
由本发明实施例1-实施例7和对比例3可以得出，固体培养基中稻壳的加入，可以得到较高的凝结芽孢杆菌和酿酒酵母的活菌数，固体培养基中采用稻壳成分，能够调节凝结芽孢杆菌和酿酒酵母生长对氧气的需求量，调节菌种生长所需的通气量，满足凝结芽孢杆菌和酿酒酵母对氧气的需求量。