一种制备扇贝裙边活性肽的方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103911416 A (43)申请公布日 2014.07.09 CN 103911416 A (21)申请号 201410145196.3 (22)申请日 2014.04.11 C12P 21/06(2006.01) C07K 1/14(2006.01) (71)申请人 青岛老三东食品股份有限公司 地址 266000 山东省青岛市胶州市营海工业 园 (72)发明人 王清光 (74)专利代理机构 北京纽乐康知识产权代理事 务所 ( 普通合伙 ) 11210 代理人 王珂 (54) 发明名称 一种制备扇贝裙边活性肽的方法 (57) 摘要 本发明涉及一种制备扇贝裙边活性肽。

2、的方 法， 包括清洗匀浆、 中性蛋白酶和碱性蛋白酶复合 酶解、 高温瞬时加热灭酶、 脉冲电场纯化、 超滤、 混 合床脱盐、 色谱分离、 真空浓缩、 真空冷冻干燥和 载物、 压片步骤。本发明的有益效果为 ： 本方法通 过对海洋贝类资源废弃物下脚料扇贝裙边的综合 开发， 变废为宝， 可提高贝类产品的经济价值 ； 通 过本方法， 扇贝裙边酶解效率显著提高、 短肽获得 率能够达到 80% 以上， 操作简便， 所得产品口感得 到显著的改善， 口服时生物活性能够得以保持。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 4 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 。

3、权利要求书2页 说明书4页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103911416 A CN 103911416 A 1/2 页 2 1. 一种制备扇贝裙边活性肽的方法， 其特征在于， 包括以下步骤 ： （1） 匀浆 ： 将经验收合格的扇贝裙边清洗后打浆， 之后放入匀浆机进行匀浆 ； （2） 复合酶解 ： 先用中性蛋白酶对步骤 （1） 得到的原料进行水解， 水解完成后再调节 PH 值用碱性蛋白 酶水解 ； （3） 灭酶 ： 水解结束后， 过滤， 将滤液高温瞬时加热灭酶 ； （4） 脉冲电场纯化 ： 将步骤 （3） 得到的原料放入强脉冲电场中进行纯化 ； （5） 超滤 ： 将步骤 （4） 得到的。

4、原料进行超滤 ； （6） 混合床脱盐 ： 将步骤 （5） 得到的超滤酶解液进行混合床脱盐 ； （7） 色谱分离 ： 将步骤 （6） 得到的原料进行色谱分离纯化 ； （8） 真空浓缩 ： 将步骤 （7） 得到的色谱分离物在 8090下进行真空浓缩 ； （9） 真空冷冻干燥 ： 将步骤 （8） 得到的真空浓缩物进行真空冷冻干燥 ； （10） 载物、 压片 ： 取经纯化、 冷冻干燥后的壳聚糖和壳聚糖 / 明胶水凝胶， 与步骤 （8） 得到的真空冷冻干 燥物充分混匀， 用压片机制成成品。 2.根据权利要求1所述的一种制备扇贝裙边活性肽的方法， 其特征在于 ： 所述步骤 （1） 中的匀浆操作后匀浆液颗粒。

5、粒度小于 3um。 3.根据权利要求2所述的一种制备扇贝裙边活性肽的方法， 其特征在于 ： 所述步骤 （2） 中的中性蛋白酶为 N120P、 碱性蛋白酶为 Alcalase。 4.根据权利要求3所述的一种制备扇贝裙边活性肽的方法， 其特征在于 ： 所述步骤 （3） 中的高温瞬时加热条件为 95100， 加热时间 2 分钟。 5.根据权利要求4所述的一种制备扇贝裙边活性肽的方法， 其特征在于 ： 所述步骤 （4） 中的脉冲电场强度为 515Kv/cm， 脉冲频率为 25003500Hz， 处理时间为 200400us。 6.根据权利要求5所述的一种制备扇贝裙边活性肽的方法， 其特征在于 ： 所述。

6、步骤 （5） 中选用 MWCO 为 1KD 的超滤膜。 7.根据权利要求6所述的一种制备扇贝裙边活性肽的方法， 其特征在于 ： 所述步骤 （6） 中混合床脱盐技术条件为阴离子 ： 阳离子 =3:2， 过柱速度 ： 5 倍柱体积 / 小时， 水解液 pH 值 4.5。 8.根据权利要求7所述的一种制备扇贝裙边活性肽的方法， 其特征在于 ： 所述步骤 （7） 中色谱分离条件为 ： 色谱柱， PheedaC18 柱 ； 上样量 ： lmL ； 流速 ： 4mL/min ； 检测波长 ： 280nm 和 220nm ； 洗脱条件 ： 03min， 100%A ； 350min， 0%50%B ； 50。

7、52min， 50%100%B ； 5258 分钟， 权 利 要 求 书 CN 103911416 A 2 2/2 页 3 100%B ； 5860 分钟， 100%B100%A， 所述 A 为 5% 乙腈和 0.05% 三氟乙酸， 所述 B 为 80% 乙腈 和 0.05% 三氟乙酸。 9.根据权利要求8所述的一种制备扇贝裙边活性肽的方法， 其特征在于 ： 所述步骤 （8） 中真空浓缩温度为 80 90。 10. 根据权利要求 9 所述的一种制备扇贝裙边活性肽的方法， 其特征在于 ： 所述步骤 （9） 中真空冷冻干燥温度为 -30。 权 利 要 求 书 CN 103911416 A 3 1/。

8、4 页 4 一种制备扇贝裙边活性肽的方法 技术领域 0001 本发明涉及食品加工领域， 特别是涉及一种制备扇贝裙边活性肽的方法。 背景技术 0002 扇贝 (Scallop) 是一种海产贝类， 最传统的加工方式为干制， 俗称干贝， 富含牛磺 酸等多种氨基酸、 高度不饱和脂肪酸、 微量元素和维生素。 从古到今它都是一种深受欢迎的 营养保健品， 具有滋阴补肾调中的功效。 扇贝经干制后其余的软体部分俗称为扇贝裙边， 通 常由于扇贝裙边感官性状差， 加工利用程度较低， 一般作饲料处理甚至被废弃。 此种方式不 仅使产品综合利用率低而且严重污染环境。 0003 扇贝裙边含有丰富的蛋白质、 碳水化合物、 核。

9、黄素等多种营养成分和钙、 铁、 锌、 硒、 铜等微量元素， 其营养价值毫不逊色于扇贝柱。山东省作为海洋大省， 扇贝年产量上 百万吨， 尤其青岛扇贝向来闻名， 其加工后的废弃物扇贝裙边也有几十万吨。 如何充分合理 地利用扇贝裙边是扇贝加工业急待解决的问题。 经研究发现扇贝裙边含有大量的生理活性 物质， 具有降血脂、 抗肿瘤、 抗病毒、 抗衰老等多种生物功能。 0004 现有生产方法通常采用单一的酶来酶解蛋白， 如中性蛋白酶 Neutrase、 碱性蛋白 酶Alcalase2.4L、 复合蛋白酶Promatex、 风味蛋白酶Flavourzyme、 木瓜蛋白酶Papain或胰 蛋白酶 TryPsi。

10、n ， 因单酶作用位点有限， 故大大降低了酶解效率和短肽得率。 0005 蛋白酶解过程中， 为了使蛋白酶处于最适 pH 范围内， 尽量维持其水解速度， 必须 不断加入一些碱或酸来调节水解体系的 pH 值， 因此最后得到的蛋白水解物中含有一定量 的盐分， 这部分盐分可能会影响到产品的纯度和适用范围并对其功能活性带来负面影响， 进而限制其在食品领域的应用， 因此需要对短肽进行脱盐处理。传统的脱盐方法包括离子 交换树脂脱盐法和大孔树脂法。离子交换树脂脱法要分别通过阴阳离子交换树脂， 使得脱 盐过程较为繁琐， 且肽回收率较低。大孔树脂法则要经过吸附和洗脱过程， 不仅操作繁琐， 肽得率较低， 而且洗脱时。

11、要使用有机溶剂， 使得该法不易产业化操作。 0006 国内肽类产品大多纯度有限， 且由于其特殊的理化性质， 最容易在人体胃肠体系 降解， 因胃酸的 pH 值为 1 3， 肽类在这种环境中的生物活性几乎完全丧失。同时， 由于胃 肠道中酶的降解作用， 绝大多数的功能性肽类在胃肠道中被降解为由氨基酸或由 2 6 个 氨基酸组成的小分子肽， 故其口服活性无法在药物及食品体系保持。 发明内容 0007 本发明的目的是提供一种制备扇贝裙边活性肽的方法， 以克服目前现有技术存在 的上述不足。 0008 本发明的目的是通过以下技术方案来实现 ： 一种制备扇贝裙边活性肽的方法， 包括以下步骤 ： （1） 匀浆 。

12、： 将经验收合格的扇贝裙边清洗后打浆， 之后放入匀浆机进行匀浆 ； 说 明 书 CN 103911416 A 4 2/4 页 5 （2） 复合酶解 ： 先用中性蛋白酶对步骤 （1） 得到的原料进行水解， 水解完成后再调节 PH 值用碱性蛋白 酶水解 ； （3） 灭酶 ： 水解结束后， 过滤， 将滤液高温瞬时加热灭酶 ； （4） 脉冲电场纯化 ： 将步骤 （3） 得到的原料放入强脉冲电场中进行纯化 ； （5） 超滤 ： 将步骤 （4） 得到的原料进行超滤 ； （6） 混合床脱盐 ： 将步骤 （5） 得到的超滤酶解液进行混合床脱盐 ； （7） 色谱分离 ： 将步骤 （6） 得到的原料进行色谱分离纯。

13、化 ； （8） 真空浓缩 ： 将步骤 （7） 得到的色谱分离物在 8090下进行真空浓缩 ； （9） 真空冷冻干燥 ： 将步骤 （8） 得到的真空浓缩物进行真空冷冻干燥 ； （10） 载物、 压片 ： 取经纯化、 冷冻干燥后的壳聚糖和壳聚糖 / 明胶水凝胶， 与步骤 （8） 得到的真空冷冻干 燥物充分混匀， 用压片机制成成品。 0009 优选的， 所述步骤 （1） 中的匀浆操作后匀浆液颗粒粒度小于 3um。 0010 优选的， 所述步骤 （2） 中的中性蛋白酶为 N120P、 碱性蛋白酶为 Alcalase。 0011 优选的， 所述步骤 （3） 中的高温瞬时加热条件为 95100， 加热时间。

14、 2 分钟。 0012 优选的， 所述步骤 （4） 中的脉冲电场强度为 515Kv/cm， 脉冲频率为 25003500Hz， 处理时间为 200400us。 0013 优选的， 所述步骤 （5） 中选用 MWCO 为 1KD 的超滤膜。 0014 优选的， 所述步骤 （6） 中混合床脱盐技术条件为阴离子 ： 阳离子 =3:2， 过柱速度 ： 5 倍柱体积 /h， 水解液 pH 值 4.5。 0015 优选的， 所述步骤 （7） 中色谱分离条件为 ： 色谱柱， PheedaC18 柱 ； 上样量 ： lmL ； 流速 ： 4mL/min ； 检测波长 ： 280nm 和 220nm ； 洗脱条。

15、件 ： 03min， 100%A ； 350min， 0%50%B ； 5052min， 50%100%B ； 5258min， 100%B ； 5860min， 100%B100%A， 所述A为5%乙腈和0.05% 三氟乙酸， 所述 B 为 80% 乙腈和 0.05% 三氟乙酸。 0016 优选的， 所述步骤 （8） 中真空浓缩温度为 80 90。 0017 优选的， 所述步骤 （9） 中真空冷冻干燥温度为 -30。 0018 本发明的有益效果为 ： 本方法通过对海洋贝类资源废弃物下脚料扇贝裙边的综合 开发， 变废为宝， 可提高贝类产品的经济价值 ； 通过本方法， 扇贝裙边酶解效率显著提高、。

16、 短 肽获得率能够达到 80% 以上， 操作简便， 所得产品口感得到显著的改善， 口服时生物活性能 够得以保持。 说 明 书 CN 103911416 A 5 3/4 页 6 附图说明 0019 下面根据附图对本发明作进一步详细说明。 0020 图 1 是现有技术中扇贝裙边活性肽制取方法流程图 ； 图 2 是本发明实施例所述的扇贝裙边活性肽制取方法流程图。 具体实施方式 0021 实施例 1 如图 1-2 所示， 本发明实施例所述的一种制备扇贝裙边活性肽的方法， 将经验收合格 的扇贝裙边清洗后打浆， 之后放入匀浆机进行匀浆， 控制匀浆液的颗粒粒度小于 3um ； 然 后用中性蛋白酶 N120P。

17、 在 40， PH7.0， 酶 - 底物浓度比 （W/W） 为 5% 的条件下水解匀浆液 2 小时， 水解完成后用 0.5% 的 NaOH 溶液调节 PH 至 8.8， 温度升至 55， 加入碱性蛋白酶 （Alcalase） 水解 2 h， 此条件下肽得率在 80% 以上 ； 之后， 过滤酶解液， 弃去残渣， 将滤液 用高温瞬时加热法加热， 温度为 95， 加热 2 min 后迅速冷却至室温 ； 将灭酶液放入脉冲 电场强度为 5Kv/cm， 脉冲频率为 3500Hz， 处理时间 400us ； 选用 MWCO 为 1KD 的超滤膜， 采 用 Millipore 杯式超滤器 , 对纯化酶解液进行。

18、超滤处理 ； 将超滤酶解液在阴离子 ： 阳离子 =3:2， 过柱速度 ： 5 倍柱体积 /h， 水解液 pH 值 4.5 的条件下进行混合床脱盐 ； 将脱盐酶解液 在 HPLC 系统进行分离纯化。色谱条件 ： 色谱柱， PheedaC18 柱 ； 上样量 ： lmL ； 流速 ： 4mL/ min ； 检测波长 ： 280nm 和 220nm ； 洗脱条件 ： 03min， 100%A ； 350min， 0%50%B ； 5052min， 50%100%B ； 5258min， 100%B ； 5860min， 100%B100%A ； 所述 A 为 5% 乙腈和 0.05% 三氟乙 酸 ；。

19、 B 为 80% 乙腈和 0.05% 三氟乙酸 ； 将色谱分离物在 80下进行真空浓缩 ； 将真空浓缩物 于-30下冷冻干燥24h ； 取经纯化、 冷冻干燥后的壳聚糖和壳聚糖/明胶水凝胶， 与真空冷 冻干燥物充分混匀， 用压片机制成成品。 0022 实施例 2 本发明实施例所述的一种制备扇贝裙边活性肽的方法， 将经验收合格的扇贝裙边清 洗后打浆， 之后放入匀浆机进行匀浆， 控制匀浆液的颗粒粒度小于 3um ； 然后用中性蛋白酶 N120P 在 40， PH7.0， 酶 - 底物浓度比 （W/W） 为 5% 的条件下水解匀浆液 2 小时， 水解完成后 用 0.5% 的 NaOH 溶液调节 PH 。

20、至 8.8， 温度升至 55， 加入碱性蛋白酶 （Alcalase） 水解 2 h， 此条件下肽得率在 80% 以上 ； 之后， 过滤酶解液， 弃去残渣， 将滤液加热， 一来， 可以加热灭 菌， 二来可以使酶失去活性， 本项目采用高温瞬时加热法， 即 97 ， 加热 2 min 后迅速冷却 至室温 ； 将灭酶液放入脉冲电场强度为10Kv/cm， 脉冲频率为3000Hz， 处理时间300us ； 选用 MWCO 为 1KD 的超滤膜， 采用 Millipore 杯式超滤器 , 对纯化酶解液进行超滤处理 ； 将超滤 酶解液在阴离子 ： 阳离子 =3:2， 过柱速度 ： 5 倍柱体积 /h， 水解液。

21、 pH 值 4.5 的条件下进行混 合床脱盐 ； 将脱盐酶解液在 HPLC 系统进行分离纯化。色谱条件 ： 色谱柱， PheedaC18 柱 ； 上 样量 ： lmL ； 流速 ： 4mL/min ； 检测波长 ： 280nm 和 220nm ； 洗脱条件 ： 03min， 100%A ； 350min， 0%50%B ； 5052min， 50%100%B ； 5258min， 100%B ； 5860min， 100%B100%A ； 所述 A 为 5% 乙 腈和0.05%三氟乙酸 ； B为80%乙腈和0.05%三氟乙酸 ； 将色谱分离物在85下进行真空浓 缩 ； 将真空浓缩物于 -30下。

22、冷冻干燥 24h ； 取经纯化、 冷冻干燥后的壳聚糖和壳聚糖 / 明 胶水凝胶， 与真空冷冻干燥物充分混匀， 用压片机制成成品。 0023 实施例 3 说 明 书 CN 103911416 A 6 4/4 页 7 本发明实施例所述的一种制备扇贝裙边活性肽的方法， 将经验收合格的扇贝裙边清 洗后打浆， 之后放入匀浆机进行匀浆， 控制匀浆液的颗粒粒度小于 3um ； 然后用中性蛋白酶 N120P 在 40， PH7.0， 酶 - 底物浓度比 （W/W） 为 5% 的条件下水解匀浆液 2 小时， 水解完成后 用0.5%的NaOH溶液调节PH至8.8， 温度升至55， 加入碱性蛋白酶 （Alcalas。

23、e） 水解2 h， 此 条件下肽得率在 80% 以上 ； 之后， 过滤酶解液， 弃去残渣， 将滤液加热， 一来， 可以加热灭菌， 二来可以使酶失去活性， 本项目采用高温瞬时加热法， 即 100 ， 加热 2 min 后迅速冷却至 室温 ； 将灭酶液放入脉冲电场强度为 15Kv/cm， 脉冲频率为 2500Hz， 处理时间 200us ； 选用 MWCO 为 1KD 的超滤膜， 采用 Millipore 杯式超滤器 , 对纯化酶解液进行超滤处理 ； 将超滤 酶解液在阴离子 ： 阳离子 =3:2， 过柱速度 ： 5 倍柱体积 /h， 水解液 pH值 4.5 的条件下进行混 合床脱盐 ； 将脱盐酶解。

24、液在 HPLC 系统进行分离纯化。色谱条件 ： 色谱柱， PheedaC18 柱 ； 上 样量 ： lmL ； 流速 ： 4mL/min ； 检测波长 ： 280nm 和 220nm ； 洗脱条件 ： 03min， 100%A ； 350min， 0%50%B ； 5052min， 50%100%B ； 5258min， 100%B ； 5860min， 100%B100%A ； 所述 A 为 5% 乙 腈和0.05%三氟乙酸 ； B为80%乙腈和0.05%三氟乙酸 ； 将色谱分离物在90下进行真空浓 缩 ； 将真空浓缩物于 -30下冷冻干燥 24h ； 取经纯化、 冷冻干燥后的壳聚糖和壳聚糖。

25、 / 明 胶水凝胶， 与真空冷冻干燥物充分混匀， 用压片机制成成品。 0024 按照本发明实施例所述的方法生产的扇贝裙边活性肽纯度高、 安全性好、 无毒副 作用、 人体吸收快、 可控释。 0025 以下为按照本发明实施例所述方法生产的扇贝裙边活性肽的感官和理化检测效 果 ： 感官效果 ： 理化效果 ： 本发明不局限于上述最佳实施方式， 任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式 的方法， 但不论在其形式上作任何变化， 凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案， 均落 在本发明的保护范围之内。 说 明 书 CN 103911416 A 7 1/1 页 8 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103911416 A 8 。