技术领域
本发明涉及生产具有硫酸基和/或磷酸基的糖或者包含所述糖的化合物的方法。
背景技术
已知分子中含有硫酸基的糖具有多种生理作用。例如，已知硫酸软骨素和硫酸皮肤素(其为一类糖胺聚糖)作为蛋白多糖的侧链存在于细胞表面或细胞外基质中，并且根据硫酸化二糖单元的序列差异形成多种功能结构域以显示出多种生理功能。认为硫酸化糖与甚至在微量下在体内也显示出多种生理活性的许多细胞因子和生长因子具有高亲和力，并且用于定位这些因子以促进多种生理作用。
迄今为止，作为生产此类硫酸化糖的方法，开发了从天然产物(例如鲨鱼软骨)中收集硫酸化糖的方法、使用硫酸化试剂的方法(专利文献1至4)、使用酶的方法(专利文献5至7)、使用化学合成的方法(专利文献8和9)等。然而，就所生产的硫酸化糖的结构的均一性、生产效率等而言，这些方法中的任一种未必是充分的。
例如，当从天然产物中收集硫酸化糖时，认为所获得的硫酸化糖的结构通常不均一，并且难以控制混合在其中的污染物。使用硫酸化试剂的方法表现出低的反应性，并且高效的硫酸化是困难的。
使用酶的方法的缺点在于，用于引入硫酸基的位置或所使用的底物是有限的，等，并且所使用的酶也是昂贵的。因此，它不是一种经济的方法。此外，在通过化学合成由具有硫酸基的糖制备硫酸化糖的情况下，保护硫酸基是必须的，而硫酸基的保护和去保护是困难的。特别地，当目的糖是更高级聚合物时，硫酸基的去保护变得更加困难。
[引用列表]
[专利文献]
[专利文献1]日本专利特开No.2008-007643
[专利文献2]日本专利特开No.2007-332226
[专利文献3]日本专利特开No.2005-232064
[专利文献4]日本专利特开No.06-065273
[专利文献5]PCT国际公布No.02/103025的再公布
[专利文献6]日本专利特开No.2001-019698
[专利文献7]日本专利特开No.09-263595
[专利文献8]日本专利特开No.2014-047155
[专利文献9]PCT国际公布No.2013/141350的再公布
发明内容
技术问题
本发明的一个目的是提供高效地生产分子中具有硫酸基和/或磷酸基的糖或者包含所述糖的化合物的方法。
本发明的另一个目的是提供高效地生产分子中具有硫酸基和/或磷酸基的具有均一结构的糖的方法。
特别地，本发明的一个目的是提供能够高效地生产迄今为止被认为难以合成的包含具有硫酸基和/或磷酸基的糖的长链化合物的方法。
解决方案
为了实现所述目的，本申请的发明人努力地进行了研究。在使用化学合成的常规方法中，制备在期望位置处具有硫酸基的糖供体和糖接纳体并将其用于合成。因此，该方法能够控制所生产的硫酸化糖的结构，并因此在生产具有均一结构的硫酸化糖方面是有效的。然而，当在糖供体或糖接纳体的至少一种中具有硫酸基的糖用于缩合(糖基化)的化学合成时，已认为保护硫酸基是必须的。这已使常规方法复杂化，并且限制了包含硫酸化糖的化合物的生产路径的变化和可生产的化合物。因此，实际上不可能生产包含具有受控结构的长链硫酸化糖的化合物。此外，经保护的硫酸基具有吸电子特性，并因此也具有作为离去基团的功能，其问题在于可用的保护基和反应路径受到限制。
在这种情况下，本申请的发明人已尝试使用分子中具有未经保护的硫酸基的糖进行缩合反应，结果，他们已惊奇地发现即使将没有保护的硫酸基用于反应，也可生产具有受控结构的硫酸化糖或者包含它的化合物，从而完成了本发明。
与使用经保护的硫酸基的常规方法相比，本发明的生产方法显著地增多了可用的保护基和反应路径，因为硫酸基不具有作为离去基团的功能。因此，可比先前更容易且高效地生产硫酸化糖或者包含它的化合物，并且现在可合成迄今为止难以合成的硫酸化糖类或者包含它的化合物。本发明的生产方法对于合成具有均一结构的长链(例如，10个糖至100个糖)硫酸化糖或者包含它的化合物也是可用的。
除了制备具有硫酸基的糖的方法之外，本发明可直接应用于由具有未经保护的磷酸基的糖供体或糖接纳体制备具有磷酸基的糖的方法。
因此，一方面，本发明提供了生产具有硫酸基和/或磷酸基的糖的方法。在一个实施方案中，该生产方法的特征在于包括以下步骤：
(a)制备“具有未经保护的硫酸基和/或未经保护的磷酸基的第一糖”和“具有未经保护的硫酸基和/或未经保护的磷酸基的第二糖”的步骤，以及
(b)使步骤(a)中制备的第一糖和第二糖彼此缩合的步骤。
此外，在本发明的一个实施方案中，第一糖和第二糖的特征在于各自为在糖的1-位碳原子处具有离去基团并且具有亲核基团的糖。
此外，在本发明的一个实施方案中，第一糖和第二糖的特征在于是相同的糖。
此外，在本发明的一个实施方案中，亲核基团的特征在于选自羟基、氨基和巯基。
此外，在本发明的一个实施方案中，第一糖和第二糖的特征在于各自为构成6-元环的糖，并且在糖的1-位碳原子处具有离去基团，至少在糖的第2、3、4或6位的任意处具有亲核基团，并且至少在糖的第2、3、4或6位的任意处具有至少一个未经保护的硫酸基。
此外，在本发明的一个实施方案中，第一糖和第二糖的特征在于各自为构成6-元环的糖，并且在糖的1-位碳原子处具有离去基团，至少在糖的第3或4位的任意处具有亲核基团，并且至少在糖的第2、4或6位的任意处具有未经保护的硫酸基。
此外，在本发明的一个实施方案中，第一糖和第二糖的特征在于如下式所示：
[式1]
其中
L为离去基团；
A选自氢原子、经保护或未经保护的羧基、经保护或未经保护的酰胺基团、以及-CH2-R4；
R1至R4各自独立地选自氢原子、未经保护的硫酸基、未经保护的磷酸基、经保护或未经保护的羟基、经保护或未经保护的氨基、经保护或未经保护的巯基、以及糖残基；
R1至R4中的至少一个为未经保护的硫酸基或未经保护的磷酸基；并且
R1至R4中的至少一个为选自羟基、氨基和巯基的亲核基团。
此外，在本发明的一个实施方案中，其特征在于在上式中，
A为-CH2-R4；
R2至R4选自未经保护的硫酸基、未经保护的磷酸基、经保护或未经保护的羟基、以及糖残基，
前提是R2至R4中的至少一个为未经保护的硫酸基或未经保护的磷酸基；并且
R1为经保护或未经保护的氨基。
此外，在本发明的一个实施方案中，糖残基的特征在于是葡萄糖醛酸残基。在本发明的另一个实施方案中，糖残基的特征在于是在糖的2-位碳原子处具有硫酸基的葡萄糖醛酸残基。
此外，在本发明的另一个实施方案中，第一糖和第二糖的特征在于如下式所示：
[式2]
或
其中
L为离去基团；
A和B各自独立地选自氢原子、经保护或未经保护的羧基、经保护或未经保护的酰胺基团、以及-CH2-R6；
R1至R6各自独立地选自氢原子、未经保护的硫酸基、未经保护的磷酸基、经保护或未经保护的羟基、经保护或未经保护的氨基、经保护或未经保护的巯基、以及糖残基；
R1至R6中的至少一个为未经保护的硫酸基或未经保护的磷酸基；并且
R1至R6中的至少一个为选自羟基、氨基和巯基的亲核基团。
此外，在本发明的一个实施方案中，其特征在于在上式中，
A为-CH2-R6；以及
B为经保护或未经保护的羧基；
R2至R6各自独立地选自未经保护的硫酸基、未经保护的磷酸基和经保护或未经保护的羟基、以及糖残基，
前提是R2至R6中的至少一个为未经保护的硫酸基或未经保护的磷酸基；并且
R1为经保护或未经保护的氨基。
此外，在本发明的一个实施方案中，本发明的生产方法的特征在于是生产具有2个糖(二糖)至100个糖(百糖)的多糖的方法。
此外，在本发明的一个实施方案中，本发明的生产方法的特征在于是生产硫酸软骨素或硫酸类肝素的方法。
另一方面，本发明涉及生产包含具有硫酸基和/或磷酸基的糖的化合物的方法。该生产方法的特征在于包括以下步骤：
(a1)制备“具有未经保护的硫酸基和/或未经保护的磷酸基的第一糖”的步骤，以及
(b1)使步骤(a1)中制备的第一糖和“具有亲核基团的化合物”缩合的步骤。
此外，在本发明的一个实施方案中，第一糖的特征在于是在糖的第1位处具有离去基团的糖。
此外，在本发明的一个实施方案中，所述方法的特征在于包括(c1)使步骤(b1)中制备的“包含具有硫酸基和/或磷酸基的糖的化合物”与选自以下的化合物进一步缩合的步骤：“具有未经保护的硫酸基和/或未经保护的磷酸基的糖”、“具有亲核基团的化合物”以及步骤(b1)中制备的“包含具有硫酸基和/或磷酸基的糖的化合物”。
此外，在本发明的一个实施方案中，亲核基团的特征在于选自羟基、氨基和巯基。此外，在本发明的一个实施方案中，具有亲核基团的化合物的特征在于选自糖、氨基酸、肽、蛋白质、及其衍生物。
此外，在本发明的一个实施方案中，“具有未经保护的硫酸基和/或未经保护的磷酸基的糖”的特征在于是构成6-元环的糖，并且在糖的1-位碳原子处具有离去基团，至少在糖的第2、3、4或6位的任意处具有亲核基团，并且至少在糖的第2、3、4或6位的任意处具有至少一个未经保护的硫酸基。
此外，在本发明的一个实施方案中，第一糖的特征在于是构成6-元环的糖，并且在糖的1-位碳原子处具有离去基团，至少在糖的第3或4位的任意处具有亲核基团，并且至少在糖的第2、4或6位的任意处具有未经保护的硫酸基。
此外，在本发明的一个实施方案中，第一糖的特征在于为具有如下式所示结构的化合物：
[式3]
其中
L为离去基团；
A选自氢原子、经保护或未经保护的羧基、经保护或未经保护的酰胺基团、以及-CH2-R4；
R1至R4各自独立地选自氢原子、未经保护的硫酸基、未经保护的磷酸基、经保护或未经保护的羟基、经保护或未经保护的氨基、经保护或未经保护的巯基、以及糖残基；
R1至R4中的至少一个为未经保护的硫酸基或未经保护的磷酸基；并且R1至R4中的至少一个具有选自羟基、氨基和巯基的亲核基团。
此外，在本发明的一个实施方案中，其特征在于在上式中，
A为-CH2-R4；
R3选自未经保护的硫酸基、未经保护的磷酸基、经保护或未经保护的羟基、以及糖残基；
R4选自未经保护的硫酸基、未经保护的磷酸基和经保护或未经保护的羟基，
前提是R4和R3中的至少一个为未经保护的硫酸基或未经保护的磷酸基；
R1为经保护或未经保护的氨基；并且
R2为未经保护的羟基或糖残基。
本领域技术人员将理解，任选地组合上述本发明的一个或更多个特征的任何发明也在本发明的范围内。
发明的有益效果
根据本发明的生产方法，可高效地生产具有硫酸基和/或磷酸基的糖或者包含所述糖的化合物。
此外，根据本发明的生产方法，可高效地生产分子中具有硫酸基和/或磷酸基的具有均一结构的糖。
此外，根据本发明的生产方法，可比先前更容易且高效地生产包含硫酸化糖和/或磷酸化糖的化合物，因为用于生产具有硫酸基和/或磷酸基的糖或者包含所述糖的化合物的反应路径和可用的保护基急剧增多。本发明的生产方法对于合成迄今为止被认为难以生产的具有长链均一结构的硫酸化糖和/或磷酸化糖或者包含它的化合物是可用的。
具体实施方式
“糖”或“糖残基”在本文中意指由以链形式连接的一个或更多个单元糖(单糖和/或其衍生物)构成的化合物(在本文中也称作“糖链”)。当连接两个或更多个单元糖时，单元糖在其间经由糖苷键通过脱水缩合而键合。此类糖链的实例广泛地包括活体中所含的单糖和多糖(葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖(fucose)、木糖、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺、唾液酸、及其复合物或衍生物)，以及降解的多糖、以及由复合生物分子(例如糖蛋白、蛋白多糖、糖胺聚糖和糖脂)降解或衍生化的糖链，但不限于此。糖链可以是直链或支链的。
此外，“糖”或“糖残基”在本文中也包括糖的衍生物。作为糖的衍生物，包含其中糖的任意碳原子的羟基被另一取代基取代的糖，或通过与保护基或另一取代基键合而衍生化的糖。其实例包括构成糖链的糖为下述糖的糖链：具有羧基的糖(例如，C-1位被氧化成羧酸的醛糖酸(例如，由D-葡萄糖氧化的D-葡萄糖酸)、或者其中末端C原子变成羧酸的糖醛酸(例如，由D-葡萄糖氧化的D-葡萄糖醛酸))、具有氨基或氨基衍生物(例如，乙酰化氨基)的糖(例如，N-乙酰基-D-葡糖胺和N-乙酰基-D-半乳糖胺)、具有氨基和羧基二者的糖(例如，N-乙酰神经胺糖酸(唾液酸)和N-乙酰胞壁酸)、脱氧化糖(例如，2-脱氧-D-核糖)、含有硫酸基的硫酸化糖、以及含有磷酸基的磷酸化糖，但不限于此。
含有硫酸基的糖在本文中也被描述为“硫酸化糖”，并且含有磷酸基的糖也被描述为“磷酸化糖”。此外，具有硫酸基和磷酸基二者的糖也被描述为“硫酸化/磷酸化糖”。
在本发明中，特别地用于作为待生产目标的硫酸化糖、磷酸化糖和硫酸化/磷酸化糖的“均一结构”意味着为待缩合(或聚合)的糖或化合物的构成单元的糖骨架中的硫酸基的位置和数量、组成糖的类型以及糖之间键的类型是同等的。
应注意，在本文中描述“糖”、“糖残基”和“氨基酸”不区分D-异构体和L-异构体的情况下，应理解包括任何立体异构体。
下面将详细地描述本发明。
一方面，本发明涉及生产具有硫酸基和/或磷酸基的糖的方法，并且所述方法的特征在于包括以下步骤：
(a)制备“具有未经保护的硫酸基和/或未经保护的磷酸基的第一糖”和“具有未经保护的硫酸基和/或未经保护的磷酸基的第二糖”的步骤，以及
(b)使步骤(a)中制备的第一糖和第二糖彼此缩合的步骤。
用作本发明的生产方法中的原材料的“具有未经保护的硫酸基和/或未经保护的磷酸基的糖”在本文中是指这样的任选的糖：在任选碳原子处具有至少一个硫酸化羟基(-O-SO3H、-O-SO3-、-O-SO3Na或-O-SO3金属)或磷酸化羟基(-O-PO3H2或-O-PO32-)而不具有作为取代基的保护基。应注意，“硫酸基”和“硫酸化羟基”以及“磷酸基”和“磷酸化羟基”在本文中可互换使用。
在本发明的方法中，第一糖和第二糖被定义为任一种作为糖供体发挥作用而另一种作为糖接纳体发挥作用。对此，第一糖可作为糖供体发挥作用，而第二糖可作为糖接纳体发挥作用，或者反之亦然。此外，第一糖和第二糖可各自为单糖，或者具有二糖、三糖、四糖或更多糖的糖骨架。
如果糖在任意碳原子位置处具有离去基团，则保留作为糖供体的功能。在本发明的一个具体实施方案中，作为糖供体发挥作用的“具有未经保护的硫酸基和/或未经保护的磷酸基的(第一或第二)糖”是在1-位碳原子的位置处具有离去基团的糖。在该实施方案中，当作为糖供体发挥作用的糖具有含有两个或更多个糖的糖骨架时，糖供体在还原末端的1-位碳原子的位置处具有离去基团。
另一方面，如果糖在任意碳原子位置处具有亲核基团，则保留作为糖接纳体的功能。本发明中使用的术语“亲核”是指容易与路易斯酸的阳离子元素反应的性质。在本发明中，对亲核基团没有特别地限制，只要其是具有这种性质的官能团即可。在本发明中，亲核基团特别地为选自羟基、氨基或巯基的官能团。
在本发明的一个实施方案中，“具有未经保护的硫酸基和/或未经保护的磷酸基的(第一或第二)糖”可具有作为糖供体的功能和作为糖接纳体的功能二者。在这种情况下，“具有未经保护的硫酸基和/或未经保护的磷酸基的(第一或第二)糖”具有离去基团和亲核基团二者。在本发明的一个实施方案中，“具有未经保护的硫酸基和/或未经保护的磷酸基的(第一或第二)糖”是在1-位碳原子的位置处具有离去基团并且具有亲核基团的糖。
在本发明中，第一糖和第二糖可以是相同的糖或不同的糖。
在本发明的一个优选的实施方案中，第一糖和第二糖各自具有以下特性：
-构成6-元环；
-在糖的1-位碳原子处具有离去基团；
-至少在糖的第2、3、4或6位的任意处具有亲核基团；并且
-至少在糖的第2、3、4或6位的任意处具有至少一个未经保护的硫酸基或未经保护的磷酸基。
优选地，第一糖和第二糖在糖的第3或4位的任意处具有亲核基团，和/或至少在糖的第2、4或6位的任意处具有未经保护的硫酸基或未经保护的磷酸基。
在本发明的另一个优选的实施方案中，第一糖和第二糖各自为如下式所示的糖：
[式4]
其中
L为离去基团；
A选自氢原子、经保护或未经保护的羧基、经保护或未经保护的酰胺基团、以及-CH2-R4；
R1至R4各自独立地选自氢原子、未经保护的硫酸基、未经保护的磷酸基、经保护或未经保护的羟基、经保护或未经保护的氨基、经保护或未经保护的巯基、以及糖残基；
R1至R4中的至少一个为未经保护的硫酸基或未经保护的磷酸基；并且R1至R4中的至少一个为选自羟基、氨基和巯基的亲核基团。
在一个优选的实施方案中，A为-CH2-R4，R3和R4中的一个为未经保护的硫酸基或未经保护的磷酸基。在另一个优选的实施方案中，A为-CH2-R4，并且R3和R4二者为未经保护的硫酸基或未经保护的磷酸基。
在一个优选的实施方案中，所述式中的R1为经保护或未经保护的氨基。
在一个优选的实施方案中，所述式中的R2为未经保护的羟基或糖残基。
在一个尤其优选的实施方案中，在上式中：
A为-CH2-R4；
R3选自未经保护的硫酸基、未经保护的磷酸基、经保护或未经保护的羟基、以及糖残基；
R4选自未经保护的硫酸基、未经保护的磷酸基、以及经保护或未经保护的羟基，
前提是R4和R3中的至少一个为未经保护的硫酸基或未经保护的磷酸基；
R1为经保护或未经保护的氨基；并且
R2为未经保护的羟基或糖残基。
这种糖的实例包括但不限于具有未经保护的硫酸基和/或未经保护的磷酸基的葡糖胺和半乳糖胺，以及其中任选的糖残基与葡糖胺和半乳糖胺中的任一种键合的化合物。
在本发明的一个尤其优选的实施方案中，R2为葡萄糖醛酸残基。这种糖的实例包括但不限于为选自以下的糖胺聚糖的构成单元的二糖：软骨素-4-硫酸(硫酸软骨素A)、软骨素-6-硫酸(硫酸软骨素C)、硫酸皮肤素(硫酸软骨素B)和硫酸类肝素。
在本发明的另一个优选的实施方案中，R2是在糖的2-位碳原子处具有硫酸基的葡萄糖醛酸残基。这种糖的实例包括但不限于作为糖胺聚糖(例如硫酸软骨素D)的构成单元的二糖。
在本发明的另一个优选的实施方案中，第一糖和第二糖是相同的糖。
在本发明的另一个优选的实施方案中，第一糖和第二糖各自为如下式所示的糖：
[式5]
或
其中
L为离去基团；
A和B各自独立地选自氢原子、经保护或未经保护的羧基、经保护或未经保护的酰胺基团、以及-CH2-R6；
R1至R6各自独立地选自氢原子、未经保护的硫酸基、未经保护的磷酸基、经保护或未经保护的羟基、经保护或未经保护的氨基、经保护或未经保护的巯基、以及糖残基；
R1至R6中的至少一个为未经保护的硫酸基或未经保护的磷酸基；并且
R1至R6中的至少一个为选自羟基、氨基和巯基的亲核基团。
在上述实施方案中，当A和B二者为-CH2-R6时，A中的R6和B中的R6可彼此相同或不同。
在一个优选的实施方案中，A为-CH2-R6，和/或B为经保护或未经保护的羧基。优选地，A为-CH2-R6，并且R2、R3和R6中的任一个或两个为未经保护的硫酸基或未经保护的磷酸基。优选地，R4和R5为经保护或未经保护的羟基。
在另一个优选的实施方案中，A为经保护或未经保护的羧基，和/或B为-CH2-R6。优选地，B为-CH2-R6，并且R1、R5和R6中的任一个或两个为未经保护的硫酸基或未经保护的磷酸基。优选地，R4或R5为经保护或未经保护的羟基。
在另一个优选的实施方案中，在上式中：
A为-CH2-R6；
B为经保护或未经保护的羧基；
R2至R6各自独立地选自未经保护的硫酸基、未经保护的磷酸基和经保护或未经保护的羟基、以及糖残基，前提是R2至R6中的至少一个为未经保护的硫酸基或未经保护的磷酸基；并且
R1为经保护或未经保护的氨基。
在另一个优选的实施方案中，在上式中：
A为经保护或未经保护的羧基；
B为-CH2-R6；
R2为R6各自独立地选自未经保护的硫酸基、未经保护的磷酸基和经保护或未经保护的羟基、以及糖残基，前提是R2至R6中的至少一个为未经保护的硫酸基或未经保护的磷酸基；并且
R3为经保护或未经保护的氨基。
在一个尤其优选的实施方案中，在上式中：
A为-CH2-R6；
B为经保护或未经保护的羧基；
R2、R3和R6中的任一个或两个为未经保护的硫酸基或未经保护的磷酸基；
R4和R5为经保护或未经保护的羟基；并且
R1为经保护或未经保护的氨基。
在另一个尤其优选的实施方案中，在上式中：
A为经保护或未经保护的羧基；
B为-CH2-R6；
R1、R5和R6中的任一个或两个为未经保护的硫酸基或未经保护的磷酸基；
R4或R5为经保护或未经保护的羟基；并且
R3为经保护或未经保护的氨基。
上述糖的实例包括但不限于作为选自以下的糖胺聚糖的构成单元的二糖：软骨素-4-硫酸(硫酸软骨素A)、软骨素-6-硫酸(硫酸软骨素C)、硫酸皮肤素(硫酸软骨素B)、硫酸软骨素D和硫酸类肝素。
本发明的生产方法可包括使步骤(b)中缩合的糖与第三糖进一步缩合的步骤。所述“第三糖”可用作糖供体，或者用作糖接纳体，并且可以是与步骤(b)中缩合的糖相同的糖，或不同的糖。
在“步骤(b)中缩合的糖”和“第三糖”都不具有离去基团的情况下，为了进一步缩合，可进行将离去基团引入到任一糖中的处理。
在一个优选的实施方案中，步骤(c)进行多次。通过多次进行步骤(c)，可制备具有期望长度的糖，同时控制结构。
在本发明的生产方法包括进行一次或多次的步骤(c)的情况下，步骤(b)和进行一次或多次的步骤(c)可同时进行或者在不同的时间进行。当步骤(b)和进行多次的步骤(c)同时进行时，为了能够连续缩合(聚合)，优选使用在其还原末端的1-位碳原子的位置处具有离去基团并且具有亲核基团的糖作为“第一糖”、“第二糖”和“第三糖”。在该实施方案中，从生产具有受控结构的糖的观点来看，更优选使用具有未经保护的硫酸基和/或未经保护的磷酸基的相同糖用于“第一糖”、“第二糖”和“第三糖”。例如，制备在相同的位置处分别具有未经保护的硫酸基和/或未经保护的磷酸基、离去基团和亲核基团的具有相同结构的单糖的均一群体，并且单糖各自为缩合的(聚合的)，因此可生产具有受控结构的长链糖。
在一个示例性实施方案中，本发明的生产方法是这样的方法：作为用于“第一糖”、“第二糖”和“第三糖”的糖，由为软骨素A、软骨素C、软骨素D、软骨素E或硫酸类肝素的构成单元的二糖骨架构成的均一群体通过该方法制备和缩合(聚合)以生产如下式所示的硫酸软骨素或硫酸类肝素。
[式6]
[式7]
[式8]
[式9]
[式10]
在如上所示为软骨素A、软骨素C、软骨素D、软骨素E或硫酸类肝素的构成单元的二糖骨架中，毫无疑问，构成二糖骨架的氨基糖和糖醛酸的位置可颠倒。
举例来说，自然地预期本发明的生产方法包括生产如下所示硫酸类肝素的方法。
[式11]
在上式中，n为1至50，优选1至25，并且更优选1至10。
因此，在一个实施方案中，本发明的生产方法是生产含有2个糖至100个糖、优选2个糖至50个糖、且更优选2个糖至20个糖的硫酸化糖、磷酸化糖、或者硫酸化/磷酸化糖的方法。
另一方面，本发明的生产方法涉及生产包含具有硫酸基和/或磷酸基的糖的化合物的方法。在这个方面中，“具有亲核基团的化合物”代替“第二糖”使用并与“第一糖”缩合。
因此，在这个方面中，本发明的生产方法的特征在于包括：
(a1)制备“具有未经保护的硫酸基和/或未经保护的磷酸基的糖”的步骤，以及
(b1)使步骤(a1)中制备的“具有未经保护的硫酸基和/或未经保护的磷酸基的糖”和“具有亲核基团的化合物”缩合的步骤。
在这方面中，使用“具有未经保护的硫酸基和/或未经保护的磷酸基的糖”作为用于“具有亲核基团的化合物”的糖供体。因此，“具有未经保护的硫酸基和/或未经保护的磷酸基的糖”是具有离去基团的糖并且通常是在糖的1-位碳原子的位置处具有离去基团的糖。
“具有亲核基团的化合物”的“亲核基团”与上述定义相同并且是指具有容易与路易斯酸的阳离子元素反应的性质的任何官能团。在一个实施方案中，这种官能团选自羟基、氨基和巯基。对于“具有亲核基团的化合物”没有特别限制，只要它是具有亲核基团的化合物即可，并且例如，除了糖之外还包括氨基酸、肽和蛋白质。
在本发明中，“氨基酸”以其最广泛的意义来使用，且不仅包含：天然氨基酸，例如丝氨酸(Ser)、天冬酰胺(Asn)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、丙氨酸(Ala)、酪氨酸(Tyr)、甘氨酸(Gly)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、组氨酸(His)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、苏氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)和脯氨酸(Pro)；而且包含非天然氨基酸，例如氨基酸变体和衍生物。考虑到广泛定义，本领域技术人员将理解本发明中的氨基酸包括例如：L-氨基酸；D-氨基酸；经化学修饰的氨基酸，例如氨基酸变体和衍生物；不可以是体内构成蛋白质之材料的氨基酸，例如正亮氨酸、β-丙氨酸和鸟氨酸；以及本领域技术人员已知的具有氨基酸特性的化学合成的化合物。
氨基酸衍生物在本文中包括其中氨基酸的侧链取代基进一步被另一取代基取代的化合物，以及通过将保护基或另一取代基与例如氨基和羧基的官能团键合而衍生化的化合物。换言之，氨基酸衍生物在本文中用于通常表达氨基酸(包括衍生为这些实例的那些氨基酸)，但不旨在排除未衍生化的氨基酸。
肽或蛋白质的衍生物在本文中除了包含氨基酸衍生物的肽或蛋白质之外还包含通过将肽或蛋白质用酸、碱或酶部分地水解而获得的蛋白质水解产物；及其衍生物，例如阳离子化产物、酰化产物、烷基酯化产物和硅化产物。
在本发明的一个示例性实施方案中，构成步骤(b1)中制备的“包含具有硫酸基和/或磷酸基的糖的化合物”的分子数可以是2、3、4、5或更多。
在一个优选的实施方案中，本发明的生产方法包括(c1)使步骤(b1)中制备的“包含具有硫酸基和/或磷酸基的糖的化合物”与选自以下的化合物进一步缩合的步骤：“具有未经保护的硫酸基和/或未经保护的磷酸基的糖”、“具有亲核基团的化合物”和步骤(b1)中制备的“包含具有硫酸基和/或磷酸基的糖的化合物”。在这个实施方案中，进行进一步缩合的“包含具有硫酸基和/或磷酸基的糖的化合物”中的硫酸基和/或磷酸基是未经保护的。
在其中步骤(c1)是使步骤(b1)中制备的“包含具有硫酸基和/或磷酸基的糖的化合物”与“具有未经保护的硫酸基和/或未经保护的磷酸基的糖”缩合的步骤的情况下，可使用“包含具有硫酸基和/或磷酸基的糖的化合物”作为糖供体或者作为糖接纳体。在其中“包含具有硫酸基和/或磷酸基的糖的化合物”和“具有未经保护的硫酸基和/或未经保护的磷酸基的糖”都不具有离去基团的情况下，为了进一步缩合，可对它们中的任一种进行用于引入离去基团的处理。
在其中步骤(c1)是使步骤(b1)中制备的“包含具有硫酸基和/或磷酸基的糖的化合物”与“具有亲核基团的化合物”缩合的步骤的情况下，可使用“包含具有硫酸基和/或磷酸基的糖的化合物”作为糖供体。在其中“包含具有硫酸基和/或磷酸基的糖的化合物”不具有离去基团的情况下，为了进一步缩合，可进行用于引入离去基团的处理。
在其中步骤(c1)是使步骤(b1)中制备的“包含具有硫酸基和/或磷酸基的糖的化合物”与步骤(b1)中制备的“包含具有硫酸基和/或磷酸基的糖的化合物”缩合的步骤的情况下，使用具有离去基团以及亲核基团的化合物作为“包含具有硫酸基和/或磷酸基的糖的化合物”。在其中“包含具有硫酸基和/或磷酸基的糖的化合物”不具有离去基团的情况下，为了进一步缩合，可进行用于引入离去基团的处理。
在一个优选的实施方案中，步骤(c1)进行多次。通过多次进行步骤(c1)，可制备具有受控结构的期望长度的化合物。步骤(c1)可同时或在不同时间进行多次。
在本发明的生产方法中，在其中步骤(c1)同时进行多次的情况下，从生产具有受控结构的化合物的观点来看，步骤(c1)优选是使步骤(b1)中制备的“包含具有硫酸基和/或磷酸基的糖的化合物”与步骤(b1)中制备的“包含具有硫酸基和/或磷酸基的糖的化合物”缩合的步骤。例如，制备在相同位置处分别具有未经保护的硫酸基或/或未经保护的磷酸基、离去基团以及亲核基团的具有相同结构的化合物的均一群体，并且所述化合物各自为缩合的(聚合的)，因此可生产具有受控结构的长链化合物。
在本发明的一个示例性实施方案中，步骤(b1)中制备的“包含具有硫酸基和/或磷酸基的糖的化合物”为二糖、四糖、六糖、八糖、十糖或更多的糖。
在本发明的另一些示例性实施方案中，步骤(b1)中制备的“包含具有硫酸基和/或磷酸基的糖的化合物”是作为用于软骨素A、软骨素C、软骨素D、软骨素E或硫酸类肝素的构成单元的二糖骨架。
在本发明的一个示例性实施方案中，步骤(b1)中制备的“包含具有硫酸基和/或磷酸基的糖的化合物”是包含具有双分子骨架的硫酸化糖、磷酸化糖或硫酸化/磷酸化糖的化合物，并且在步骤(c1)中，基于作为缩合或聚合单元的双分子骨架，生产长度为4个分子、6个分子、8个分子、10个分子或更多的化合物。
在本发明的另一些示例性实施方案中，步骤(b1)中制备的“包含具有硫酸基和/或磷酸基的糖的化合物”是作为用于软骨素A、软骨素C、软骨素D、软骨素E或硫酸类肝素的构成单元的二糖、四糖、六糖、八糖、十糖或更多的糖，并且在步骤(c1)中，基于这些作为缩合或聚合单元的糖，生产更长链的糖胺聚糖。
在本发明的另一些示例性实施方案中，步骤(b1)中制备的“包含具有硫酸基和/或磷酸基的糖的化合物”是作为用于软骨素A、软骨素C、软骨素D、软骨素E或硫酸类肝素的构成单元的二糖，并且在步骤(c1)中，基于作为缩合或聚合单元的二糖，生产四糖、六糖、八糖、十糖或更多的具有一定长度的糖胺聚糖。
为本发明的原材料的“具有未经保护的硫酸基的糖”可通过本领域技术人员已知的任何方法制备。例如但不限于，其可通过使硫酸化剂作用于具有未经保护的羟基的给定糖来制备。具体地，其中可在适当的当量(1至100当量)、适当的反应温度(0至100℃)和反应时间(10分钟至2天)的条件下在合适的溶剂(例如DMF)中使硫酸化剂与作为原材料的具有未经保护的羟基的给定糖反应来合成羟基被硫酸化的糖。
可使用任何硫酸化剂，只要其用于使糖化合物硫酸化，并且其实例包括三氧化硫-吡啶复合物、三氧化硫-三甲胺复合物、氯磺酸-吡啶复合物和二环己基碳二亚胺-硫酸。优选的实例包括三氧化硫-吡啶复合物和三氧化硫-三甲胺复合物。
将硫酸基引入到选定位置的方法也是本领域技术人员已知的。例如，在与硫酸化剂反应之前，其中仅特定羟基被硫酸化的糖可通过选择性地保护未被硫酸化的羟基来制备。此外，通过使用能够将硫酸基引入到糖的特定位置的酶，还可将硫酸基引入到特定位置。
为本发明的原材料的“具有未经保护的磷酸基的糖”通常可以以与硫酸化相同的方式进行。即，其可通过使磷酸化剂作用于具有未经保护的羟基的给定糖来制备。合适的磷酸化剂的实例包括但不限于磷酸、多磷酸(polyphosphoric acid)、五氧化二磷和POCl3。
如果需要，可通过使用硅胶等的高效薄层色谱法或使用酰胺柱等的高效液相色谱法分离和纯化所获得的化合物。
在本发明中，缩合反应可根据本领域技术人员公知的方法进行。例如，在本发明中，缩合反应可通过使用其中糖供体和糖接纳体在酸的存在下反应的方法来进行。
可用于本发明的生产方法的酸的实例包括但不限于无机酸，例如硫酸、三氟化硼二乙醚(BF3-OEt2)、三氟甲磺酸二甲基(甲基硫基)硫(DMTST)、三氟甲磺酸三甲基甲硅烷基酯、三氟甲磺酸三乙基甲硅烷基酯、三氟甲磺酸三丙基甲硅烷基酯、三氟甲磺酸二甲基乙基甲硅烷基酯、三氟甲磺酸三苄基甲硅烷基酯、三氟甲磺酸三萘基甲硅烷基酯或三氟甲磺酸三苄基甲基甲硅烷基酯、三氟甲磺酸银、环戊二烯基氯化铪、环戊二烯基氯化锆、路易斯酸(例如氯化锡)；以及有机酸，例如甲酸、乙酸、三氟乙酸、三氟乙酸酐、三氟甲磺酸和四氟甲磺酸。
这些酸可单独或者以两种或更多种的组合使用。相对于糖供体，待用酸的量可以是0.1当量至5当量，例如0.2当量至1.5当量。在其中用作糖供体的糖或化合物以及用作糖接纳体的糖或化合物是彼此不同的化合物的情况下，糖供体与糖接纳体的使用比例可以是任意比例。例如，糖接纳体的使用比例可以是每摩尔糖供体0.2至10摩尔，并且优选0.7至4摩尔。
在本发明的一个实施方案中，在缩合反应中，活化剂(例如N-碘代琥珀酰亚胺)单独或与路易斯酸(例如四氟甲磺酸和三氟甲磺酸三甲基三硅烷基酯)组合使用。当活化剂与路易斯酸组合使用时，相对于糖供体，使用比例可以是例如路易斯酸为约0.1至2当量，并且活化剂为约1至5当量。
没有限制用于缩合反应的溶剂，只要它是对反应惰性的溶剂即可。其实例包括脂肪族烃，例如己烷、庚烷和戊烷；脂环族烃，例如环己烷；芳香族烃，例如苯、甲苯和二甲苯；卤代烃，例如二氯甲烷、氯仿、1，2-二氯乙烷、1，1，1-三氯乙烷、四氯乙烯、三氯乙烯、四氯化碳、氯苯和邻二氯苯；醚，例如二乙醚、异丙醚、四氢呋喃、二氧六环和单乙二醇二甲醚(Monoglyme)；酰胺，例如N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺和1，3-二甲基咪唑烷酮；亚砜，例如二甲基亚砜；腈，例如乙腈和丙腈；及其混合溶剂。
用于缩合反应的温度为-80℃至40℃，例如-40℃至25℃。
在本发明的生产方法中，如以下实施例所示，可通过控制缩合反应期间的反应温度来控制所生产的糖的三维结构。具体地，当缩合反应期间的温度在上述温度范围内较低时，倾向于获得由β-糖苷键结合的糖或者包含所述糖的化合物，并且当缩合反应期间的温度在上述温度范围内较高时，倾向于获得由α-糖苷键结合的糖或者包含所述糖的化合物。
优选在缩合反应之前除去体系中的水、氢卤酸等。为此目的，例如，可使用捕获材料(trapping material)(例如分子筛)。
本发明的生产方法可任选地包括将离去基团引入到“具有未经保护的硫酸基和/或未经保护的磷酸基的糖”或“包含具有硫酸基和/或磷酸基的糖的化合物”中的步骤。本发明中所使用的离去基团没有特别地限制，只要其在糖供体与糖接纳体之间的缩合反应条件下具有低于待被取代的原子或原子团的亲核性的亲核性，并且具有待被消除的能力即可。
用于本发明的离去基团的具体实例包括但不限于卤素原子、经取代或未经取代的-O-烷基、经取代或未经取代的-O-烯基、经取代或未经取代的-O-炔基、经取代或未经取代的-O-芳基、经取代或未经取代的-O-杂芳基、经取代或未经取代的-S-烷基、经取代或未经取代的-S-烯基、经取代或未经取代的-S-炔基、经取代或未经取代的-S-芳基、以及经取代或未经取代的-S-杂芳基。
离去基团的引入可根据常规方法来进行。例如，其可通过与卤化剂的卤化反应，或在酸或碱的存在下与硫醇化合物反应来进行。
可用于本发明的卤化剂的实例包括氯、溴、碘、N-氯代琥珀酰亚胺、N-溴代琥珀酰亚胺和溴化氢。
用于卤化反应的溶剂的实例可包括基于卤代烃的溶剂，例如二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、氯仿和四氯化碳；基于醚的溶剂，例如二乙醚、四氢呋喃和1，4-二氧六环；乙酸以及水。这些溶剂可单独使用，或者可使用多种溶剂的混合物。
硫醇化合物的实例包括甲硫醇、异丙硫醇、苯硫酚(thiophenol)和对甲苯硫醇。
酸的实例包括路易斯酸，例如三氟化硼二乙醚(BF3-OEt2)。同时，碱的实例包括1，3-二甲基咪唑氯化物和三乙胺。
用于与硫醇化合物反应的溶剂的实例包括但不限于二氯甲烷、乙腈和甲苯。这些溶剂可单独或组合使用。
本发明的生产方法可任选地包括“具有未经保护的硫酸基和/或未经保护的磷酸基的糖”或“包含具有硫酸基和/或磷酸基的糖的化合物”中的侧链中的羟基、氨基等的保护和去保护的步骤。
本领域技术人员可根据所选择的反应路径从本领域中已知的保护基中适当地选择合适的保护基。
在本发明的生产方法中，用于羟基的保护基的实例可包括甲基、苄基、苯甲酰基、乙酰基(Ac)、三甲基甲硅烷基(TMS)、三乙基甲硅烷基(TES)和叔丁基二甲基甲硅烷基(TBS或TBDMS)。用于氨基的保护基的实例可包括碳酸酯型或酰胺型的脂溶性保护基，例如9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、叔丁氧基羰基(Boc)、苄基、烯丙氧基羰基(Alloc)、2，2，2-三氯乙氧基羰基(troc)、烯丙氧基羰基和乙酰基。
根据本发明的生产方法，与常规合成方法不同，不必对硫酸基或磷酸基进行保护/去保护，从而可更容易地生产具有受控结构的硫酸化糖、磷酸化糖和硫酸化/磷酸化糖。此外，由于不必对硫酸基或磷酸基进行保护/去保护，所以可设计反应路径而不考虑硫酸基或磷酸基的保护。这导致可用于反应路径的保护基和反应路径显著增多，使得可比先前更容易且高效地生产硫酸化糖、磷酸化糖和硫酸化/磷酸化糖或者包含它们的化合物，并且使得现在可合成迄今为止难以合成的硫酸化糖、磷酸化糖和硫酸化/磷酸化糖类或者包含它们的化合物。此外，本发明的生产方法对于合成具有长链均一结构的硫酸化糖、磷酸化糖和硫酸化/磷酸化糖或者包含它们的化合物非常有用。
应注意本文中使用的术语用于举例说明一些具体的实施方案，而不旨在限制本发明。
此外，本文中使用的术语“包含”意指除非上下文明显要求不同的理解，否则存在描述项目(构件、步骤、要素、数字等)，并不排除没有描述的项目(构件、步骤、要素、数字等)的存在。
除非另外定义，否则本文中使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本发明所属领域的技术人员广泛理解相同的含义。除非特别地另外定义，否则本文中使用的术语应解释为与本说明书和相关技术领域中的含义一致的含义，并且不应被理想化或不应被过度解释成为形式上的含义。
应理解，虽然术语第一、第二等可被用于表示多种要素，但是这些要素不应被这些术语所限定。这些术语仅用于将一个要素与另一个要素区分，且例如，在不脱离本发明的范围的情况下可将第一要素称为第二要素，且同样地，可将第二要素称为第一要素。
下面将通过实施例对本发明进行更具体地描述，前提是本发明可通过多种模式实现，且不应被解释为限于这里描述的实施例。
实施例
实施例1(通过硫酸化单糖的缩合生产硫酸化糖)
如以下反应式所示，制备在5-位碳原子的位置处具有未经保护的硫酸基并且在1-位碳原子的位置处具有离去基团的单糖。制备例中的化合物的名称后面所示的化合物编号表示以下反应式中所示的化合物编号。
[式12]
硫酸化单糖单体的合成路径
硫代糖苷2
在氩气氛下，将原材料1(4.0g，8.4mmol)溶解在无水DCM中。然后，将溶液在冰上冷却。添加BF3-OEt2(3.5mL，28mmol)和对甲苯硫醇(1.4g，11mmol)，使混合物恢复至室温，并将反应进行20小时。添加Et3N(3.5mL，25mmol)以将反应淬灭，并将反应溶液用DCM稀释，并用饱和NaHCO3水溶液和饱和NaCl水溶液洗涤。有机层经硫酸钠干燥，然后过滤并浓缩。使用硅胶柱(从AcOEt/Hex＝1/2至AcOEt/Hex＝2/1)除去试剂，并进行从热乙醇中重结晶以获得作为白色固体的硫代糖苷2。
1HNMR(400MHz CDCl3)7.87(m，2H)，7.76(m，2H)，7.30(d，2H，J＝7.8Hz)，7.08(d，2H，J＝7.8Hz)，5.78(t，1H，J＝9.7Hz)，5.65(d，1H，J＝10.7Hz)，5.12(5，1H，9.7Hz)，4.36-4.25(m，2H)，4.20(dd，1H，J＝1.3Hz，J＝12.2Hz)，3.88(m，1H)，2.33(s，3H)，2.11(s，3H)，2.02(s，3H)，1.83(s，3H)
ESI-MS[M+Na]+：C27H27NO9SNa：计算值564.1，实测值564.1。
1-STol-2-NPhth-葡萄糖3
在氩气氛下，将硫代糖苷2(462mg，0.85mmol)溶解在甲醇中。向其中添加甲醇钠(10.3mg，0.19mmol)并将混合物搅拌60分钟。添加DOWEX 50Wx8以将反应淬灭，并且通过过滤除去DOWEX 50Wx8。将滤液浓缩以获得作为白色固体的目标物质3。将其在不进行进一步纯化的情况下用于下一反应。
1H NMR(400MHz MeOD)7.94-7.82(m，4H)，7.28(d，2H，J＝8.2Hz)，7.05(d，2H，J＝8.2Hz)，5.52(d，1H，J＝10.4Hz)，4.24(dd，1H，J＝8.1Hz，J＝10.2Hz)，4.08(t，1H，J＝10.2Hz)，3.94(dd，1H，J＝1.8Hz，J＝12.0Hz)，3.75(dd，1H，J＝5.3Hz，J＝12.0Hz)，3.48-3.39(m，2H)，2.28(s，3H)
ESI-MS[M+Na]+：C21H21NO6SNa：计算值438.1，实测值438.1。
1-STol-2-NPhth-6-OSO3Na-葡萄糖4
在氩气氛下，将1-STol-2-NPhth-葡萄糖3(186mg，0.45mmol)和SO3-Py(76.6mg，0.48mmol)溶解在DMF(9.6mL)中，并将溶液搅拌3.5小时。添加过量的饱和NaHCO3水溶液，将混合物剧烈搅拌1小时，并随后将反应溶液浓缩。进行硅胶柱纯化(AcOEt/MeOH/H2O＝6/2/1)以获得原材料3(82.5mg，44％)和目标物质4(88.9mg，38％)。
1H NMR(400MHz D2O)7，95-7.75(m，4H)，7.25(d，2H，J＝8.1Hz)，7.08(d，2H，J＝8.1Hz)，5.64(d，1H，J＝10.2Hz)，4.42(dd，1H，J＝1.8Hz，J＝11.4Hz)，4.33-4.36(m，2H)，4.13(t，1H，10.28Hz)，3.93(m，1H)，3.62(t，1H，J＝9.55Hz)，2.23(s，3H)
ESI-MS[M-Na]-：C21H20NO9S2：计算值494.1，实测值493.7。
如以下反应式所示由硫酸化糖4制备硫酸化二糖5。
[式13]
硫酸化糖4的聚合
聚合
在氩气氛下，将硫酸化糖4(117mg，0.23mmol)溶解在乙腈中，添加分子筛3A，并且将混合物在冰上冷却。将TfOH(1.9μL)和N-碘代琥珀酰亚胺(51.2mg)溶解在乙腈(1mL)中，将溶液滴入到先前的糖溶液中并将混合物搅拌30分钟。在恢复至常温并搅拌过夜之后，将反应溶液原样施加至硅胶柱(AcOEt/MeOH＝3/1)以除去原材料和试剂。此后，通过HPLC分离硫酸化二糖5。
1H NMR(400MHz D2O)7.97-7.60(m，8H)，5.34(d，1H，J＝8.42Hz)，5.27(d，1H，J＝8.60Hz)，4.59(dd，1H，J＝8.4Hz，J＝10.9Hz)，4.46-4.21(m，4H)，4.10(dd，1H，J＝8.7Hz，J＝10.6Hz)，4.05-3.93(m，2H)，3.86(m，2H)，3.70(t，1H，J＝9.0Hz)，3.58(t，1H，J＝9.3Hz)
ESI-MS[M-2Na+H]-：C28H27N2O19S2-：计算值759.1，实测值758.7。
实施例2(通过硫酸化二糖的缩合生产硫酸化糖)
如以下反应式所示，制备在还原末端的6位碳原子的位置处具有未经保护的硫酸基并且在1-位碳原子的位置处具有离去基团的二糖。制备例中的化合物名称后面所示的化合物编号表示以下反应式中所示的化合物编号。
[式14]
具有硫酸基的二糖的合成
a：AcCl，MeOH0℃至室温，20h
b：TrocCl，NaHCO3，H2O，r.t.，2h
c：Ac2O，吡啶，DMAP，r.t.，3h
软骨糖胺乙酸酯1
根据先前的报道(Jean-Claude Jacquinet等，Angew.Chem.Int.Ed 2006，45，2574-2578)制备软骨糖胺1。
2-NHTroc软骨糖胺甲基酯全乙酸酯2
在氩气氛下，将乙酰氯(120μL，1.6mmol)添加至甲醇(13mL)，并将混合物在冰浴中搅拌30分钟。添加软骨糖胺乙酸酯1(340mg，0.82mmol)并将混合物搅拌20小时。使反应溶液浓缩，添加甲醇并且重复浓缩多次。将浓缩的残余物和NaHCO3(240mg，2.85mmol)溶解在水(7.4mL)中，将溶液剧烈地搅拌30分钟。缓慢地滴加氯甲酸2，2，2-三氯乙酯(260μL，1.9mmol)并且将混合物搅拌2小时。向其中添加DOWEX 50Wx8以将反应淬灭，并通过过滤除去DOWEX 50Wx8。DOWEX 50Wx8用甲醇洗涤三次。将滤液浓缩并进行硅胶柱纯化(AcOEt/MeOH/H2O＝6/2/1)以获得N-Troc软骨糖胺甲基酯(353mg，79％)。在氩气氛下，将N-Troc软骨糖胺甲基酯(350mg，0.65mmol)溶解在Ac2O/吡啶(1/1，7mL)中。添加N，N-二甲基-4-氨基吡啶(7.9mg，0.065mmol)并将混合物在室温下搅拌3小时。此后，将反应溶液在冰上冷却，并缓慢添加过量的甲醇以将反应淬灭。将反应溶液浓缩并进行硅胶纯化(AcOEt/Hex＝1/l)以获得目标物质2(470mg，3步，72％，α/β接近1∶1)。
1H NMR(400HzCDCl3)6.57(d，J＝6.8Hz，β-端基异构体)，6.32(d，J＝3.04，α-端基异构体)，5.80(t，J＝8.6Hz)，5.44-4.96(m)，4.89-4.54(m)，4.34(dt，J＝3.5Hz，J＝10.5Hz)，4.30-3.95(m)，
ESI-MS[M+Na]+：C28H3635Cl3NO19Na：计算值818.1，实测值818.1。
1-STol-2-NHTroc软骨糖胺甲基酯全乙酸酯3
在氩气氛下，将N-Troc软骨糖胺甲基酯全乙酸酯2(717mg，0.90mmol)和对甲苯硫醇(111mg，0.89mmol)溶解在DCM中，并将溶液在冰上冷却。滴加BF3-OEt2(338μL，2.7mmol)并将混合物搅拌30分钟。此后，将混合物在室温下搅拌过夜。添加Et3N(375μL，2.7mmol)以将反应淬灭。通过添加DCM稀释反应溶液并用饱和NaHCO3水溶液和饱和NaCl水溶液洗涤。有机层经硫酸钠干燥，然后过滤并浓缩。残余物进行硅胶柱纯化(从AcOEt/Hex＝1/2至AcOEt/Hex＝1/1)以获得作为白色固体的目标化合物3(436mg，56％)。
1H NMR(400MHz CDCl3)7.41(d，2H，J＝8.0Hz)，7.11(d，2H，J＝8.0Hz)，5.41(d，1H，J＝7.9Hz)，5.38(d，1H，J＝2.7Hz)，5.22-5.13(m，2H)，4.99-4.93(m，2H)，4.86(d，1H，J＝12.1Hz)，4.73(d，1H，J＝7.9Hz)，4.64(d，1H，J＝12.1Hz)，4.31(dd，1H，J＝3.1Hz，J＝10.5Hz)，4.19-3.95(m，3H)，3.86(t，1H，J＝6.42Hz)，3.75(s，3H)，3.65(m，1H)，2.34(s，3H)，2.08(s，3H)，2.05(s，3H)，2.04(s，3H)，2.01(s，3H)，1.99(s，3H)
ESI-MS[M+Na]+：C33H4035Cl3NO17SNa：计算值882.1，实测值882.1。
1-STol-2NHTroc软骨糖胺甲基酯4
在氩气氛下，将1-STol-2-NHTroc软骨糖胺甲基酯全乙酸酯3(510mg，0.59mmol)溶解在无水甲醇中。添加甲醇钠，并将混合物在室温下搅拌1.5小时。添加DOWEX 50Wx8以将反应淬灭，并将混合物过滤和浓缩。残余物进行硅胶柱纯化(AcOEt/MeOH＝50/3)以获得作为白色固体的目标化合物4。
1H NMR(400MHz D2O)7.36(d，2H，J＝8.1Hz)，7.16(d，2H，J＝8.1Hz)，4.89(d，1H，J＝12.4Hz)，4.74(d，1H)，4，59(d，1H，J＝12.4Hz)，4.54(d，1H，J＝8.15Hz)，4.07(d，1H，J＝2.56Hz)，3.96(d，1H，J＝9.7Hz)，3.73(s，3H)，3.71-3.57(m，3H)，3.48(t，1H，J＝9.2Hz)，3.41(t，1H，J＝9.1Hz)，3.28(dd，1H，J＝7.92Hz，J＝8.79Hz)，2.24(s，3H)
ESI-MS[M+Na]+：C23H3035Cl3NO12SNa：计算值672.0，实测值672.0。
1-STol-2NHTroc-6-OSO3Na软骨糖胺甲基酯5
在氩气氛下，将1-STol-2NHTroc软骨糖胺甲基酯4和SO3-Py溶解在DMF中，并将溶液在室温下搅拌过夜。此后，添加过量的饱和NaHCO3并将混合物剧烈地搅拌30分钟。将反应溶液浓缩并进行硅胶柱纯化(AcOEt/MeOH/H2O＝6/1/1)以获得目标物质5。
1H NMR(400MHz MeOD)7.42(d，2H，J＝8.1Hz)，7.13(d，2H，J＝8.1Hz)，4.90(d，1H，J＝12.1Hz)，4.73(d，1H，J＝10.3Hz)，4.67(d，1H，J＝12.1Hz)，4.52(d，1H，J＝7.5Hz)，4.20(dd，1H，J＝5.9Hz，J＝10.7Hz)，4.16(dd，1H，J＝6.4Hz，J＝10.6Hz)，4.09(d，1H，2.7Hz)，3.91(t，1H，J＝10.3Hz)，3.86-3.74(m，6H)，3.55(5，1H，J＝9.1Hz)，3.40-3.26(m，2H)，2.31(s，3H)
ESI-MS[M-H]-：C23H2935C13NO15S2：计算值728.0，实测值727.8。
1-STol-2-NHTroc-6-OSO3Na-2′，3′-O-异丙软骨糖胺甲基酯6
在氩气氛下，将1-STol-2NHTroc-6-OSO3Na软骨糖胺甲基酯5溶解在DMF中。添加2-甲氧基丙烯和对甲苯磺酸吡啶并将混合物在室温下搅拌30分钟。添加饱和NaHCO3以将反应淬灭，并随后将溶液浓缩。对残余物进行硅胶柱纯化(AcOEt/MeOH/H2O＝6/1/1)以获得目标物质6。
1H NMR(400MHz DMSO)7.32(d，2H，J＝8.2Hz)，7.11(d，2H，J＝8.2Hz)，5.77(d，1H，J＝5.6Hz)，4.93(d，1H，J＝7.9Hz)，4.86(d，1H，J＝12.1Hz)，4.77(d，1H，J＝4.8Hz)，4.68-4.60(m，2H)，3.88-3.58(m，11H)，3.43(t，1H，J＝9.1Hz)，3.26(t，1H，J＝8.3Hz)，2.27(s，3H)
ESI-MS[M+Na]：C26H33Cl3NO15S2：计算值768.0，实测值767.8。
接着，如以下反应式所示使硫酸化二糖6聚合。
[式15]
具有硫酸基的二糖的聚合反应
在氩气氛下，将1-STol-2-NHTroc-6-OSO3Na-2′，3′-O-异丙软骨糖胺甲基酯6溶解在乙腈中。向其中添加活化分子筛3A。添加DMTST以开始反应。在10分钟之后，取出溶液的一部分，用Et3N淬灭，并随后通过ESI-MS测量。
ESI-MS[M-2Na+H]：C38H51Cl6N2O30S2-：计算值1289.0，实测值1288.6。
基于ESI-MS的结果，推测通过聚合反应合成的产物具有以下结构。
[式16]
(实施例3)硫酸化二糖(糖基邻己炔基苯甲酸酯)供体的合成
如以下反应式所示，制备在还原末端的6位碳原子的位置处具有未经保护硫酸基并且在1-位碳原子的位置处具有离去基团的硫酸化二糖供体6。制备例中的化合物名称后面所示的化合物编号表示以下反应式中所示的化合物编号。
[式17]
对甲苯基(甲基-β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸酯)-(1→3)-2-脱氧-1-硫代-2-(2，2， 2-三氯乙氧基羰基氨基)-6-O-三苯基甲基-β-D-吡喃半乳糖苷2
在氩气氛下将对甲苯基(甲基-β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸酯)-(1→3)-2-脱氧-1-硫代-2-(2，2，2-三氯乙氧基羰基氨基)-β-D-吡喃半乳糖苷1(72mg，0.11mmol)和三苯基甲基氯(34mg，0.12mmol)溶解在吡啶(1.16mL)中。在50℃下搅拌过夜之后，将反应溶液浓缩。浓缩的残余物用硅胶柱(AcOEt∶MeOH＝50∶3)纯化以获得目标物质2(90mg，0.09mmol，77％)。
1H NMR(400Hz CDCl3)7.45-7.37(m，7H)，7.31-7.19(m，10H)，7.04(d，J＝8.0Hz，2H)，5.51(d，J＝8.1Hz，2H)，5.40(d，J＝2.85Hz，2H)，5.22-5.12(m，2H)，4.99-4.91(m，2H)，4.85(d，J＝12.2Hz，1H)，4.73(d，J＝7.9Hz，1H)，4.64(d，J＝12.2Hz，1H)，4.24(dd，J＝2.8Hz，J＝10.8Hz，1H)，3.99(d，J＝9.3Hz，1H)，3.76-3.61(m，5H)，3.31(dd，J＝6.9Hz，J＝9.9Hz，1H)，3.04(dd，J＝5.7Hz，J＝9.9Hz，3H)，2.30(s，3H)
ESI-MS[M+Na]+：C42H4435Cl3NNaO12S：计算值914.2，实测值914.5。
对甲苯基(甲基-2，3，4-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸酯)-(1→3)-4-O- 乙酰基-2-脱氧-1-硫代-2-(2，2，2-三氯乙氧基羰基氨基)-6-O-三苯基甲基-β-D-吡喃半乳 糖苷3
在氩气氛下将对甲苯基(甲基-β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸酯)-(1→3)-2-脱氧-1-硫代-2-(2，2，2-三氯乙氧基羰基氨基)-6-O-三苯基甲基-β-D-吡喃半乳糖苷2(150mg，0.168mmol)溶解在吡啶/乙酸酐1∶1(3.3mL)中。在室温下搅拌过夜之后，将反应溶液在冰上冷却，并缓慢添加过量的甲醇以将反应淬灭。将反应溶液浓缩并用硅胶柱(AcOEt∶Hex＝2∶3)纯化以获得目标物质3(177mg，0.167mmol，99％)。
1H NMR(400Hz CDC13)7.41(d，J＝7.8Hz，8H)，7.31-7.20(m，9H)，7.04(d，J＝7.7Hz，2H)，5.43-5.38(m，2H)，5.22-5.12(m，2H)，4.99-4.91(m，2H)，4.85(d，J＝12.1Hz，1H)，4.73(d，J＝7.8Hz，1H)，4.63(d，J＝12.1Hz，1H)，4.24(dd，J＝3.0Hz，J＝10.5Hz，1H)，3.99(d，J＝9.4Hz，1H)，3.70-3.61(m，4H)，3.31(dd，J＝7.0Hz，J＝9.8Hz，1H)，3.04(dd，J＝5.4Hz，J＝9.5Hz，1H)，2.31(s，3H)，2.04(s，3H)，2.01(s，3H)，2.00(s，3H)，1.88(s，3H)
ESI-MS[M+Na]+：C50H5235Cl3NNaO16S：计算值1082.2，实测值1082.2
(甲基-2，3，4-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸酯)-(1→3)-4-O-乙酰基- 2-脱氧-1-硫代-2-(2，2，2-三氯乙氧基羰基氨基)-6-O-三苯基甲基-β-D-吡喃半乳糖4
将对甲苯基(甲基-2，3，4-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸酯)-(1→3)-4-O-乙酰基-2-脱氧-1-硫代-2-(2，2，2-三氯乙氧基羰基氨基)-6-O-三苯基甲基-β-D-吡喃半乳糖苷3(230mg，217mmol)溶解在H2O/丙酮1∶10(2.3mL)中。将溶液在冰上冷却，添加N-溴代琥珀酰亚胺(116mg，0.65mmol)并将混合物搅拌20分钟。反应溶液用AcOEt稀释，并且有机相用饱和碳酸氢钠溶液和饱和盐水溶液洗涤，然后经硫酸钠干燥。通过过滤除去硫酸钠，然后在减压下浓缩。残余物用硅胶柱(AcOEt∶Hex＝1∶1)纯化以获得目标物质4(159mg，0.166mmol，77％)。
1H NMRα-端基异构体(400Hz CDCl3)7.44-7.35(m，6H)，7.31-7.19(m，9H)，5.71(d，J＝9.0Hz，1H)，5.49(d，J＝2.2Hz，1H)5.27-5.14(m，3H)，4.88-4.70(m，2H)，4.70-4.60(m，1H)，4.33(t，J＝6.6Hz，1H)，4.21(dd，J＝3.1Hz，J＝10.51H)，4.15-3.97(m，2H)，3.74-3.65(m，4H)，3.17(dd，J＝6.6Hz，J＝9.2Hz，1H)，3.08-2.99(m，1H)，2.10-2.00(m，12H)
ESI-MS[M+Na]+：C43H4635Cl3NNaO17：计算值976.2，实测值976.7。
(甲基-2，3，4-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸酯)-(1→3)-4-O-乙酰基- 2-脱氧-1-硫代-2-(2，2，2-三氯乙氧基羰基氨基)-6-O-三苯基甲基-β-D-半乳吡喃糖基邻 己炔基苯甲酸酯5
在氩气氛下将甲基-2，3，4-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸酯)-(1→3)-4-O-乙酰基-2-脱氧-1-硫代-2-(2，2，2-三氯乙氧基羰基氨基)-6-O-三苯基甲基-β-D-吡喃半乳糖4(159mg，0.166mmol)和邻己炔基苯甲酸7(101mg，0.499mmol)溶解在DCM(1.7mL)中。添加N，N-二甲基氨基吡啶(2mg，0.02mmol)和N，N′-二异丙基碳二亚胺(78μL，0.499mmol)并将混合物在室温下搅拌过夜。反应溶液用DCM稀释，用饱和碳酸氢钠溶液和饱和盐水溶液洗涤，并随后经硫酸钠干燥。通过过滤除去硫酸钠，然后在减压下浓缩。残余物用硅胶柱(AcOEt∶Hex＝2∶3)纯化以获得目标物质5(126mg，0.11mmol，67％)。
1H NMRα-端基异构体(400Hz CDCl3)8.02(d，J＝8，2Hz，1H)，7.63(d，J＝7.9Hz，1H)，7.53(dt，J＝1.3Hz，J＝7.5Hz 1H)，7.47-7.41(m，1H)7.40-7.35(m，7H)，7.29-7.26(m，4H)，7.21-7.15(m，4H)，6.45(d，J＝3.3Hz，1H)，6.02(d，J＝8.7Hz，1H)，5.63(b，1H)，5.26-5.19(m，2H)，4.87(d，J＝7.6Hz，1H)，4.81(d，J＝12.0Hz，H)，4.54-4.49(m，2H)，4.38-4.32(m，1H)，4.29-4.24(m，1H)，4.09(d，J＝9.3Hz，1H)，3.43(s，3H)，3.31(dd，J＝5.5Hz，J＝9.1Hz，1H)，2.97(t，J＝9.1Hz，1H)，2.67-2.49(m，2H)，2.16(s，3H)，2.06(s，6H)，1.85(s，3H)，1.66-1.57(m，2H)，1.51-1.47(m，2H)，0，89(t，J＝7.3Hz，3H)
ESI-MS[M+Na]+：C56H5835Cl3NNaO18：计算值1160.3，实测值1160.9。
(甲基-2，3，4-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸酯)-(1→3)-4-O-乙酰基- 2-脱氧-6-O-磺基-1-硫代-2-(2，2，2-三氯乙氧基羰基氨基)-β-D-半乳吡喃糖基邻己炔基 苯甲酸酯，单钠盐6
将(甲基-2，3，4-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸酯)-(1→3)-4-O-乙酰基-2-脱氧-1-硫代-2-(2，2，2-三氯乙氧基羰基氨基)-6-O-三苯基甲基-β-D-半乳吡喃糖基邻己炔基苯甲酸酯5(50.0mg，0.044mmol)溶解在DCM(440μL)中。添加三氟乙酸(44μL)和三异丙基硅烷(45μL)并将混合物在室温下搅拌3分钟。添加过量的饱和碳酸氢钠溶液以将反应淬灭，然后用AcOEt萃取。有机相用饱和盐水溶液洗涤，并随后经硫酸钠干燥。通过过滤除去硫酸钠，然后在减压下浓缩。在氩气氛下将残余物溶解在DMF(440μL)中，添加SO3-Py(14mg，0.088mmol)并搅拌溶液。在2小时之后，向反应溶液中添加饱和碳酸氢钠溶液(1.0mL)并将混合物搅拌另外30分钟。将反应溶液在减压下浓缩，并随后用硅胶柱(AcOEt∶MeOH＝10∶1)纯化以获得目标物质6(29.8mg，0.030mmol，68％)。
1H NMR(α端基异构体)(400Hz MeOD)8.06-8.00(m，1H)，7.55-7.49(m，2H)，7.45-7.40(m，1H)，6.50(d，J＝2.47Hz，1H)，5.60(b，1H)，5.26(t，J＝9.2Hz 1H)，5.09(t，J＝9.8Hz，1H)，4.96-4.87(m，3H)，4.65-4.58(m，2H)，4.32-4.28(m，2H)，4.20(d，J＝9.8Hz，1H)，4.13-4.07(m，1H)，3.99-3.93(m，1H)，3.73(s，3H)，2.48(t，J＝6.8，2H)，2.15(s，3H)，2.02(s，3H)，1.99(s，3H)，1.97(s，3H)，1.67-1.50(m，4H)，0.99(t，J＝7.2Hz，3H)
ESI-MS[M-H]-：C37H4335Cl3NO21S：计算值974.1，实测值973.9。
二糖接纳体的合成
根据以下反应式制备二糖接纳体11。制备例中的化合物名称后面所示的化合物编号表示以下反应式中所示的化合物编号。
[式18]
接纳体的合成
对甲苯基(2，3-O-异亚丙基-β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸甲酯)-(1→3)-2-脱氧-4， 6-O-异亚丙基-1-硫代-2-(2，2，2-三氯乙氧基羰基氨基)-β-D-吡喃半乳糖苷8
在氩气氛下将对甲苯基(甲基-β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸酯)-(1→3)-2-脱氧-1-硫代-2-(2，2，2-三氯乙氧基羰基氨基)-β-D-吡喃半乳糖苷1(332mg，0.51mmol)溶解在DMF(5.1mL)中。添加PPTS(64mg，0.25mmol)和2-甲氧基丙烯(490μL，5.mmol)，并将混合物在室温下搅拌15分钟。反应体系用乙酸乙酯稀释，用饱和碳酸氢钠溶液和饱和盐水溶液洗涤，并随后经硫酸钠干燥。通过过滤除去硫酸钠，然后在减压下浓缩。残余物用硅胶柱(AcOEt∶Hex＝2∶3)纯化以获得目标物质8(204mg，0.279mmol，55％)。
1H NMR(400HzCDCI3)7.56(d，J＝8.0Hz，2H)，7.10(d，J＝8.0Hz，2H)，5.58(d，J＝6.5Hz，1H)，5.28(d，J＝10，0Hz，1H)，4.88(d，J＝7.66Hz 1H)，4.74(d，J＝12.0Hz，1H)，4.69(d，J＝12.0Hz，1H)，4.08-4.00(m，3H)，3.84(s，3H)，3.68(d，J＝8.8Hz，1H)，3.49-3.42(m，3H)，3.37(dd，J＝7.7Hz，J＝9.1Hz 1H)，2.33(s，3H)，1.44-1.39(m，12H)
ESI-MS[M+Na]+：C29H3835Cl3NNaO12S：计算值752.1，实测值752.1
对甲苯基(2，3-O-异亚丙基-4-O-乙酰丙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸甲酯)-(1 →3)-2-脱氧-4，6-O-异亚丙基-1-硫代-2-(2，2，2-三氯乙氧基羰基氨基)-β-D-吡喃半乳糖 苷9
在氩气氛下将对甲苯基(2，3-O-异亚丙基-β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸甲酯)-(1→3)-2-脱氧-4，6-O-异亚丙基-1-硫代-2-(2，2，2-三氯乙氧基羰基氨基)-β-D-吡喃半乳糖苷8(63mg，0.086mmol)溶解在DCM(862μL)中。添加DMAP(2mg，0.02mmol)、LevOH(26μL，0.26mmol)和DIC(40μL，0.26mmol)并将混合物在室温下搅拌过夜。反应溶液用乙酸乙酯稀释，用饱和碳酸氢钠溶液和饱和盐水溶液洗涤，并随后经硫酸钠干燥。通过过滤除去硫酸钠，然后在减压下浓缩。残余物用硅胶柱(AcOE∶Hex＝3∶2)纯化以获得目标物质9(50mg，0.060mmol，70％)。
1H NMR(400Hz CDCl3)7.55(d，J＝8.0Hz，2H)，7.11(d，J＝8.0Hz，2H)，5.32-5.16(m，3H)，4.83-4.78(m，2H)，4.62(d，J＝12.1Hz 1H)，4.46(d，J＝9.8Hz，1H)，4.37(d，J＝2.8Hz，1H)，4.05-3.95(m，2H)，3.88-3.78(m，2H)，3.72(s，3H)，3.58-3.47(m，2H)，3.42(b，1H)，2.79-2.59(m，4H)，2.33(s，3H)，2.20(s，3H)，1.15(s，6H)，1.13(s，6H)
ESI-MS[M+K]+：C34H4435Cl3KNO14S：计算值866.1，实测值866.0
对甲苯基(2，3-二-O-乙酰基-4-O-乙酰丙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸甲酯)- (1→3)-4，6-二-O-乙酰基-2-脱氧-1-硫代-2-(2，2，2-三氯乙氧基羰基氨基)-β-D-吡喃半 乳糖苷10
将对甲苯基(2，3-O-异亚丙基-4-O-乙酰丙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸甲酯)-(1→3)-2-脱氧-4，6-O-异亚丙基-1-硫代-2-(2，2，2-三氯乙氧基羰基氨基)-β-D-吡喃半乳糖苷9(227mg，0.274mmol)溶解在80％乙酸水溶液(2.74mL)中并将溶液在室温下搅拌2小时。在反应之后，将反应溶液用饱和碳酸氢钠溶液(约3mL)中和并用乙酸乙酯萃取三次。有机相用饱和盐水溶液洗涤并经硫酸钠干燥。通过过滤除去硫酸钠，然后在减压下浓缩。在氩气氛下，将残余物溶解在乙酸酐(1.4mL)和吡啶(1.4mL)中，添加DMAP(3mg，0.03mmol)并将混合物在室温下搅拌。将反应溶液在冰上冷却并添加过量的甲醇以将反应淬灭。在减压下浓缩之后，用硅胶柱(AcOEt∶Hex＝1∶1)进行纯化以获得目标物质10(201mg，0.219mmol，80％)。
1H NMR(400Hz CDCl3)7.36(d，J＝8.0Hz，2H)，7.05(d，J＝8.0Hz，2H)，5.59(d，J＝8.3Hz，1H)，5.33(d，J＝3.0Hz，1H)，5.17-5.09(m，2H)，4.96-4.87(m，2H)，4.79(d，J＝12.1Hz，1H)，4.71(d，J＝7.8Hz，1H)，4.63(d，J＝7.8Hz，1H)，4.23(dd，J＝3.0Hz，J＝10.3Hz，1H)，4.09(dd，J＝5.3Hz，J＝11.8Hz，1H)，4.00-3.90(m，2H)，3.81(dd，J＝5.7Hz，J＝6.8Hz，1H)，3.72-3.61(m，4H)，2.70-2.62(m，2H)，2.47-2.40(m，2H)，2.29(s，3H)，2.10(s，3H)，2.03(s，3H)，2.01(s，3H)，2.00(s，3H)，1.99(s，3H)
ESI-MS[M+Na]+：C36H4435Cl3NNaO18S：计算值938.1，实测值938.1。
对甲苯基(2，3-二-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸甲酯)-(1→3)-4，6-二-O- 乙酰基-2-脱氧-1-硫代-2-(2，2，2-三氯乙氧基羰基氨基)-β-D-吡喃半乳糖苷11
在氩气氛下将对甲苯基(2，3-二-O-乙酰基-4-O-乙酰丙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸甲酯)-(1→3)-4，6-二-O-乙酰基-2-脱氧-1-硫代-2-(2，2，2-三氯乙氧基羰基氨基)-β-D-吡喃半乳糖苷10(201mg，0.219mmol)溶解在吡啶(1.09mL)和乙酸(1.09mL)中。添加一水合肼(13uL，0.263mmol)并将混合物在室温下搅拌30分钟。反应溶液用乙酸乙酯稀释，用饱和碳酸氢钠溶液和饱和盐水溶液洗涤，并随后经硫酸钠干燥。通过过滤除去硫酸钠，然后在减压下浓缩。残余物用硅胶柱(AcOEt∶Hex＝3∶2)纯化以获得到目标物质11(121mg，0.148mmol，68％)。
1H NMR(400Hz CDCl3)7.41(d，J＝8.0Hz，2H)，7.11(d，J＝8.0Hz，2H)，5.44(d，J＝2.8Hz，1H)，5.05-4.99(m，2H)，4.89-4.80(m，2H)，4.71-4.65(m，2H)，4.37-4.32(m，1H)，4.18-4.02(m，2H)，3.96-3.83(m，6H)，3.62-3.52(m，1H)，2.34(s，3H)，2.07(s，3H)，2.06(s，3H)，2.05(s，3H)，2.04(s，3H)
ESI-MS[M+K]+：C31H3835Cl3KNO16S：计算值856.6，实测值856.0。
(合成例1)(硫酸化四糖的合成)
如上制备的硫酸化二糖供体6和二糖接纳体11根据以下反应式进行缩合以制备目标硫酸化四糖12。制备例中的化合物名称后面所示的化合物编号表示以下反应式中所示的化合物编号。
[式19]
在氩气氛下将对甲苯基(2，3-二-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸甲酯)-(1→3)-4，6-二-O-乙酰基-2-脱氧-1-硫代-2-(2，2，2-三氯乙氧基羰基氨基)-β-D-吡喃半乳糖苷11(12.0mg，0.015mmol)和(甲基-2，3，4-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸酯)-(1→3)-4-O-乙酰基-2-脱氧-6-O-磺基-1-硫代-2-(2，2，2-三氯乙氧基羰基氨基)-β-D-半乳吡喃糖基邻己炔基苯甲酸酯，单钠盐6(12.6mg，0.013mmol)溶解在MeCN(126μL)中。添加活化的MS-300(12mg)并将混合物在室温下搅拌1小时。将反应溶液在冰上冷却之后，添加PPh3AuNTf2-0.5甲苯(6mg，3.7μmol)以开始反应。将混合物在0℃下搅拌15分钟，并将反应溶液原样施加至硅胶柱。在质谱法中观察到四糖12的离子峰(产率约5％)。此外，通过NMR分析确定由该反应形成的糖苷键位置的端基异构体位置(第1位)的CH耦合常数(J值)为JCH＝178Hz，表明所获得的四糖为通过α键连接的化合物12。
ESI-MS[M-H]-：C55H6735Cl6N2O35S2：计算值1589.1，实测值1589.1。
(合成例2)(硫酸化四糖的合成)
如上制备的硫酸化二糖供体6和二糖接纳体11根据以下反应式进行缩合以制备目标硫酸化四糖13。制备例中的化合物名称后面所示的化合物编号表示以下反应式中所示的化合物编号。
[式20]
在氩气氛下将对甲苯基(2，3-二-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸甲酯)-(1→3)-4，6-二-O-乙酰基-2-脱氧-1-硫代-2-(2，2，2-三氯乙氧基羰基氨基)-β-D-吡喃半乳糖苷11(28.0mg，0.034mmol)和(甲基-2，3，4-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸酯)-(1→3)-4-O-乙酰基-2-脱氧-6-O-磺基-1-硫代-2-(2，2，2-三氯乙氧基羰基氨基)-β-D-半乳吡喃糖基邻己炔基苯甲酸单钠盐6(28.0mg，0.028mmol)溶解在MeCN(280μL)中。添加活化的MS-300(12mg)并将混合物在室温下搅拌1小时。在将反应溶液冷却至-5℃之后，添加PPh3AuNTf2-0.5甲苯(13mg，8.4μmol)以开始反应。将混合物在-5℃下搅拌3小时，并将反应溶液原样施加至硅胶柱。在质谱法中观察到四糖12的离子峰(产率约10％)。此外，通过NMR分析确定由该反应形成的糖苷键位置的H-1和H-2的J值为J1，2＝8.3Hz，表明所获得的四糖为通过β键连接的化合物13。
ESI-MS[M-H]-：C55H6735Cl6N2O35S2：计算值1589.1，实测值1589.1。