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一种用于pH荧光传感的罗丹明6G席夫碱衍生物的制备方法.pdf

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文档编号：8724298

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810990071.9 (22)申请日 2018.08.28 (71)申请人安徽工业大学地址 243002 安徽省马鞍山市花山区湖东中路59号 (72)发明人吴芳辉杨俊卿孙文斌张奎魏先文 (74)专利代理机构安徽知问律师事务所 34134 代理人杜袁成 (51)Int.Cl. C07D 491/107(2006.01) C09K 11/06(2006.01) G01N 21/64(2006.01) G01N 21/78(2006.01) (54)发明名称一种。

2、用于pH荧光传感的罗丹明6G席夫碱衍生物的制备方法 (57)摘要本发明公开了一种用于pH荧光传感的罗丹明6G席夫碱衍生物的制备方法，属于无机材料合成技术领域。该方法先由罗丹明6G和水合肼于乙醇中加热回流反应制备罗丹明6G酰肼前驱体，接着与2,5-二甲氧基苯甲醛在甲醇中以乙酸为催化剂合成得到2,5-二甲氧基苯甲醛罗丹明6G席夫碱粗产物，多次萃取并重结晶后制得目标产物。该合成方法简单，原材料价格低廉，条件温和，采用绿色无污染溶剂，产物分离纯化方便，结构新颖。将该产物作为荧光分子探针用于对氢离子的识别灵敏度高，可以通过荧光显著变化定量检测一定浓度的氢。

3、离子，常见的金属离子不干扰对氢离子的响应，而且该pH型荧光分子探针的稳定性和可逆性良好，具有潜在的生物应用前景。权利要求书1页说明书6页附图3页 CN 108892672 A 2018.11.27 CN 108892672 A 1.一种用于pH荧光传感的罗丹明6G席夫碱衍生物的制备方法，其特征在于，将0.96 1.44g罗丹明6G和2.53.5mL质量百分含量为85的水合肼在2535mL乙醇中于8090 加热回流反应48h，充分冷却后析出沉淀，抽滤，干燥，所得产物用蒸馏水洗涤， 4050 真空干燥23h后在乙醇中重结晶并再次抽滤干燥得到罗丹明6G酰肼；接着称取一定。

4、量的罗丹明6G酰肼与2,5-二甲氧基苯甲醛并滴加13滴乙酸作为催化剂在2535mL乙醇中于 8090情况下加热回流反应48h，胺醛缩合生成大量沉淀，冷却、低压旋转蒸发去除溶剂，然后将粗产品用乙酸乙酯萃取，并在乙醇中重结晶，最后于4050真空干燥46h得到目标产物罗丹明6G席夫碱衍生物；所述罗丹明6G酰肼与2,5-二甲氧基苯甲醛的摩尔比为1:3.54.5；所述罗丹明6G化合物的母体结构式如下： 2.如权利要求1所述制备方法得到的罗丹明6G席夫碱衍生物作为荧光分子探针在识别和定量检测氢离子中的应用。权利要求书 1/1 页 2 CN 108892672 A 2 一种用于pH。

5、荧光传感的罗丹明6G席夫碱衍生物的制备方法技术领域 0001 本发明属于无机材料合成技术领域，具体涉及一种简便制备罗丹明6G席夫碱类荧光传感材料的制备方法及其应用。背景技术 0002 作为细胞健康的一个重要指标，氢离子在细胞增殖、细胞凋亡、离子转运，细胞自噬以及生物酶活性等一系列细胞活动中充当着重要的生理作用。人体内pH值的微小变化可导致细胞功能障碍，从而产生严重的疾病，如癌症、中风和阿尔茨海默病等。因此,生物体内氢离子的识别和定量检测对于了解细胞的生理及药理过程，探索生命的奥秘具有较大的研究价值。近年来，文献报道了多种针对氢离子的检测方法，如酸碱滴定。

6、法、电位滴定法和光谱法等。相比较而言，荧光分析法因为操作简单、灵敏度高、选择性好和细胞无损实时检测等众多优点而受到广大科研人员的关注。 0003 罗丹明类衍生物是以氧杂蒽环为主体骨架的分子，有开环和闭环两种互变分子结构，作为荧光分子探针时对环境的pH值高度敏感，即在一定的酸性环境下，罗丹明螺环呈开环状态，此时整个分子是共轭的，因此在可见区有很强的吸收且荧光强度较强。而在碱性条件下，罗丹明呈现闭环状态，此时整个分子是非共轭的，在可见区的吸收且荧光强度较弱，利用罗丹明衍生物的这一特点，可以设计和开发出对氢离子有响应的新型结构，故而决定了罗丹明衍生物成。

7、为生物医学、化学分析等领域的研究热点之一。 0004 席夫碱化合物是指结构中包含有亚胺基或者亚胺性质基团的有机物，合成方法简单，实验操作易行，一步胺醛缩合反应就能生成，因为其氮原子上的孤对电子加上独特的光、电和磁性，使得席夫碱化合物常用作配体生成配合物或者广泛用于催化领域。利用席夫碱基团良好的受体特征协同罗丹明化合物优异的发光性能，可以通过胺醛缩合构建一种新型的罗丹明席夫碱衍生物荧光分子探针。有望改善传统pH荧光探针原材料价格昂贵，合成步骤繁琐，反应条件苛刻，探针分子水溶性不高，荧光传感灵敏度低，识别选择性差，测试环境毒性强以及探针稳定性不好等缺陷。。

8、发明内容 0005 本发明的目的在于克服现有的技术中荧光分子探针合成过程复杂，反应温度较高，原材料价格昂贵，耗时长、提纯分离困难、荧光传感灵敏度和选择性低、无法定量检测，探针稳定性不好等缺点，通过简单、温和的反应条件，以乙醇作为绿色无污染反应溶剂和测试溶剂，制备分离出优良性能的罗丹明6G席夫碱衍生物荧光分子探针，使得其与在一定pH 值环境中，表现出显著的荧光变化，并且常见的金属离子几乎不干扰测定，从而实现高灵敏度和高选择性识别及定量检测氢离子的作用。 0006 本发明所提供的一种简便制备罗丹明6G席夫碱衍生物的方法，其合成路线如图1 所示。其中第一步反。

9、应中将一定量的罗丹明6G和过量的水合肼(质量百分含量为85)在乙醇溶剂中溶解后加热回流反应，充分冷却后析出沉淀，抽滤，干燥，所得产物用蒸馏水洗涤说明书 1/6 页 3 CN 108892672 A 3 后在乙醇中重结晶并再次抽滤干燥得到罗丹明6G酰肼前驱体；第二步反应是称取一定量的罗丹明6G酰肼与2,5-二甲氧基苯甲醛并滴加乙酸做催化剂在甲醇溶剂中加热回流反应，胺醛缩合生成大量沉淀，冷却、低压旋转蒸发去除溶剂，然后将粗产品用乙酸乙酯萃取三次，并在乙醇中重结晶，最后真空干燥得到目标产物罗丹明6G席夫碱衍生物。 0007 上述罗丹明6G席夫碱衍生物可作为荧光分子探针在。

10、识别和定量检测氢离子中加以应用。 0008 上述荧光分子探针的发色基团为罗丹明6G化合物，而受体为席夫碱化合物。 0009 本发明所使用的罗丹明6G席夫碱衍生物采用溶液合成法制备，参考相关材料 (Chen X,Sun W,Bai Y,Zhang F,Zhao J,Ding X.Novel rhodamine Schiff base type naked-eye fluorescent probe for sensing Fe3+and the application in cell.Spectrochimica Acta Part A:Molecular and Biomolecular。

11、 Spectroscopy， 2018, 191:566-572.) 0010 本发明的科学原理： 0011 采用激发和发射波长均在可见光区，荧光量子产率较高，摩尔吸光系数较大，细胞穿透能力强等优点的氧杂蒽类中的罗丹明6G衍生物通过胺醛缩合构建含有生物毒性小、光电性能优良的席夫碱基团的新型荧光分子探针，研究了七对氢离子的响应，结果发现当该探针与高浓度的氢离子作用后，会使其荧光强度迅速显著增强，表明罗丹明6G席夫碱衍生物与氢离子结合后，发生了结构内部螺酰胺环的开环反应，形成了大的共轭结构，导致荧光强度产生明显的变化，其它金属离子不干扰该分子探针对氢离子的响应，。

12、而且分子探针的重现性和稳定性好，可发展用于特异性识别和定量检测环境中的酸碱性。 0012 与其它pH型荧光传感分子探针材料的合成方法和应用相比，本发明罗丹明6G席夫碱衍生物(RGSBD)荧光分子探针具有以下技术效果： 0013 1、反应过程较简单，原材料价格低廉，用量较少；反应条件比较温和，节能减耗； 0014 2、制备后处理过程简单，易于分离提纯； 0015 3、反应溶剂和检测溶剂几乎无毒性，对人和环境友好； 0016 4、对氢离子的光学响应灵敏(在PH值为1.9时，荧光强度达到2500a.u.)，识别选择性好(只有氢离子会使探针的荧光显著增强，而其它离子。

13、对该探针几乎不响应)； 0017 5、本发明RGSBD探针的荧光变化差值与体系的pH值在1.93.2范围之间呈良好的线性关系，因此根据该线性关系，可以定量检测一定浓度范围内的氢离子浓度； 0018 6、该分子探针具有优异的重现性，稳定性好(向pH1.9的强酸性缓冲液中缓慢加入氢氧化钠溶液至溶液体系被中和到中性环境即pH7.0，之后再次用盐酸酸化中性溶液至pH1.8，多次在这两个pH值处循环反复测定探针的荧光发射光谱， 10次循环之后， RGSBD 探针荧光强度并没有受到影响)，因而有应用于生物体内pH值的响应和检测的潜力。附图说明 0019 图1为本发明罗丹明6G席夫碱。

14、衍生物荧光分子探针的合成路线图。 0020 图2为本发明罗丹明6G席夫碱衍生物荧光分子探针在不同pH环境下的荧光光谱。 0021 图3为本发明罗丹明6G席夫碱衍生物荧光分子探针的荧光强度变化值与体系pH值之间的线性校正关系图。说明书 2/6 页 4 CN 108892672 A 4 0022 图4为其它离子对罗丹明6G席夫碱衍生物荧光分子探针响应氢离子的影响。 0023 图5为本发明罗丹明6G席夫碱衍生物荧光分子探针对体系pH值响应的重复性实验结果。具体实施方式 0024 本发明的实质特点和显著效果可以从下述的实施例中得以体现，但它们并不对本发明作任何限制，本领域的技术人员根据本。

15、发明的内容做出一些非本质的改进和调整，均属于本发明的保护范围。下面通过具体实施方式对本发明作进一步的说明，其中实施例中反应产物的核磁数据测试表征使用的是德国Bruker公司的型号为AVANCE-III 400MHz的核磁共振仪(TMS为内标)；红外光谱测试表征采用美国Nicolet/Nexus-870FT-IR型红外光谱仪(KBr压片)；使用美国Perkin Elmer LS55型荧光光谱仪和美国WinASPECT PLUS2000型紫外光谱仪分别测定荧光和紫外可见吸收光谱。 0025 一、本发明新型罗丹明6G席夫碱衍生物的合成方法 0026 实施例1 0027 (1)将。

16、0.889g罗丹明6G(2mmol)溶于25mL乙醇中，加入2.5mL过量的水合肼(85)，加热至80冷凝回流反应8小时，冷却后抽滤干燥得到罗丹明6G酰肼粗产品。 0028 (2)将罗丹明6G酰肼粗产品用蒸馏水洗涤三次， 40真空干燥3小时后溶于乙醇中重结晶并再次抽滤干燥得到罗丹明6G酰肼前驱体。 0029 (3)称取0 .214g罗丹明6G酰肼(0 .5mmol)与0 .291g 2 ,5-二甲氧基苯甲醛 (1.75mmol)并滴加1滴乙酸做催化剂在25mL乙醇中于80情况下加热回流反应8小时，胺醛缩合生成大量沉淀。 0030 (4)冷却、低压旋转蒸发去除溶剂，然后将粗产品用。

17、乙酸乙酯萃取三次，并在乙醇中重结晶，最后于40真空干燥6小时得到目标产物罗丹明6G席夫碱衍生物。 0031 实施例2 0032 (1)将1.334g罗丹明6G(3mmol)溶于35mL乙醇中，加入3.5mL过量的水合肼(85)，加热至90冷凝回流反应4小时，冷却后抽滤干燥得到罗丹明6G酰肼粗产品。 0033 (2)将罗丹明6G酰肼粗产品用蒸馏水洗涤三次， 50真空干燥2小时后溶于乙醇中重结晶并再次抽滤干燥得到罗丹明6G酰肼前驱体。 0034 (3)称取0 .214g罗丹明6G酰肼(0 .5mmol)与0 .374g 2 ,5-二甲氧基苯甲醛 (2.25mmol)并滴加3滴乙酸做催。

18、化剂在35mL乙醇中于90情况下加热回流反应4小时，胺醛缩合生成大量沉淀。 0035 (4)冷却、低压旋转蒸发去除溶剂，然后将粗产品用乙酸乙酯萃取三次，并在乙醇中重结晶，最后于50真空干燥4小时得到目标产物罗丹明6G席夫碱衍生物。 0036 实施例3 0037 (1)将1.111g罗丹明6G(2.5mmol)溶于30mL乙醇中，加入3mL过量的水合肼(85)，加热至85冷凝回流反应6小时，冷却后抽滤干燥得到罗丹明6G酰肼粗产品。 0038 (2)将罗丹明6G酰肼粗产品用蒸馏水洗涤三次， 50真空干燥2小时后溶于乙醇中重结晶并再次抽滤干燥得到罗丹明6G酰肼前驱体。 0039。

19、 (3)称取0.214g罗丹明6G酰肼(0.5mmol)与0.332g 2,5-二甲氧基苯甲醛(2mmol) 说明书 3/6 页 5 CN 108892672 A 5 并滴加2滴乙酸做催化剂在30mL乙醇中于85情况下加热回流反应6小时，胺醛缩合生成大量沉淀。 0040 (4)冷却、低压旋转蒸发去除溶剂，然后将粗产品用乙酸乙酯萃取三次，并在乙醇中重结晶，最后于45真空干燥5小时得到目标产物罗丹明6G席夫碱衍生物。 0041 实施例4 0042 (1)将0.889g罗丹明6G(2mmol)溶于30mL乙醇中，加入3mL过量的水合肼(85)，加热至80冷凝回流反应7小时，冷却。

20、后抽滤干燥得到罗丹明6G酰肼粗产品。 0043 (2)将罗丹明6G酰肼粗产品用蒸馏水洗涤三次， 45真空干燥2小时后溶于乙醇中重结晶并再次抽滤干燥得到罗丹明6G酰肼前驱体。 0044 (3)称取0.214g罗丹明6G酰肼(0.5mmol)与0.332g 2,5-二甲氧基苯甲醛(2mmol) 并滴加2滴乙酸做催化剂在25mL乙醇中于85情况下加热回流反应5小时，胺醛缩合生成大量沉淀。 0045 (4)冷却、低压旋转蒸发去除溶剂，然后将粗产品用乙酸乙酯萃取三次，并在乙醇中重结晶，最后于40真空干燥6小时得到目标产物罗丹明6G席夫碱衍生物。 0046 实施例5 0047 (1)将1.。

21、334g罗丹明6G(3mmol)溶于25mL乙醇中，加入3.5mL过量的水合肼(85)，加热至90冷凝回流反应7小时，冷却后抽滤干燥得到罗丹明6G酰肼粗产品。 0048 (2)将罗丹明6G酰肼粗产品用蒸馏水洗涤三次， 50真空干燥2小时后溶于乙醇中重结晶并再次抽滤干燥得到罗丹明6G酰肼前驱体。 0049 (3)称取0.214g罗丹明6G酰肼(0.5mmol)与0.332g 2,5-二甲氧基苯甲醛(2mmol) 并滴加2滴乙酸做催化剂在30mL乙醇中于80情况下加热回流反应7小时，胺醛缩合生成大量沉淀。 0050 (4)冷却、低压旋转蒸发去除溶剂，然后将粗产品用乙酸乙酯萃取三次，。

22、并在乙醇中重结晶，最后于50真空干燥5小时得到目标产物罗丹明6G席夫碱衍生物。 0051 实施例6 0052 (1)将0.889g罗丹明6G(2mmol)溶于25mL乙醇中，加入2.5mL过量的水合肼(85)，加热至85冷凝回流反应6小时，冷却后抽滤干燥得到罗丹明6G酰肼粗产品。 0053 (2)将罗丹明6G酰肼粗产品用蒸馏水洗涤三次， 50真空干燥2小时后溶于乙醇中重结晶并再次抽滤干燥得到罗丹明6G酰肼前驱体。 0054 (3)称取0 .214g罗丹明6G酰肼(0 .5mmol)与0 .374g 2 ,5-二甲氧基苯甲醛 (2.25mmol)并滴加3滴乙酸做催化剂在30mL乙醇。

23、中于90情况下加热回流反应6小时，胺醛缩合生成大量沉淀。 0055 (4)冷却、低压旋转蒸发去除溶剂，然后将粗产品用乙酸乙酯萃取三次，并在乙醇中重结晶，最后于50真空干燥5小时得到目标产物罗丹明6G席夫碱衍生物。 0056 目标产物表征：产率： 0.101g， 35。 1H NMR(400MHz， DMSO)(PPM)： 8.85-8.75(s,J 2Hz,1H)， 7.95-7.85(d,J2Hz,2H)， 7.70-7.50(m,J4Hz,2H)， 7.10-7.00(s,J2Hz, 2H)， 6.95-6.85(s,J2Hz,2H)， 3.5-3.4(m,J2Hz,2H)。

24、， 3.15-3.05(s， J2Hz,4H)， 1.9- 1.7(s,J4Hz,6H)， 1.30-1.10(m,J4Hz,6H)， 1.10-1.00(m,J2Hz,2H)。 0057 二、本发明罗丹明6G席夫碱衍生物对氢离子的荧光传感效果评价说明书 4/6 页 6 CN 108892672 A 6 0058 以目标产物为分子探针，研究对氢离子的荧光传感响应效果。 0059 (1)将罗丹明6G席夫碱衍生物(RGSBD)(40 M)溶解于不同pH值的乙醇和PBS(体积比为1:1)混合溶液中，观察RGSBD的荧光光谱变化情况，如图2所示。可以看出，随着pH值的不断下降，即氢。

25、离子浓度的不断增大，该探针的荧光逐渐增强，当体系的pH值达到1.9时，探针的荧光强度达到最高值，而且肉眼观察到探针颜色也由原本的浅黄色迅速转换为玫瑰红色，这表明探针的螺酰胺环由关闭状态迅速打开后形成巨大的共轭平面结构，导致探针的颜色和荧光强度显著变化，探针整体与氢离子结合的过程与共轭酸碱对相类似。之后随着 pH值的进一步降低，荧光强度反而下降。这是因为溶液内与RGSBD结合的氢离子浓度达到饱和，反而引起了荧光强度下降。另外还观察到随着pH值的不断下降， RGSBD探针的最大荧光峰位置也发生了细微的红移，从开始的547nm处红移至554nm，这是由于罗丹明类。

26、探针的特殊结构所导致。 0060 根据上述荧光滴定实验观察图可知，当体系的pH值大于4时， RGSBD探针的荧光强度几乎变化不大，当体系的pH值小于4时，出现了变化的拐点，荧光开始明显急剧增加。表明只有当溶液中氢离子浓度升高至与RGSBD探针形成足够大的共轭体系时，才会产生强烈的荧光。根据罗丹明类pH探针的文献(Maozhong Tian,Xiaojun Peng,Jiangli Fan,Jingyun Wang,Shiguo Sun.A fluorescent sensor for pH based on rhodamine fluorophore, Dyes and 。

27、Pigments 95(2012)112-115.)得知，此类探针属于共轭酸碱对体系，故采用 Hendreson-Hasselbach方程，计算出RGSBD探针的酸性结合常数pKa为4.811。 0061 进一步研究发现， RGSBD探针的荧光变化差值(FF-F0， F为RGSBD分子探针在不同pH值环境中的荧光强度， F0为RGSBD分子探针在pH值为7.0环境中的荧光强度)与体系的 pH值在1 .93 .2范围之间呈良好的线性关系，如图3所示，拟合出线性方程F- 2883.18pH-9649.73,线性相关系数为0.9915。因此根据该线性方程，可以定量检测一定浓度范围内。

28、的氢离子浓度，从而推算出测试溶液的pH。 0062 (2)在含有10 M RGSBD探针的乙醇和PBS(体积比为1:1)混合溶液中(pH7.0)，加入10倍量的Na+、 Zn2+、 Fe3+、 Al3+、 K+、 Cu2+、 Fe2+、 Cr3+、 Ca2+和Co2+，观察荧光光谱的变化，然后与 RGSBD探针在pH值为1.9的缓冲体系中的荧光光谱进行比较，结果发现，只有氢离子会使探针的荧光显著增强，而其它离子对该探针几乎不响应。为了进一步评估其它离子对RGSBD探针响应氢离子的影响，在pH1.9的缓冲液中，先加入RGSBD探针(10 M)，接着加入100 M的各。

29、种金属离子，测得荧光强度(F)，最后与只含氢离子的初始荧光强度(F0)作比较，同样发现常见金属离子不干扰RGSBD探针对氢离子的传感效应(图4， F/F0的比值在可接受的范围之内)，表明该探针的选择性较强。 0063 (3)由于有些荧光分子探针与检测离子选择性结合之后，结构发生改变，从而使荧光强度的变化不再可逆，限制了荧光分子探针检测生物体内酸碱性的应用价值，故本实验探究了RGSBD探针对氢离子的光学传感是否具有可逆性，如图5所示。向pH1.9的强酸性缓冲液中缓慢加入氢氧化钠溶液至溶液体系被中和到中性环境即pH7.0，之后再次用盐酸酸化中性溶液至pH1.8，。

30、多次在这两个pH值处循环反复测定探针的荧光发射光谱，可以看出10次循环之后， RGSBD探针荧光强度并没有受到影响，意味着该探针螺酰胺环可以在开环和关闭状态之间自由切换，而且当探针所处的溶液环境中氢离子浓度变化时，探针的颜色也在浅黄色和玫瑰红色之间不断变换，表明RGSBD探针具备良好的重现性和稳定性，有应用说明书 5/6 页 7 CN 108892672 A 7 于生物体内pH值的响应和检测的潜力。说明书 6/6 页 8 CN 108892672 A 8 图1 图2 说明书附图 1/3 页 9 CN 108892672 A 9 图3 图4 说明书附图 2/3 页 10 CN 108892672 A 10 图5 说明书附图 3/3 页 11 CN 108892672 A 11 。

摘要
申请专利号：	CN201810990071.9	申请日：	20180828
公开号：	CN108892672A	公开日：	20181127
当前法律状态：		有效性：	审查中
法律详情：
IPC分类号：	C07D491/107,C09K11/06,G01N21/64,G01N21/78	主分类号：	C07D491/107,C09K11/06,G01N21/64,G01N21/78
申请人：	安徽工业大学
发明人：	吴芳辉,杨俊卿,孙文斌,张奎,魏先文
地址：	243002 安徽省马鞍山市花山区湖东中路59号
优先权：	CN201810990071A
专利代理机构：	安徽知问律师事务所	代理人：	杜袁成
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内容摘要

本发明公开了一种用于pH荧光传感的罗丹明6G席夫碱衍生物的制备方法，属于无机材料合成技术领域。该方法先由罗丹明6G和水合肼于乙醇中加热回流反应制备罗丹明6G酰肼前驱体，接着与2,5‑二甲氧基苯甲醛在甲醇中以乙酸为催化剂合成得到2,5‑二甲氧基苯甲醛罗丹明6G席夫碱粗产物，多次萃取并重结晶后制得目标产物。该合成方法简单，原材料价格低廉，条件温和，采用绿色无污染溶剂，产物分离纯化方便，结构新颖。将该产物作为荧光分子探针用于对氢离子的识别灵敏度高，可以通过荧光显著变化定量检测一定浓度的氢离子，常见的金属离子不干扰对氢离子的响应，而且该pH型荧光分子探针的稳定性和可逆性良好，具有潜在的生物应用前景。

权利要求书

1.一种用于pH荧光传感的罗丹明6G席夫碱衍生物的制备方法，其特征在于，将0.96～1.44g罗丹明6G和2.5～3.5mL质量百分含量为85％的水合肼在25～35mL乙醇中于80～90℃加热回流反应4～8h，充分冷却后析出沉淀，抽滤，干燥，所得产物用蒸馏水洗涤，40～50℃真空干燥2～3h后在乙醇中重结晶并再次抽滤干燥得到罗丹明6G酰肼；接着称取一定量的罗丹明6G酰肼与2,5-二甲氧基苯甲醛并滴加1～3滴乙酸作为催化剂在25～35mL乙醇中于80～90℃情况下加热回流反应4～8h，胺醛缩合生成大量沉淀，冷却、低压旋转蒸发去除溶剂，然后将粗产品用乙酸乙酯萃取，并在乙醇中重结晶，最后于40～50℃真空干燥4～6h得到目标产物罗丹明6G席夫碱衍生物；所述罗丹明6G酰肼与2,5-二甲氧基苯甲醛的摩尔比为1:3.5～4.5；所述罗丹明6G化合物的母体结构式如下： 2.如权利要求1所述制备方法得到的罗丹明6G席夫碱衍生物作为荧光分子探针在识别和定量检测氢离子中的应用。

说明书

技术领域

本发明属于无机材料合成技术领域，具体涉及一种简便制备罗丹明6G席夫碱类荧光传感材料的制备方法及其应用。

背景技术

作为细胞健康的一个重要指标，氢离子在细胞增殖、细胞凋亡、离子转运，细胞自噬以及生物酶活性等一系列细胞活动中充当着重要的生理作用。人体内pH值的微小变化可导致细胞功能障碍，从而产生严重的疾病，如癌症、中风和阿尔茨海默病等。因此,生物体内氢离子的识别和定量检测对于了解细胞的生理及药理过程，探索生命的奥秘具有较大的研究价值。近年来，文献报道了多种针对氢离子的检测方法，如酸碱滴定法、电位滴定法和光谱法等。相比较而言，荧光分析法因为操作简单、灵敏度高、选择性好和细胞无损实时检测等众多优点而受到广大科研人员的关注。

罗丹明类衍生物是以氧杂蒽环为主体骨架的分子，有开环和闭环两种互变分子结构，作为荧光分子探针时对环境的pH值高度敏感，即在一定的酸性环境下，罗丹明螺环呈开环状态，此时整个分子是共轭的，因此在可见区有很强的吸收且荧光强度较强。而在碱性条件下，罗丹明呈现闭环状态，此时整个分子是非共轭的，在可见区的吸收且荧光强度较弱，利用罗丹明衍生物的这一特点，可以设计和开发出对氢离子有响应的新型结构，故而决定了罗丹明衍生物成为生物医学、化学分析等领域的研究热点之一。

席夫碱化合物是指结构中包含有亚胺基或者亚胺性质基团的有机物，合成方法简单，实验操作易行，一步胺醛缩合反应就能生成，因为其氮原子上的孤对电子加上独特的光、电和磁性，使得席夫碱化合物常用作配体生成配合物或者广泛用于催化领域。利用席夫碱基团良好的受体特征协同罗丹明化合物优异的发光性能，可以通过胺醛缩合构建一种新型的罗丹明席夫碱衍生物荧光分子探针。有望改善传统pH荧光探针原材料价格昂贵，合成步骤繁琐，反应条件苛刻，探针分子水溶性不高，荧光传感灵敏度低，识别选择性差，测试环境毒性强以及探针稳定性不好等缺陷。

发明内容

本发明的目的在于克服现有的技术中荧光分子探针合成过程复杂，反应温度较高，原材料价格昂贵，耗时长、提纯分离困难、荧光传感灵敏度和选择性低、无法定量检测，探针稳定性不好等缺点，通过简单、温和的反应条件，以乙醇作为绿色无污染反应溶剂和测试溶剂，制备分离出优良性能的罗丹明6G席夫碱衍生物荧光分子探针，使得其与在一定pH值环境中，表现出显著的荧光变化，并且常见的金属离子几乎不干扰测定，从而实现高灵敏度和高选择性识别及定量检测氢离子的作用。

本发明所提供的一种简便制备罗丹明6G席夫碱衍生物的方法，其合成路线如图1所示。其中第一步反应中将一定量的罗丹明6G和过量的水合肼(质量百分含量为85％)在乙醇溶剂中溶解后加热回流反应，充分冷却后析出沉淀，抽滤，干燥，所得产物用蒸馏水洗涤后在乙醇中重结晶并再次抽滤干燥得到罗丹明6G酰肼前驱体；第二步反应是称取一定量的罗丹明6G酰肼与2,5-二甲氧基苯甲醛并滴加乙酸做催化剂在甲醇溶剂中加热回流反应，胺醛缩合生成大量沉淀，冷却、低压旋转蒸发去除溶剂，然后将粗产品用乙酸乙酯萃取三次，并在乙醇中重结晶，最后真空干燥得到目标产物罗丹明6G席夫碱衍生物。

上述罗丹明6G席夫碱衍生物可作为荧光分子探针在识别和定量检测氢离子中加以应用。

上述荧光分子探针的发色基团为罗丹明6G化合物，而受体为席夫碱化合物。

本发明所使用的罗丹明6G席夫碱衍生物采用溶液合成法制备，参考相关材料(Chen X,Sun W,Bai Y,Zhang F,Zhao J,Ding X.Novel rhodamine Schiff base type naked-eye fluorescent probe for sensing Fe3+and the application in cell.Spectrochimica Acta Part A:Molecular and Biomolecular Spectroscopy，2018,191:566-572.)

本发明的科学原理：

采用激发和发射波长均在可见光区，荧光量子产率较高，摩尔吸光系数较大，细胞穿透能力强等优点的氧杂蒽类中的罗丹明6G衍生物通过胺醛缩合构建含有生物毒性小、光电性能优良的席夫碱基团的新型荧光分子探针，研究了七对氢离子的响应，结果发现当该探针与高浓度的氢离子作用后，会使其荧光强度迅速显著增强，表明罗丹明6G席夫碱衍生物与氢离子结合后，发生了结构内部螺酰胺环的开环反应，形成了大的共轭结构，导致荧光强度产生明显的变化，其它金属离子不干扰该分子探针对氢离子的响应，而且分子探针的重现性和稳定性好，可发展用于特异性识别和定量检测环境中的酸碱性。

与其它pH型荧光传感分子探针材料的合成方法和应用相比，本发明罗丹明6G席夫碱衍生物(RGSBD)荧光分子探针具有以下技术效果：

1、反应过程较简单，原材料价格低廉，用量较少；反应条件比较温和，节能减耗；

2、制备后处理过程简单，易于分离提纯；

3、反应溶剂和检测溶剂几乎无毒性，对人和环境友好；

4、对氢离子的光学响应灵敏(在PH值为1.9时，荧光强度达到2500a.u.)，识别选择性好(只有氢离子会使探针的荧光显著增强，而其它离子对该探针几乎不响应)；

5、本发明RGSBD探针的荧光变化差值与体系的pH值在1.9～3.2范围之间呈良好的线性关系，因此根据该线性关系，可以定量检测一定浓度范围内的氢离子浓度；

6、该分子探针具有优异的重现性，稳定性好(向pH＝1.9的强酸性缓冲液中缓慢加入氢氧化钠溶液至溶液体系被中和到中性环境即pH＝7.0，之后再次用盐酸酸化中性溶液至pH＝1.8，多次在这两个pH值处循环反复测定探针的荧光发射光谱，10次循环之后，RGSBD探针荧光强度并没有受到影响)，因而有应用于生物体内pH值的响应和检测的潜力。

附图说明

图1为本发明罗丹明6G席夫碱衍生物荧光分子探针的合成路线图。

图2为本发明罗丹明6G席夫碱衍生物荧光分子探针在不同pH环境下的荧光光谱。

图3为本发明罗丹明6G席夫碱衍生物荧光分子探针的荧光强度变化值与体系pH值之间的线性校正关系图。

图4为其它离子对罗丹明6G席夫碱衍生物荧光分子探针响应氢离子的影响。

图5为本发明罗丹明6G席夫碱衍生物荧光分子探针对体系pH值响应的重复性实验结果。

具体实施方式

本发明的实质特点和显著效果可以从下述的实施例中得以体现，但它们并不对本发明作任何限制，本领域的技术人员根据本发明的内容做出一些非本质的改进和调整，均属于本发明的保护范围。下面通过具体实施方式对本发明作进一步的说明，其中实施例中反应产物的核磁数据测试表征使用的是德国Bruker公司的型号为AVANCE-III 400MHz的核磁共振仪(TMS为内标)；红外光谱测试表征采用美国Nicolet/Nexus-870FT-IR型红外光谱仪(KBr压片)；使用美国Perkin Elmer LS55型荧光光谱仪和美国WinASPECT PLUS2000型紫外光谱仪分别测定荧光和紫外可见吸收光谱。

一、本发明新型罗丹明6G席夫碱衍生物的合成方法

实施例1

(1)将0.889g罗丹明6G(2mmol)溶于25mL乙醇中，加入2.5mL过量的水合肼(85％)，加热至80℃冷凝回流反应8小时，冷却后抽滤干燥得到罗丹明6G酰肼粗产品。

(2)将罗丹明6G酰肼粗产品用蒸馏水洗涤三次，40℃真空干燥3小时后溶于乙醇中重结晶并再次抽滤干燥得到罗丹明6G酰肼前驱体。

(3)称取0.214g罗丹明6G酰肼(0.5mmol)与0.291g 2,5-二甲氧基苯甲醛(1.75mmol)并滴加1滴乙酸做催化剂在25mL乙醇中于80℃情况下加热回流反应8小时，胺醛缩合生成大量沉淀。

(4)冷却、低压旋转蒸发去除溶剂，然后将粗产品用乙酸乙酯萃取三次，并在乙醇中重结晶，最后于40℃真空干燥6小时得到目标产物罗丹明6G席夫碱衍生物。

实施例2

(1)将1.334g罗丹明6G(3mmol)溶于35mL乙醇中，加入3.5mL过量的水合肼(85％)，加热至90℃冷凝回流反应4小时，冷却后抽滤干燥得到罗丹明6G酰肼粗产品。

(2)将罗丹明6G酰肼粗产品用蒸馏水洗涤三次，50℃真空干燥2小时后溶于乙醇中重结晶并再次抽滤干燥得到罗丹明6G酰肼前驱体。

(3)称取0.214g罗丹明6G酰肼(0.5mmol)与0.374g 2,5-二甲氧基苯甲醛(2.25mmol)并滴加3滴乙酸做催化剂在35mL乙醇中于90℃情况下加热回流反应4小时，胺醛缩合生成大量沉淀。

(4)冷却、低压旋转蒸发去除溶剂，然后将粗产品用乙酸乙酯萃取三次，并在乙醇中重结晶，最后于50℃真空干燥4小时得到目标产物罗丹明6G席夫碱衍生物。

实施例3

(1)将1.111g罗丹明6G(2.5mmol)溶于30mL乙醇中，加入3mL过量的水合肼(85％)，加热至85℃冷凝回流反应6小时，冷却后抽滤干燥得到罗丹明6G酰肼粗产品。

(2)将罗丹明6G酰肼粗产品用蒸馏水洗涤三次，50℃真空干燥2小时后溶于乙醇中重结晶并再次抽滤干燥得到罗丹明6G酰肼前驱体。

(3)称取0.214g罗丹明6G酰肼(0.5mmol)与0.332g 2,5-二甲氧基苯甲醛(2mmol)并滴加2滴乙酸做催化剂在30mL乙醇中于85℃情况下加热回流反应6小时，胺醛缩合生成大量沉淀。

(4)冷却、低压旋转蒸发去除溶剂，然后将粗产品用乙酸乙酯萃取三次，并在乙醇中重结晶，最后于45℃真空干燥5小时得到目标产物罗丹明6G席夫碱衍生物。

实施例4

(1)将0.889g罗丹明6G(2mmol)溶于30mL乙醇中，加入3mL过量的水合肼(85％)，加热至80℃冷凝回流反应7小时，冷却后抽滤干燥得到罗丹明6G酰肼粗产品。

(2)将罗丹明6G酰肼粗产品用蒸馏水洗涤三次，45℃真空干燥2小时后溶于乙醇中重结晶并再次抽滤干燥得到罗丹明6G酰肼前驱体。

(3)称取0.214g罗丹明6G酰肼(0.5mmol)与0.332g 2,5-二甲氧基苯甲醛(2mmol)并滴加2滴乙酸做催化剂在25mL乙醇中于85℃情况下加热回流反应5小时，胺醛缩合生成大量沉淀。

(4)冷却、低压旋转蒸发去除溶剂，然后将粗产品用乙酸乙酯萃取三次，并在乙醇中重结晶，最后于40℃真空干燥6小时得到目标产物罗丹明6G席夫碱衍生物。

实施例5

(1)将1.334g罗丹明6G(3mmol)溶于25mL乙醇中，加入3.5mL过量的水合肼(85％)，加热至90℃冷凝回流反应7小时，冷却后抽滤干燥得到罗丹明6G酰肼粗产品。

(2)将罗丹明6G酰肼粗产品用蒸馏水洗涤三次，50℃真空干燥2小时后溶于乙醇中重结晶并再次抽滤干燥得到罗丹明6G酰肼前驱体。

(3)称取0.214g罗丹明6G酰肼(0.5mmol)与0.332g 2,5-二甲氧基苯甲醛(2mmol)并滴加2滴乙酸做催化剂在30mL乙醇中于80℃情况下加热回流反应7小时，胺醛缩合生成大量沉淀。

(4)冷却、低压旋转蒸发去除溶剂，然后将粗产品用乙酸乙酯萃取三次，并在乙醇中重结晶，最后于50℃真空干燥5小时得到目标产物罗丹明6G席夫碱衍生物。

实施例6

(1)将0.889g罗丹明6G(2mmol)溶于25mL乙醇中，加入2.5mL过量的水合肼(85％)，加热至85℃冷凝回流反应6小时，冷却后抽滤干燥得到罗丹明6G酰肼粗产品。

(2)将罗丹明6G酰肼粗产品用蒸馏水洗涤三次，50℃真空干燥2小时后溶于乙醇中重结晶并再次抽滤干燥得到罗丹明6G酰肼前驱体。

(3)称取0.214g罗丹明6G酰肼(0.5mmol)与0.374g 2,5-二甲氧基苯甲醛(2.25mmol)并滴加3滴乙酸做催化剂在30mL乙醇中于90℃情况下加热回流反应6小时，胺醛缩合生成大量沉淀。

(4)冷却、低压旋转蒸发去除溶剂，然后将粗产品用乙酸乙酯萃取三次，并在乙醇中重结晶，最后于50℃真空干燥5小时得到目标产物罗丹明6G席夫碱衍生物。

目标产物表征：产率：0.101g，35％。1H NMR(400MHz，DMSO)δ(PPM)：8.85-8.75(s,J＝2Hz,1H)，7.95-7.85(d,J＝2Hz,2H)，7.70-7.50(m,J＝4Hz,2H)，7.10-7.00(s,J＝2Hz,2H)，6.95-6.85(s,J＝2Hz,2H)，3.5-3.4(m,J＝2Hz,2H)，3.15-3.05(s，J＝2Hz,4H)，1.9-1.7(s,J＝4Hz,6H)，1.30-1.10(m,J＝4Hz,6H)，1.10-1.00(m,J＝2Hz,2H)。

二、本发明罗丹明6G席夫碱衍生物对氢离子的荧光传感效果评价

以目标产物为分子探针，研究对氢离子的荧光传感响应效果。

(1)将罗丹明6G席夫碱衍生物(RGSBD)(40μM)溶解于不同pH值的乙醇和PBS(体积比为1:1)混合溶液中，观察RGSBD的荧光光谱变化情况，如图2所示。可以看出，随着pH值的不断下降，即氢离子浓度的不断增大，该探针的荧光逐渐增强，当体系的pH值达到1.9时，探针的荧光强度达到最高值，而且肉眼观察到探针颜色也由原本的浅黄色迅速转换为玫瑰红色，这表明探针的螺酰胺环由关闭状态迅速打开后形成巨大的共轭平面结构，导致探针的颜色和荧光强度显著变化，探针整体与氢离子结合的过程与共轭酸碱对相类似。之后随着pH值的进一步降低，荧光强度反而下降。这是因为溶液内与RGSBD结合的氢离子浓度达到饱和，反而引起了荧光强度下降。另外还观察到随着pH值的不断下降，RGSBD探针的最大荧光峰位置也发生了细微的红移，从开始的547nm处红移至554nm，这是由于罗丹明类探针的特殊结构所导致。

根据上述荧光滴定实验观察图可知，当体系的pH值大于4时，RGSBD探针的荧光强度几乎变化不大，当体系的pH值小于4时，出现了变化的拐点，荧光开始明显急剧增加。表明只有当溶液中氢离子浓度升高至与RGSBD探针形成足够大的共轭体系时，才会产生强烈的荧光。根据罗丹明类pH探针的文献(Maozhong Tian,Xiaojun Peng,Jiangli Fan,Jingyun Wang,Shiguo Sun.A fluorescent sensor for pH based on rhodamine fluorophore,Dyes and Pigments 95(2012)112-115.)得知，此类探针属于共轭酸碱对体系，故采用Hendreson-Hasselbach方程，计算出RGSBD探针的酸性结合常数pKa为4.811。

进一步研究发现，RGSBD探针的荧光变化差值(ΔF＝F-F0，F为RGSBD分子探针在不同pH值环境中的荧光强度，F0为RGSBD分子探针在pH值为7.0环境中的荧光强度)与体系的pH值在1.9～3.2范围之间呈良好的线性关系，如图3所示，拟合出线性方程ΔF＝-2883.18pH-9649.73,线性相关系数为0.9915。因此根据该线性方程，可以定量检测一定浓度范围内的氢离子浓度，从而推算出测试溶液的pH。

(2)在含有10μM RGSBD探针的乙醇和PBS(体积比为1:1)混合溶液中(pH＝7.0)，加入10倍量的Na+、Zn2+、Fe3+、Al3+、K+、Cu2+、Fe2+、Cr3+、Ca2+和Co2+，观察荧光光谱的变化，然后与RGSBD探针在pH值为1.9的缓冲体系中的荧光光谱进行比较，结果发现，只有氢离子会使探针的荧光显著增强，而其它离子对该探针几乎不响应。为了进一步评估其它离子对RGSBD探针响应氢离子的影响，在pH＝1.9的缓冲液中，先加入RGSBD探针(10μM)，接着加入100μM的各种金属离子，测得荧光强度(F)，最后与只含氢离子的初始荧光强度(F0)作比较，同样发现常见金属离子不干扰RGSBD探针对氢离子的传感效应(图4，F/F0的比值在可接受的范围之内)，表明该探针的选择性较强。

(3)由于有些荧光分子探针与检测离子选择性结合之后，结构发生改变，从而使荧光强度的变化不再可逆，限制了荧光分子探针检测生物体内酸碱性的应用价值，故本实验探究了RGSBD探针对氢离子的光学传感是否具有可逆性，如图5所示。向pH＝1.9的强酸性缓冲液中缓慢加入氢氧化钠溶液至溶液体系被中和到中性环境即pH＝7.0，之后再次用盐酸酸化中性溶液至pH＝1.8，多次在这两个pH值处循环反复测定探针的荧光发射光谱，可以看出10次循环之后，RGSBD探针荧光强度并没有受到影响，意味着该探针螺酰胺环可以在开环和关闭状态之间自由切换，而且当探针所处的溶液环境中氢离子浓度变化时，探针的颜色也在浅黄色和玫瑰红色之间不断变换，表明RGSBD探针具备良好的重现性和稳定性，有应用于生物体内pH值的响应和检测的潜力。