青枯菌N477胞外蛋白PHD及其编码基因和应用.pdf

《青枯菌N477胞外蛋白PHD及其编码基因和应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《青枯菌N477胞外蛋白PHD及其编码基因和应用.pdf（10页完整版）》请在专利查询网上搜索。

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810294230.1 (22)申请日 2018.03.30 (83)生物保藏信息 CGMCC NO.15253 2018.01.22 (71)申请人 南京农业大学 地址 211225 江苏省南京市溧水区白马镇 国家农业科技园南京农业大学基地 (72)发明人 刘红霞陈瑜赵杨扬 (74)专利代理机构 南京天华专利代理有限责任 公司 32218 代理人 傅婷婷徐冬涛 (51)Int.Cl. C12N 15/70(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12N 。

2、15/31(2006.01) C12P 21/02(2006.01) C07K 14/195(2006.01) A01N 47/44(2006.01) A01P 1/00(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (54)发明名称 青枯菌N477胞外蛋白PHD及其编码基因和应 用 (57)摘要 本发明公开了青枯菌N477胞外蛋白PHD及其 编码基因和应用。 青枯菌N477胞外蛋白PHD， 氨基 酸序列如SEQIDNO.1所示， 其编码基因核苷酸 序列如SEQIDNO.2所示。 PHD或其编码基因在制 备抗青枯病的生物源农药中的应用。 设计引物， 以基因组DNA为模板， 扩增PHD。

3、编码区序列， 产物 连接至蛋白表达载体pET30a(+)载体， 然后转化 至大肠杆菌BL21(DE3)中进行蛋白表达， 用镍柱 纯化PHD蛋白。 温室试验结果显示， 该蛋白还能诱 导烟草抗烟草花叶病毒的侵染， 防效为56.88。 权利要求书1页 说明书4页 序列表3页 附图1页 CN 108504672 A 2018.09.07 CN 108504672 A 1.含有青枯菌N477胞外蛋白PHD的编码基因的重组表达载体； 所述的青枯菌N477胞外 蛋白PHD的编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。 2.含有青枯菌N477胞外蛋白PHD的编码基因的基因工程菌； 所述的青枯菌N477胞外。

4、蛋 白PHD的编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。 3.青枯菌N477胞外蛋白PHD在制备抗青枯病的生物源农药中的应用； 所述的青枯菌 N477胞外蛋白PHD， 氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。 4.青枯菌N477胞外蛋白PHD的编码基因在制备抗青枯病的生物源农药中的应用； 所述 的青枯菌N477胞外蛋白PHD的编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。 5.权利要求1所述的重组表达载体在制备抗青枯病的生物源农药中的应用。 6.权利要求2所述的基因工程菌在制备抗青枯病的生物源农药中的应用。 7.青枯菌N477胞外蛋白PHD的编码基因的基因工程应用， 其特征在于包括： 。

5、1)PHD基因的克隆 青枯菌N477在30条件下培养于YGPA培养基， 待菌株生长至对数期， 按照细菌基因组 提取试剂盒操作说明提取青枯菌基因组DNA； 设计扩增PHD的编码基因的引物， 以基因组DNA为模板， 使用高保真pfu聚合酶扩增PHD 基因的编码区序列， 扩增程序为： 94预变性4min， 94变性30s， 58复性30s， 72延伸 1min， 30个循环后， 7210min， 产物切胶回收； 所述的扩增PHD的编码基因的引物选自引物1 或引物2： 引物1上游引物如SEQ ID NO.3所示， 引物1下游引物如SEQ ID NO.4所示； 引物2上 游引物如SEQ ID NO.5所。

6、示， 引物2下游引物如SEQ ID NO.6所示； 2)PHD蛋白的表达及纯化 产物切胶回收后加A后连接至中间载体酶切或直接酶切后连接至蛋白表达载体pET30a (+)载体， 测序鉴定， 得到重组载体pET-popW， 然后转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行蛋白表 达， 将筛选到的阳性克隆接种到含有LB液体培养基的试管中， 37， 180rpm培养过夜， 第二 天按1:100的比例接种到10ml LB中， 按照上述条件培养3h， 加入异丙基- -D-硫代半乳糖 苷， 使其终浓度为1mM， 诱导培养2h后， 4， 6000rpm， 离心10min， 收集菌体， 将其悬浮于20mM Tris-。

7、HCl、 pH 8.0， 加入终浓度为1mM的笨甲基磺酰氟， 然后在超声波破碎仪上对菌体进行 破碎， 当菌液变澄清时， 离心吸取上清， 进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测， 并用镍柱纯化PHD蛋 白， 具体操作参照High-Affinity Ni-IDA Resin操作说明书进行， 获得纯化PHD。 权利要求书 1/1 页 2 CN 108504672 A 2 青枯菌N477胞外蛋白PHD及其编码基因和应用 技术领域 0001 本发明属于基因工程领域， 涉及青枯菌N477胞外蛋白PHD(PopW Harpin domain) 及其编码基因和应用。 背景技术 0002 绝大多数的革兰氏阴性细菌的hrp基。

8、因簇能在非寄主植物上引起过敏性反应， 而 在寄主植物上表现出致病性。 hrp基因的产物在其表达及分泌过程中起着调控作用。 如 Erwinia amylovora的HrpN， Pseudomona syringae的HrpZ以及Ralstonia solanacearum的 PopA类似的Harpin蛋白已经被鉴定出来， 他们能够通过三型泌出系统分泌到胞外引起非寄 主植物发生过敏性反应， 是一类富含甘氨酸、 丝氨酸， 缺少半胱氨酸并且耐热的一种蛋白， 在氨基酸序列上没有相似性。 0003 青枯病是一种毁灭性的土传病害， 是世界上危害最大、 分布最广、 造成损失最严重 的植物病害之一， 至今尚无很。

9、有效的化学农药和其他防治办法。 因此青枯病被称为植物的 “癌症” 。 近年来， 我国北方保护地面积明显扩大， 南方塑料大棚蔬菜生产扩大， 因此在部分 地区青枯病有所发生和发展， 甚至成为毁灭性灾害， 造成了极严重的经济损失。 0004 青枯菌能够在全世界范围内引起数百种农作物发生萎蔫， 可侵染50多个科200多 种植物， 其中茄科植物受害最重， 包括番茄、 马铃薯、 烟草、 花生、 香蕉等。 病菌通过寄主根部 伤口侵染进入木质部， 然后快速扩散到整个植株。 其致病机理是青枯菌在导管中生长时可 产生大量的胞外多糖， 能影响和阻碍植物体内的水分运输， 特别是容易对叶柄结和小叶处 较小孔径导管穿孔板。

10、造成堵塞， 因而引起植株枯萎。 在模式菌株GMI1000中， 三个胞外蛋白 已经被鉴定出来， 分别是PopA1,PopB和PopC。 PopA1， 是一种通过三型泌出系统分泌到胞外 的蛋白， 同时缺少N-末端92个氨基酸。 PopA1的衍生物PopA3也已经从生长在营养贫瘠培养 基的上清液中纯化出来。 PopA1和PopA3均能引起矮牵牛花的过敏性反应。 popA位于青枯菌 hrp基因簇上游2kb， 其表达受hrpB基因的调控。 Arlat小组从青枯菌的基因组中发现了新蛋 白PopB和PopC， PopB蛋白由173个氨基酸组成， 含有两个核定位信号； PopC长1024个氨基酸， 其中含有2。

11、2个亮氨酸拉链。 popB、 popC以及popA都是同时受hrpB调控的。 在刚果红诱导下， 他们发现PopB和PopC是通过Hrp系统分泌到胞外的。 发明内容 0005 本发明的目的是针对现有技术的上述不足， 提供青枯菌N477胞外蛋白PHD。 0006 本发明的另一目的是提供青枯菌N477胞外蛋白PHD编码基因。 0007 本发明的又一目的是提供青枯菌N477胞外蛋白PHD编码基因的应用。 0008 青枯菌N477胞外蛋白PHD， 氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。 0009 所述的青枯菌N477胞外蛋白PHD的编码基因。 0010 所述的青枯菌N477胞外蛋白PHD的编码基因优选。

12、核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。 0011 含有所述的青枯菌N477胞外蛋白PHD的编码基因的重组表达载体。 说明书 1/4 页 3 CN 108504672 A 3 0012 含有所述的青枯菌N477胞外蛋白PHD的编码基因的基因工程菌。 0013 所述的青枯菌N477胞外蛋白PHD在制备抗青枯病的生物源农药中的应用。 0014 所述的青枯菌N477胞外蛋白PHD的编码基因在制备抗青枯病的生物源农药中的应 用。 0015 所述的重组表达载体在制备抗青枯病的生物源农药中的应用。 0016 所述的基因工程菌在制备抗青枯病的生物源农药中的应用。 0017 含有所述的青枯菌N477胞外蛋白P。

13、HD的编码基因的基因工程应用， 包括： 0018 1)PHD基因的克隆 0019 青枯菌N477在30条件下培养于YGPA培养基， 待菌株生长至对数期， 按照细菌基 因组提取试剂盒操作说明提取青枯菌基因组DNA； 0020 设计扩增PHD的编码基因的引物， 以基因组DNA为模板， 使用高保真pfu聚合酶扩增 PHD基因的编码区序列， 扩增程序为： 94预变性4min， 94变性30s， 58复性30s， 72延 伸1min， 30个循环后， 7210min， 产物切胶回收； 所述的扩增PHD的编码基因的引物选自引 物1： 引物1上游引物如SEQ ID NO.3所示， 引物1下游引物如SEQ I。

14、D NO.4所示； 0021 2)PHD蛋白的表达及纯化 0022 产物切胶回收后连接至中间载体酶切或直接酶切后连接至蛋白表达载体pET30a (+)载体， 测序鉴定， 得到重组载体pET-PHD， 然后转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行蛋白表 达， 将筛选到的阳性克隆接种到含有LB液体培养基的试管中， 37， 180rpm培养过夜， 第二 天按1:100的比例接种到10ml LB中， 按照上述条件培养3h， 加入异丙基- -D-硫代半乳糖 苷， 使其终浓度为1mM， 诱导培养2h后， 4， 6000rpm， 离心10min， 收集菌体， 将其悬浮于20mM Tris-HCl、 pH 8.。

15、0， 加入终浓度为1mM的笨甲基磺酰氟， 然后在超声波破碎仪上对菌体进行 破碎， 当菌液变澄清时， 离心吸取上清， 进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测， 并用镍柱纯化PHD蛋 白， 具体操作参照High-Affinity Ni-IDA Resin操作说明书进行， 获得纯化PHD。 0023 有益效果 0024 本发明人获得的PHD是一种耐热的harpin蛋白， 能够引起烟草发生过敏性反应。 PopW是无活性的果胶酶同源物， 虽然也能引起HR反应， 但经本发明发现起决定作用的是 PHD， PHD能更有效抑制烟草抗TMV的侵染， 且效果明显优于PopW。 0025 3、 本发明获得的PHD处理烟草， 可以。

16、诱导烟草抵抗烟草花叶病毒的侵染， 而且抗性 不仅限于PHD处理的叶片， 也包括其周围的叶片， 并且该过程中伴随着PR-1基因的表达。 说 明PHD可以诱导烟草系统获得抗病性。 这说明PHD具有开发成生物源农药的价值。 附图说明 0026 图1.PHD蛋白表达结果。 0027 M是蛋白marker(SM0431， MBI)， 1是1BSA， 2是PopW克隆表达结果， 3是PHD克隆表 达结果。 0028 生物材料保藏信息 0029 N477菌株， 分类命名为茄科罗尔斯通氏菌属Ralstonia solanacearum， 2018年1月 22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，。

17、 保藏地址为北京市朝阳区北 辰西路1号院3号， 中国科学院微生物研究所， 菌种保藏号为CGMCC NO.15253。 说明书 2/4 页 4 CN 108504672 A 4 具体实施方式 0030 实施例1 0031 (1)PopW基因序列的克隆 0032 青枯菌(Ralstonia solanacearum)N477在30条件下培养于YGPA培养基(0.5 蛋白胨， 0.5酵母提取粉， 1葡萄糖和1.5琼脂)， 待菌株生长到对数期， 提取基因组DNA (Axyprep Bacterial Genomic DNA kit,杭州)。 根据模式菌青枯菌GMI1000全基因组序列 设计扩增引物： 。

18、0033 上游引物F1： ATGTCCATCCAGATTGATCGC(SEQ ID NO.4) 0034 下游引物R1： GCCCGAGTAGGCCTTGTAG(SEQ ID NO.5) 0035 以N477基因组DNA为模板， 进行PCR扩增， PCR程序如下： 94预变性4min， 94变性 30s， 60复性1min， 72延伸1min， 30个循环后， 7210min， 用1的琼脂糖电泳检测PCR扩 增产物1143bp， 按照Agarose Gel DNA Purification Kit(TaKaRa， Dalian)手册进行回收。 将回收到的产物4 l连接至载体pMD19-T上， 。

19、在16反应16h后， 用热激法转化大肠杆菌感受 态DH5 ， 挑取阳性克隆进行测序， 测序结果表明青枯菌N477胞外蛋白基因PopW的完整编码 区为1143bp(SEQ ID NO.3)。 0036 (2)PopW蛋白表达 0037 根据青枯菌N477胞外蛋白PopW基因的全长编码序列， 设计两端分别加酶切位点的 引物： 0038 上游引物F2： CGCATATGTCCATCCAGATTGATCGC Nde I(SEQ ID NO.6) 0039 下游引物R2： GCAAGCTTGCCCGAGTAGGCCTTGTAG Hind III(SEQ ID NO.7) 0040 以N477的基因组DN。

20、A为模板， 进行PCR扩增popW基因的编码区序列， 扩增程序为： 94 预变性4min， 94变性30s， 60复性1min， 72延伸1min， 30个循环后， 7210min， 产物 大小为1143bp， 切胶回收到的产物末端加A后将其连接至载体pMD19-T上， 利用Nde I和Hind III酶切位点将其克隆至蛋白表达载体pET30a(+)载体， 测序鉴定， 得到重组质粒pET-PopW， 然后转化至BL21(DE3)中进行蛋白表达， 将培养好的含有上述重组质粒的大肠杆菌BL21 (DE3)离心收集菌体， 将其悬浮于20mM Tris-HCl(pH 8.0)， 加入终浓度为1mM的蛋。

21、白酶抑制 剂PMSF， 在超声波破碎仪上进行蛋白破碎， 然后提取蛋白， 进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测， 用镍柱纯化PopW蛋白。 0041 (3)PHD的克隆 0042 根据青枯菌N477胞外蛋白PopW基因的全长编码序列， 设计扩增引物： 0043 上游引物F3： GGTCGGCTCGGGCGGCTT(SEQ ID NO.8) 0044 下游引物R3： TCCATCCAGATTGATCGCCCG(SEQ ID NO.9) 0045 以N477基因组DNA为模板， 进行PCR扩增， PCR程序如下： 94预变性4min， 94变性 30s， 58复性30s， 72延伸1min， 30个循环后， 。

22、7210min， 用1的琼脂糖电泳检测PCR扩 增产物454bp， 按照Agarose Gel DNA Purification Kit(TaKaRa， Dalian)手册进行回收。 将回收到的产物4 l连接至载体pMD19-T上， 在16反应16h后， 用热激法转化大肠杆菌感受 态DH5， 挑取阳性克隆进行测序， 测序结果表明N477胞外蛋白基因PHD的完整编码区为 454bp。 说明书 3/4 页 5 CN 108504672 A 5 0046 (4)PHD蛋白表达 0047 根据青枯菌N477胞外蛋白PopW基因的全长编码序列， 设计两端分别加酶切位点的 引物： 0048 上游引物F4：。

23、 ATAAGCTTGGTCGGCTCGGGCGGCTT Hind III(SEQ ID NO.10) 0049 下游引物R4： GCCATATGTCCATCCAGATTGATCGCCCG Nde I(SEQ ID NO.11) 0050 以N477基因组DNA为模板， PCR扩增PHD基因的编码区序列， 扩增程序为： 94预变 性4min， 94变性30s， 58复性30s， 72延伸1min， 30个循环后， 7210min， 产物大小为 454bp， 将其克隆至中间载体pMD19-T， 利用引入的Nde I和Hind III酶切位点进一步克隆至 蛋白表达载体pET30a(+)载体， 测序鉴。

24、定， 得到重组质粒pET-PHD， 然后转化至BL21(DE3)中 进行蛋白表达， 将培养好的含有上述重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)离心收集菌体， 将其悬 浮于20mM Tris-HCl(pH 8.0)， 加入终浓度为1mM的蛋白酶抑制剂PMSF， 在超声波破碎仪上 进行蛋白破碎， 然后提取蛋白， 进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测， 用镍柱纯化PHD蛋白， 得到蛋 白浓度为25mg/LW(图1)。 0051 实施例2 0052 分别以上述获得的PopW可溶性蛋白和PHD蛋白， 用喷雾法喷于烟草叶片， 用不含 PHD蛋白的灭菌水和空载体作为对照处理。 两天以后， 采用摩擦接种的方法分别对喷过PH。

25、D 的叶片及其上面和下面的两片叶片接种烟草花叶病毒， 每个处理3个重复， 每次重复12株烟 草苗。 4天以后我们观察病斑的数目， 通过病斑的数量来计算防效。 防治效果(对照叶片 上枯斑数-处理叶片上枯斑数)/对照叶片上枯斑数x 100。 结果显示， 和没有处理的空白 对照相比， PopW可溶性蛋白和PHD处理过的叶片上病斑数明显减少， 防效分别可达45和 56.88(表1)， 说明PopW蛋白和PHD能够引起烟草的系统抗性， 但PHD能更有效抑制烟草抗 TMV的侵染， 从而有效抑制烟草花叶病毒的侵染。 0053 表1 PHD对烟草花叶病毒病的生防效果 0054 0055 注： 在处理4天后记录。

26、每张病叶上的枯斑数， 计算枯斑抑制率， 即为蛋白防治效果。 0056 以上实施例表明本发明中克隆的一种青枯菌N477新胞外蛋白PHD， 它具有Harpin 的特征， 包括氨基酸的组成， 热稳定性， 蛋白酶敏感以及在SDS-PAGE上迁移较慢等特性， PHD 和PopW都能引起HR反应。 本发明的PHD处理烟草， 可以诱导烟草抵抗烟草花叶病毒的侵染， 而且抗性不仅限于PHD处理的叶片， 也包括其周围的叶片， 并且该过程中伴随着PR-1基因的 表达。 说明PHD可以诱导烟草系统获得抗病性， 说明PHD可以开发成生物源农药。 说明书 4/4 页 6 CN 108504672 A 6 序列表 南京农业。

27、大学 青枯菌N477胞外蛋白PHD及其编码基因和应用 11 SIPOSequenceListing 1.0 1 147 PRT 茄科罗尔斯通氏菌属N477(Ralstonia solanacearumN477) 1 Phe Gln Thr Pro Ser Thr Trp Asn His Asp Ala Gly Ser Ser Ile Asp 1 5 10 15 Thr Ser Gln Leu Gln Arg Ala Val Gln Leu Leu Asp Gln Val Leu Gln 20 25 30 Gln Leu Glu Ala Arg Lys Leu Phe Gly Asn Met L。

28、eu Asn Gln Pro Gly 35 40 45 Ala Asp Asn Ala Gly Gln Asn His Ala Gly Gly His Gly Gly Gly His 50 55 60 His Gly Gly Ser Asn Gly Phe Gly Glu Asn Gly Arg Phe Gly Ser Pro 65 70 75 80 His Ala Asn Ser Pro Ala Gln Pro Asp Leu Glu Leu Pro Ala Asn Lys 85 90 95 Pro Asn Asn Gly Lys His Asn Thr Ser Ala Ser Thr Pr。

29、o Asp Thr Gln 100 105 110 Thr Ala Pro Ser Ser Thr Ser Pro Thr Thr Gly Thr Ser Pro Thr Pro 115 120 125 Thr Ser Thr Ser Ala Thr Glu Gly Lys Val Ala Tyr Gly Val Lys Pro 130 135 140 Pro Glu Pro 145 2 454 DNA 茄科罗尔斯通氏菌属N477(Ralstonia solanacearumN477) 2 tttccagacg ccctcgacgt ggaatcacga tgcgggttcc agtatcga。

30、ta ccagccagct 60 ccagcgcgca gtacaactgc tcgaccaggt cttgcagcag ctcgaagcgc gcaagctgtt 120 cgggaacatg ctgaaccagc cgggcgccga caacgccggc cagaaccacg ctggcggcca 180 序列表 1/3 页 7 CN 108504672 A 7 cggcggcggt catcatggcg gctcgaacgg gttcggtgaa aacggccgct tcggttcgcc 240 gcacgccaat tcgcctgcgc agccggacct cgagctgccg 。

31、gccaacaagc ccaacaacgg 300 caagcacaac acttcggctt ccacgccgga cacgcagacg gcgccgtctt ccacttcgcc 360 cacgaccggc acgtccccga cgcccacgtc cacctccgcg accgagggca aggtggccta 420 cggcgtcaag ccgcccgagc cgaagggatc ccga 454 3 1143 DNA 茄科罗尔斯通氏菌属N477(Ralstonia solanacearumN477) 3 atgtccatcc agattgatcg cccgaacaac catt。

32、tccaga cgccctcgac gtggaatcac 60 gatgcgggtt ccagtatcga taccagccag ctccagcgcg cagtacaact gctcgaccag 120 gtcttgcagc agctcgaagc gcgcaagctg ttcgggaaca tgctgaacca gccgggcgcc 180 gacaacgccg gccagaacca cgctggcggc cacggcggcg gtcatcatgg cggctcgaac 240 gggttcggtg aaaacggccg cttcggttcg ccgcacgcca attcgcctgc gca。

33、gccggac 300 ctcgagctgc cggccaacaa gcccaacaac ggcaagcaca acacttcggc ttccacgccg 360 gacacgcaga cggcgccgtc ttccacttcg cccacgaccg gcacgtcccc gacgcccacg 420 tccacctccg cgaccgaggg caaggtggcc tacggcgtca agccgcccga gccgaccggc 480 gtggtcgacg tcagcaagcc gatcgtcgtc aaggctggcg agacgttcga cggcggcggc 540 aagtacta。

34、cc gcccgaccaa ggagatgggc gacggttcgc agaacgagca ccagaagccg 600 ctgttcattc tggagcccgg cgcgacgctc aagaacgtgc agtattccgg cggcgacggc 660 atccacatgc tgggcagcgg caagctggac cgcgtcgtca accgccaggt gggcgaggat 720 gccatcacca tcgacggcgc caagaaccac gcgcatgatg ccaagatcgc cgggatcgat 780 ccggcgtcga tccccggagg aacgcc。

35、caaa gtggagatca ccaacagcgc cttctatggc 840 gccaaggaca agctcgctca gatcaacggc gacgttgacc tgcaggtgaa aggcatgtat 900 gtcaacggcg ccggcaaggt cttccgtacc aacggtggtg atacgcagat caaggcgacg 960 gtcaacgtcc aggattcgaa tttccagaac gtgtcggagg cggttttccg gaccgattcc 1020 aagttctcga ctgcgtcgtt ctcggacgat gtgaaatcgg atg。

36、cgccctt cgatgggctg 1080 gctcccgaca agagccaagt cacaggcacc aacaaggtga gctacaaggc ctactcgggc 1140 tga 1143 4 21 DNA 人工序列(Artificial Sequence) 4 atgtccatcc agattgatcg c 21 5 19 DNA 序列表 2/3 页 8 CN 108504672 A 8 人工序列(Artificial Sequence) 5 gcccgagtag gccttgtag 19 6 26 DNA 人工序列(Artificial Sequence) 6 cgcat。

37、atgtc catccagatt gatcgc 26 7 27 DNA 人工序列(Artificial Sequence) 7 gcaagcttgc ccgagtaggc cttgtag 27 8 18 DNA 人工序列(Artificial Sequence) 8 ggtcggctcg ggcggctt 18 9 21 DNA 人工序列(Artificial Sequence) 9 tccatccaga ttgatcgccc g 21 10 26 DNA 人工序列(Artificial Sequence) 10 ataagcttgg tcggctcggg cggctt 26 11 29 DNA 人工序列(Artificial Sequence) 11 gccatatgtc catccagatt gatcgcccg 29 序列表 3/3 页 9 CN 108504672 A 9 图1 说明书附图 1/1 页 10 CN 108504672 A 10 。