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C4-氟代尿苷亚磷酰胺单体和C4-氟代尿苷修饰RNA的制备方法.pdf

  • 上传人：姓***
  • 文档编号：8723323
  • 上传时间：2020-12-30
  • 格式：PDF
  • 页数：12
  • 大小：463.89KB
    • 摘要
    申请专利号：

    CN201811099671.2

    		 申请日：

    20180920
    公开号：

    CN109134570A

    		 公开日：

    20190104
    当前法律状态：

    		有效性：

    审查中
    法律详情：

    IPC分类号：

    C07H23/00,C07H1/00,C07H21/02

    		 主分类号：

    C07H23/00,C07H1/00,C07H21/02
    申请人：

    南开大学
    发明人：

    周传政,李强
    地址：

    300071 天津市南开区卫津路94号
    优先权：

    CN201811099671A
    专利代理机构：

    天津耀达律师事务所

    		 代理人：

    侯力
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    内容摘要

    本发明涉及RNA的化学合成领域，公开C4′‑氟代尿苷亚磷酰胺单体及其C4′‑氟代尿苷定点修饰的RNA的制备方法。该C4′‑氟代尿苷亚磷酰胺单体的化学结构如式(1)所示。本发明所述的C4′‑氟代尿苷亚磷酰胺单体用于制备C4′‑氟代尿苷定点修饰的RNA，在研究C4′‑氟代RNA的生化性质等方面有着广泛的应用前景。式(1)中“DMTr‑”为二甲氧基三苯甲基，“N(iPr)2‑”为N,N‑二异丙基胺基，“TBDMS”为叔丁基二甲基氯硅烷。

    权利要求书

    1.一种C4′-氟代尿苷亚磷酰胺单体，其特征在于，其化学结构式为：式(1)中“DMTr-”为二甲氧基三苯甲基，“N(Pr)-”为N,N-二异丙基胺基，“TBDMS”为叔丁基二甲基氯硅烷。 2.一种权利要求1所述C4′-氟代尿苷亚磷酰胺单体的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)将4′-C-氟-5′-碘-5′-脱氧尿苷与硝酸银、吡啶和四氢呋喃形成第一混合溶液；之后将所述第一混合溶液与叔丁基二甲基氯硅烷进行反应，且所述4′-C-氟-5′-碘-5′-脱氧尿苷与所述硝酸银、所述吡啶、所述四氢呋喃和所述叔丁基二甲基氯硅烷的用量比为1mmol:3.5mmol:4mL:4mL:3.5mmol，将反应后得到的溶液旋蒸除去溶剂，再用二氯甲烷溶解后洗涤、过滤、干燥、柱层析得到2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-氟-5′-碘-5′-脱氧尿苷；(2)将步骤(1)得到的2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-氟-5′-碘-5′-脱氧尿苷与4-二甲氨基吡啶、吡啶进行第二混合，形成第二混合溶液；再将所述第二混合溶液与乙酸酐进行反应，所述2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-氟-5′-碘-5′-脱氧尿苷与所述4-二甲氨基吡啶、所述吡啶、所述乙酸酐用量的比为1mmol:0.3mmol:10mL:5mmol；旋蒸除去溶剂，用二氯甲烷溶解后洗涤、过滤、干燥、柱层析得到2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-3′-乙酸酯-4′-C-氟-5′-碘-5′-脱氧尿苷；(3)将三氟乙酸与四正丁基氢氧化铵溶液混合调节pH为4后，加入步骤(2)得到的2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-3′-乙酸酯-4′-C-氟-5′-碘-5′-脱氧尿苷、二氯甲烷进行第三混合，形成第三混合溶液；再将所述第三混合溶液与间氯过氧苯甲酸进行反应，且所述三氟乙酸与所述四正丁基氢氧化铵溶液、所述2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-3′-乙酸酯-4′-C-氟-5′-碘-5′-脱氧尿苷、所述二氯甲烷、所述间氯过氧苯甲酸的用量比为0.8mL:10mL:1mmol:10mL:5mmol；然后将反应得到的有机相洗涤、过滤、干燥、柱层析得到2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-3′-乙酸酯-4′-C-氟代尿苷；(4)将步骤(3)得到的2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-3′-乙酸酯-4′-C-氟代尿苷与氨/甲醇溶液进行反应，且所述2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-3′-乙酸酯-4′-C-氟代尿苷与氨/甲醇溶液用量比为1mmol:8mL；旋蒸除去溶剂，柱层析得到产物；(5)将步骤(4)得到的产物与4-二甲氨基吡啶、吡啶以及4,4′-二甲氧基三苯甲基氯进行反应，且所述产物与所述4-二甲氨基吡啶、所述吡啶以及4,4′-二甲氧基三苯甲基氯的用量比为1mmol:0.3mmol:8mL:1.3mmol；旋蒸除去溶剂，用二氯甲烷溶解后然后将有机相洗涤、过滤、干燥、柱层析得到2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-氟-5′-O-二甲氧基三苯甲基尿苷；(6)将步骤(5)得到的2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-氟-5′-O-二甲氧基三苯甲基尿苷与二氯甲烷、N,N′-二异丙基乙胺以及2-甲基咪唑进行第四混合，形成第四混合溶液；再将所述第四混合溶液与(2-氰基乙氧基)-N,N′-二异丙基亚磷酰氯进行反应，且所述2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-氟-5′-O-二甲氧基三苯甲基尿苷与所述二氯甲烷、所述N,N′-二异丙基乙胺、所述2-甲基咪唑、所述(2-氰基乙氧基)-N,N′-二异丙基亚磷酰氯的用量比为1mmol:20mL:10mmol:4mmol:5mmol；旋蒸除去溶剂，用二氯甲烷溶解后然后将有机相洗涤、过滤、干燥、柱层析得到2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-3′-[(2-氰基乙氧基)-N,N′-二异丙基亚磷酰胺]-4′-C-氟-5′-O-二甲氧基三苯甲基尿苷，即权利要求1所述的C4′-氟代尿苷亚磷酰胺单体。 3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述反应的条件包括：温度为18-25℃，时间为1.5-2小时，搅拌速度为250-500转/分钟。 4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述乙酸酐以滴加的方式加入所述第二混合溶液中，所述乙酸酐的滴加速率为15滴/分钟；以及，所述反应的条件包括：温度为18-25℃，时间为0.5-1小时，搅拌速度为250-500转/分钟。 5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述四正丁基氢氧化铵溶液的质量浓度为55％，所述间氯过氧苯甲酸的纯度为85％；所述三氟乙酸以滴加的方式加入所述四正丁基氢氧化铵溶液中调pH为4；所述间氯过氧苯甲酸分三次加入第三混合溶液中，间隔时间为0.5小时；以及，所述反应的条件包括：温度为18-25℃，时间为40-46小时，搅拌速度为250-500转/分钟。 6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述氨/甲醇溶液的物质的量浓度为7mol/L；以及，所述反应的条件包括：温度为18-25℃，时间为3-4小时，搅拌速度为250-500转/分钟。 7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在步骤(5)中，所述反应的条件包括：温度为40-50℃，时间为3-5小时，搅拌速度为250-500转/分钟。 8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在步骤(6)中，所述反应的条件包括：温度为18-25℃，时间为15分钟，搅拌速度为250-500转/分钟。 9.一种含有C4’-氟代尿苷定点修饰的RNA的制备方法，其特征在于，该制备方法中的合成试剂包括权利要求1和权利要求2-8任意一项所述的制备方法制备得到的C4’-氟代尿苷亚磷酰胺单体。 10.根据权利要求9所述的制备方法，其中，该制备方法在ABI394DNA/RNA合成仪上进行以得到寡聚核苷酸，其中：所述合成试剂还包括叔丁基二甲基氯硅烷保护2′-OH的Ac-rC、Bz-rA、Ac-rG和rU；三氯乙酸/二氯甲烷用于脱保护；CapA试剂为乙酸酐、吡啶和四氢呋喃的组合物，且所述乙酸酐、所述吡啶和所述四氢呋喃的体积比为10体积％：(5-15)体积％：(75-85)体积％；CapB试剂为N-甲基咪唑和四氢呋喃的组合物，且所述N-甲基咪唑和所述四氢呋喃的体积比为10体积％：90体积％；活化剂为乙硫基四唑和乙腈的组合物；氧化剂为碘、水、吡啶和四氢呋喃的组合物，且所述碘、所述水、所述吡啶和所述四氢呋喃的用量比为0.02M：(1-2)体积％：(10-30)体积％：(75-85)体积％；以及，所述C4’-氟代RNA亚磷酰胺单体的偶合时间为0.5-1小时；将上述固相合成得到的寡聚核苷酸用0.75mL浓度为28重量％的氨水混合0.25mL无水乙醇在55℃下处理10-12h，然后，取出上清液离心浓缩后，加入0.5mL三乙胺三氢氟酸盐处理20-24h，经C18柱脱盐处理后，离心浓缩，采用20重量％的变性聚丙烯凝胶电泳纯化。

    说明书

    技术领域

    本发明涉及寡聚核苷酸的化学合成领域，具体涉及C4′-氟代尿苷亚磷酰胺单体以及C4′-氟代尿苷定点修饰RNA的制备方法。

    背景技术

    氟代修饰的RNA在生物医学领域有广泛的应用前景[Org.Biomol.Chem.,2017,15,9552–9565]。C2′-氟代修饰的RNA成功应用于核酸适配体、小干扰RNA等，可以增强稳定性，提高效力[Nature,2011,478,404-408]。此外，C4′-氟修饰核苷类似物nucleocidin是天然存在的五种含氟天然产物之一，具有良好的抗代谢活性，C4′-氟代修饰的核苷也因此引起了关注。Guillerm[Bioorg.Med.Chem.Lett.1995,5,1455-1460]和Verdine[Org.Lett.,2007,9,5007-5009]分别发展了各自的方法合成了C4′-氟代核苷。然而C4′-氟代核苷不稳定，将C4′-氟代核苷转化为C4′-氟亚磷酰胺单体并制备C4′-氟代修饰的RNA一直没有成功，限制了对其生化性质的进一步探讨。

    发明内容

    本发明的目的是针对C4′-氟代核苷不稳定的实际问题，提供一种通过分阶段、选择性保护核糖核苷中羟基的策略，即C4′-氟代尿苷亚磷酰胺单体及其制备方法，以及利用C4′-氟代尿苷磷酰胺单体制备C4′-氟代尿苷定点修饰的RNA的方法。

    本发明技术方案

    1、为了实现上述目的，本发明第一方面提供了一种C4′-氟代尿苷亚磷酰胺单体，其中，该C4′-氟代尿苷亚磷酰胺单体的化学结构式为：

    式(1)所示的化合物可以称为2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-3′-[(2-氰基乙氧基)-N,N′-二异丙基亚磷酰胺]-4′-C-氟-5′-O-二甲氧基三苯甲基尿苷。

    其中，在式(1)中，“DMTr-”为二甲氧基三苯甲基，“N(iPr)2-”为N,N-二异丙基胺基，“-TBDMS”为叔丁基二甲基硅烷基。

    2、本发明第二方面提供了一种C4′-氟代尿苷亚磷酰胺单体的制备方法，该方法包括以下步骤：

    (1)将4′-C-氟-5′-碘-5′-脱氧尿苷与硝酸银、吡啶和四氢呋喃形成第一混合溶液；之后将所述第一混合溶液与叔丁基二甲基氯硅烷进行反应，将反应后得到的溶液旋蒸除去溶剂，用二氯甲烷溶解后洗涤、过滤、干燥、柱层析得到2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-氟-5′-碘-5′-脱氧尿苷。

    (2)将步骤(1)得到的2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-氟-5′-碘-5′-脱氧尿苷与4-二甲氨基吡啶、吡啶进行第二混合，形成第二混合溶液；再将所述第二混合溶液与乙酸酐进行反应；旋蒸除去溶剂，用二氯甲烷溶解后洗涤、过滤、干燥、柱层析得到2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-3′-乙酸酯-4′-C-氟-5′-碘-5′-脱氧尿苷。

    (3)将三氟乙酸与四正丁基氢氧化铵溶液混合调节pH后，加入步骤(2)得到的2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-3′-乙酸酯-4′-C-氟-5′-碘-5′-脱氧尿苷、二氯甲烷进行第三混合，形成第三混合溶液；再将所述第三混合溶液与间氯过氧苯甲酸进行反应；然后将反应得到的有机相洗涤、过滤、干燥、柱层析得到2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-3′-乙酸酯-4′-C-氟代尿苷。

    (4)将步骤(3)得到的2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-3′-乙酸酯-4′-C-氟代尿苷与氨/甲醇溶液进行反应；旋蒸除去溶剂，柱层析得到产物。

    (5)将步骤(4)得到的产物与4-二甲氨基吡啶、吡啶以及4,4′-二甲氧基三苯甲基氯进行反应；旋蒸除去溶剂，用二氯甲烷溶解后然后将有机相洗涤、过滤、干燥、柱层析得到2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-氟-5′-O-二甲氧基三苯甲基尿苷。

    (6)将步骤(5)得到的2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-氟-5′-O-二甲氧基三苯甲基尿苷与二氯甲烷、N,N′-二异丙基乙胺以及2-甲基咪唑进行第四混合，形成第四混合溶液；再将所述第四混合溶液与(2-氰基乙氧基)-N,N′-二异丙基亚磷酰氯进行反应；旋蒸除去溶剂，用二氯甲烷溶解后然后将有机相洗涤、过滤、干燥、柱层析得到2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-3′-[(2-氰基乙氧基)-N,N′-二异丙基亚磷酰胺]-4′-C-氟-5′-O-二甲氧基三苯甲基尿苷，即本发明所述的C4′-氟代尿苷亚磷酰胺单体。

    优选地，在步骤(1)中，所述4′-C-氟-5′-碘-5′-脱氧尿苷与所述硝酸银、所述吡啶、所述四氢呋喃、所述叔丁基二甲基氯硅烷用量的比为1mmol:3.5mmol:4mL:4mL:3.5mmol；以及，

    所述反应的条件包括：温度为18-25℃，时间为1.5-2小时，搅拌速度为250-500转/分钟。

    优选地，在步骤(2)中，所述2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-氟-5′-碘-5′-脱氧尿苷与所述4-二甲氨基吡啶、所述吡啶、所述乙酸酐用量的比为1mmol:0.3mmol:10mL:5mmol；以及，

    所述乙酸酐以滴加的方式加入所述第二混合溶液中，所述乙酸酐的滴加速率为15滴/分钟；以及，

    所述反应的条件包括：温度为18-25℃，时间为0.5-1小时，搅拌速度为250-500转/分钟。

    优选地，在步骤(3)中，所述三氟乙酸与所述四正丁基氢氧化铵溶液、所述2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-3′-乙酸酯-4′-C-氟-5′-碘-5′-脱氧尿苷、所述二氯甲烷、所述间氯过氧苯甲酸的用量比为0.8mL:10mL:1mmol:10mL:5mmol；其中所述四正丁基氢氧化铵溶液的质量浓度为55％，所述间氯过氧苯甲酸的纯度为85％；

    所述三氟乙酸以滴加的方式加入所述四正丁基氢氧化铵溶液中调pH为4；所述间氯过氧苯甲酸分三次加入第三混合溶液中，间隔时间为0.5小时；以及，

    所述反应的条件包括：温度为18-25℃，时间为40-46小时，搅拌速度为250-500转/分钟。

    优选地，在步骤(4)中，所述2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-3′-乙酸酯-4′-C-氟代尿苷与氨/甲醇溶液用量比为1mmol:8mL，其中氨/甲醇溶液的物质的量浓度为7mol/L；以及，

    所述反应的条件包括：温度为18-25℃，时间为3-4小时，搅拌速度为250-500转/分钟。

    优选地，在步骤(5)中，所述产物与所述4-二甲氨基吡啶、所述吡啶以及4,4′-二甲氧基三苯甲基氯的用量比为1mmol:0.3mmol:8mL:1.3mmol；以及，

    所述反应的条件包括：温度为40-50℃，时间为3-5小时，搅拌速度为250-500转/分钟。

    优选地，在步骤(6)中，所述2′-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-4′-C-氟-5′-O-二甲氧基三苯甲基尿苷与所述二氯甲烷、所述N,N′-二异丙基乙胺、所述2-甲基咪唑、所述(2-氰基乙氧基)-N,N′-二异丙基亚磷酰氯的用量比为1mmol:20mL:10mmol:4mmol:5mmol；以及，

    所述反应的条件包括：温度为18-25℃，时间为15分钟，搅拌速度为250-500转/分钟。

    3、本发明第三方面提供了一种C4′-氟代尿苷定点修饰RNA的制备方法，其中，该制备方法中的合成试剂包括以上所述的制备方法制备得到的C4′-氟代尿苷亚磷酰胺单体。

    优选地，该制备方法在ABI 394DNA/RNA合成仪上进行以得到寡聚核苷酸，其中：

    优选地，所述合成试剂还包括叔丁基二甲基氯硅烷保护2′-OH的Ac-rC、Bz-rA、Ac-rG和rU；

    优选地，三氯乙酸/二氯甲烷用于脱保护；

    优选地，CapA试剂为乙酸酐、吡啶和四氢呋喃的组合物，且所述乙酸酐、所述吡啶和所述四氢呋喃的体积比为10体积％：(5-15)体积％：(75-85)体积％；

    优选地，Cap B试剂为N-甲基咪唑和四氢呋喃的组合物，且所述N-甲基咪唑和所述四氢呋喃的体积比为10体积％：90体积％；

    优选地，活化剂为乙硫基四唑和乙腈的组合物；

    优选地，氧化剂为碘、水、吡啶和四氢呋喃的组合物，且所述碘、所述水、所述吡啶和所述四氢呋喃的用量比为0.02M：(1-2)体积％：(10-30)体积％：(75-85)体积％；以及所述，

    优选地，所述C4’-氟代RNA亚磷酰胺单体的偶合时间为0.5-1小时；

    优选地，将上述固相合成得到的寡聚核苷酸用0.75mL浓度为28重量％的氨水混合0.25mL无水乙醇在55℃下处理10-12h，然后，取出上清液离心浓缩后，加入0.5mL三乙胺三氢氟酸盐处理20-24h，经C18柱脱盐处理后，离心浓缩，采用20重量％的变性聚丙烯凝胶电泳纯化。

    本发明的优点和有益效果是：(1)通过分阶段、选择性保护尿苷中羟基的策略，成功制备了C4′-氟代尿苷亚磷酰胺单体；(2)C4′-氟代尿苷亚磷酰胺单体成功应用于制备C4′-氟代尿苷定点修饰的RNA。本发明所述的C4′-氟代尿苷定点修饰的RNA的制备方法，在研究C4′-氟代RNA的生化性质等方面有着广泛的应用前景。

    附图说明：

    图1为UPLC-MS分析C4′-氟代尿嘧啶核苷修饰RNA分子(7)的纯度。

    具体实施方式

    以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

    4′-C-氟-5′-碘-5′-脱氧尿苷(自制)；二氯甲烷(天津市河东区广达服务部，货号1220)；Na2CO3·10H2O晶体(天津市河东区广达服务部，货号2093)；氯化钠(天津市化学试剂供销公司，货号017)；乙酸酐(天津市化学试剂供销公司，货号282)；吡啶[阿拉丁试剂(上海)有限公司，货号P111511]；四氢呋喃(北京华威锐科化工有限公司,货号HWMT818767)；甲醇(北京百灵威科技有限公司，货号980290-500ML)、55％(w/w)四正丁基氢氧化铵水溶液(北京百灵威科技有限公司，货号16198-50g)；氨水/甲醇(2N)溶液(Alfa，货号H27080)；氨水/甲醇(7N)溶液(Alfa公司，货号H30382)；2-甲基咪唑[梯希爱(上海)化成工业发展有限公司，货号M0508]、N,N-二异丙基乙胺[梯希爱(上海)化成工业发展有限公司，货号D1599]；叔丁基二甲基氯硅烷[梯希爱(上海)化成工业发展有限公司，货号B0995]；硝酸银(安耐吉，货号A01W5100190250)、间氯过氧苯甲酸(安耐吉，货号A01W520002-100g)、2-氰乙基N,N-二异丙基氯亚磷酰胺(安耐吉，货号A07M901005-01)；4-二甲氨基吡啶(Adamas，货号14766B)、4,4”-双甲氧基三苯甲基氯(Adamas，货号55311C)；三氟乙酸(Acros，货号293810250)等原料为市售品。

    实施例1

    C4′-氟代尿嘧啶亚磷酰胺单体的合成。

    其合成步骤如下：

    步骤一、化合物(3)的制备：在氩气保护下，将式(2)对应单体(371.9mg,1mmol,1.0eq.)溶于4mL干燥的四氢呋喃，加入4mL干燥的吡啶和527.5mg(3.5mmol,3.5eq.)叔丁基二甲基氯硅烷，594.5mg(3.5mmol,3.5eq.)硝酸银。室温下搅拌1.5小时。旋干溶剂，加入20mL二氯甲烷稀释，依次用20mL饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液清洗，有机层用无水硫酸镁干燥，用乙酸乙酯/石油醚(梯度，v/v，1:4～1:2～1:1)柱层析，得白色固体式(3)对应单体338.5mg(0.7mmol,两步产率70重量％)。

    1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm)11.52(s,1H,NH),7.69(d,J＝7.87Hz,1H,H-6,＝CH),5.95(s,1H,H-1’),5.71(d,J＝7.55Hz,1H,H-5),5.34(d,J＝8.52Hz,1H,3’-OH),4.42(m,H-3’),4.34(m,H-2’),3.56(m,2H,H-5’,H-5”),0.84(s,9H,tBu),0.05(s,3H,-CH3),0.04(s,3H,-CH3)；13C NMR(100.6MHz,CDCl3)δ(ppm)163.23,149.52,142.57,114.18(d,JH-F＝229.69Hz,1C,C-4’),103.31,97.49,73.22,71.22(d,JC-F＝23.24Hz,1C,C-3’),25.56,17.99,2.29(d,JC-F＝33.48Hz,1C,C-5’),-4.87,-5.22；19F NMR(376MHz,DMSO-d6)δ(ppm)-110.27.m/z:calcd for C15H24FIN2O5Si[M+H]+,487.0561；found,487.0572.

    步骤二、化合物(4)的制备：称取48.5mg(0.1mmol,1.0eq.)式(3)所示的单体溶于1mL干燥的吡啶。在氩气保护下，加入4mg(0.03mmol,0.3eq.)4-二甲氨基吡啶。在冰浴条件(0℃)及搅拌下，将0.05mL(0.5mmol，5.0eq.)乙酸酐缓慢滴加至反应体系，升至室温搅拌1小时。旋干溶剂，加入5mL二氯甲烷稀释，依次用5mL饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液清洗，有机层用无水硫酸镁干燥，旋干溶剂，用乙酸乙酯/石油醚(梯度，v/v，1:8～1:4～1:2)柱层析，得白色固体式(4)对应单体52.1mg(0.098mmol,产率98重量％)。

    1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm)9.87(s,1H,NH),7.30(d,J＝7.96Hz,1H,H-6,＝CH),5.82(m,2H,H-1’and H-5),5.39(d,J＝6.70Hz,JH-F＝14.48Hz,1H,H-3’),4.67(m,H-2’),3.58(dd,1H,J＝7.95Hz),JH-F＝11.16Hz,H-5”),2.17(s,3H,-CH3),0.86(s,9H,tBu),0.01(s,3H,-CH3),0.003(s,3H,-CH3)；13C NMR(100.6MHz,DMSO-d6)δ(ppm)169.8,163.1,149.8,141.3,113.6(d,1C,JC-F＝237.38Hz,C-4’),103.5,94.67,72.3,71.6(d,JC-F＝19.59Hz,1C,C-3’),25.36,20.53,17.78,3.26(d,JC-F＝35.30Hz,1C,C-5’),-4.99,-5.31.m/z:calcd for C17H26FIN2O6Si[M+Na]+,529.0667；found,529.0639.

    步骤三、化合物(5)的制备：在反应容器中，滴加三氟乙酸到496μL(1.86mmol,20eq.)四正丁基氢氧化铵(体积浓度55％)中调pH至4，将49.3mg(0.093mmol,1.0eq.)式(4)对应的单体溶于2mL二氯甲烷，加入至反应体系，分三次加入80mg(0.46mmol,5.0eq.)间氯过氧苯甲酸(间隔30min)，常温搅拌46h。加入2mL饱和硫代硫酸钠水溶液淬灭反应，依次用5mL饱和碳酸氢钠水溶液溶液、5mL饱和氯化钠水溶液清洗，用丙酮/乙酸乙酯/石油醚(v/v/v，1:1:5)柱层析，得白色固体式(5)所对应的单体29.5mg(0.070mmol,产率75.8重量％)。

    1H NMR(400MHz,DMSO)δ(ppm)11.54(s,1H,-NH),7.80(d,J＝8.12Hz,1H,H-6,＝CH),6.01(d,J＝4.33Hz 1H,H-1’),5.75(m,1H,H-5),5.33(dd,J＝5.33Hz,JH-F＝13.37Hz 1H,H-3’),4.58(d,J＝4.41Hz,J＝6.23Hz,1H,H-2’),3.61(m,2H,H-5’,H-5”),2.11(s,3H,OMe),0.81(s,9H,tBu),-0.02(s,3H,-CH3),-0.01(s,3H,-CH3)；13C NMR(100.6MHz,DMSO-d6)δ(ppm)169.72,163.33,150.78,141.15,116.40(d,1C,JH-F＝235.53Hz,C-4’),103.18,91.33,71.79,70.27(d,JC-F＝17.37Hz,1C,C-3’),61.33(d,JC-F＝39.38Hz,1C,C-5’),25.77,20.88,17.99,-4.85,-5.05.m/z:calcd for C17H27FIN2O7Si[M+H]+,419.1650；found,419.1641.

    步骤四、化合物(6)的制备：在氩气保护下，将144.3mg(0.34mmol,1.0eq.)式(5)所对应的单体加入到3mL(7N)的氨/甲醇中，常温搅拌3h。旋干除去溶剂，用乙酸乙酯/石油醚(梯度，v/v，1:4～1:2～1:1)柱层析，将得到Rf＝0.34(丙酮/乙酸乙酯/石油醚＝1:1:4)的组分溶于3mL无水吡啶中，加入11mg(0.09mmol,0.3eq.)4-二甲氨基吡啶、132.1mg(0.4mmol，1.3eq.)二甲氧基三苯甲基，40℃搅拌4小时，1mL甲醇淬灭反应，旋干溶剂，二氯甲烷溶解后饱和碳酸氢钠水溶液清洗，用乙酸乙酯/石油醚(梯度，v/v，1:8～1:4～1:2～1:1，加入0.5体积％的三乙胺)柱层析，得式(6)对应的单体140.5mg(0.204mmol，产率68重量％)。

    1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm)11.56(s,1H,-NH),7.82(d,J＝8.06Hz,1H,H-6,＝CH),7.41-7.26(m,9H,DMTr-ArH),6.92(s,2H,DMTr-ArH),6.90(s,2H,DMTr-ArH),6.00(s,1H,H-1’),5.46(d,J＝8.01Hz,1H,H-5),5.14(d,J＝9.07Hz,1H,-OH),4.61(m,1H,H-3’),4.56(d,J＝6.08Hz,1H,H-2’),3.74(s,6H,-OMe),3.30(m,1H,H-5’),3.22(m,1H,H-5”),0.88(s,9H,tBu),0.11(s,3H,-CH3),0.10(s,3H,-CH3)；13C NMR(100.6MHz,DMSO-d6)δ(ppm)162.94,158.21,150.06,144.23,141.29,134.80,134.68,129.75,127.89,127.63,126.84,116.67(d,JH-F＝229.69Hz,1C,C-4’),113.24,102.05,92.79,86.10,72.92,69.40(d,JC-F＝20.57Hz,1C,C-3’),63.42,54.97,29.98,25.55,-4.87,-5.22。m/z:calcd for C36H43FN2NaO8Si[M+Na]+,701.2670；found,701.2670.

    步骤五、化合物(1)的制备：称取2.16g(3.16mmol,1.0eq.)式(6)所对应的单体，在氩气保护下溶于60mL二氯甲烷中。依次加入4.5mL(31.6mmol,10eq.)N,N’-二异丙基乙胺，1mL(12.64mmol,4eq.)2-甲基咪唑，2.4mL(15.8mmol,5eq.)(2-氰基乙氧基)-N,N’-二异丙基亚磷酰氯，常温下搅拌15分钟。反应结束后，在氩气保护下将体系减压蒸干，然后用少量二氯甲烷溶解，快速柱层析丙酮/乙酸乙酯/石油醚(v/v/v，1:1:5，+0.5体积％三乙胺)纯化得到浅黄色固体式(1)所对应的单体2.686g(3mmol，产率95重量％)。产物有2个异构体，比例为：2.25：1。

    1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)7.81(d,J＝8.07Hz,0.64H,H-6,＝CH),7.66(d,J＝8.12Hz,0.26H,H-6,＝CH)7.26-7.10(m,9H,DMTr-ArH),6.72(s,2H,DMTr-ArH),6.70(s,2H,DMTr-ArH),6.09(s,0.26H,H-1’),5.96(s,0.61H,H-1’)5.07(d,J＝8.01Hz,1H,H-5),4.40(m,1H,H-3’),4.28(m,0.28H,H-2’),4.19(d,J＝4.80Hz 0.63H,H-2’),3.66(s,6H,-OMe),3.46(m,4H),2.52(m,0.68H),2.37(m,1.3H),1.02(m,12H,4CH3),0.89(d,J＝6.60Hz,2H)0.93(s,9H,tBu),0.05-0.00(m,6H,-CH3)；31P NMR(162MHz,CD3Cl)δ:152.2(s,0.27P),149.6(s,0.64P)。m/z:calcd for C45H61FN4O9PSi[M+H]+,879.3929；found,879.3942.

    实施例2

    本实施例在于说明由实施1制备的C4′-氟代尿嘧啶核苷亚磷酰胺单体(1)进行RNA固相合成RNA序列(7)：5′-CCAUXAUAGC。在序列(7)中，X为C4′-氟代尿嘧啶核苷。

    在ABI 394DNA/RNA合成仪上通过常规程序和试剂进行1μmol寡聚核苷酸合成。合成试剂包括Ac-rC,Bz-rA,Ac-rG,rU和实施例1制备的C4’-氟代尿嘧啶亚磷酰胺单体(1)；3重量％三氯乙酸/二氯甲烷用于脱保护；CapA试剂：10体积％乙酸酐/10体积％吡啶/80体积％四氢呋喃(v/v/v)，Cap B试剂：10体积％N-甲基咪唑/90体积％四氢呋喃(v/v)；活化剂：0.25M乙硫基四唑/乙腈；氧化剂：0.02M碘/2体积％水/20体积％吡啶/78体积％四氢呋喃(v/v/v)。C4’-氟代尿嘧啶核苷亚磷酰胺单体的偶合时间是1小时。

    将上述固相合成得到的RNA分子用0.75mL(28重量％)氨水混合0.25mL无水乙醇在55℃下处理12h，然后，取出上清液离心浓缩后，加入0.5mL三乙胺三氢氟酸盐处理24h，经C18柱脱盐处理后，离心浓缩，采用20重量％的变性聚丙烯凝胶电泳纯化。得到纯的RNA(7)经过了UPLC-MS分析鉴定(图1)。

    可见，实施例1制备的C4’-氟代尿嘧啶亚磷酰胺单体(1)可以用于常规的RNA固相合成与纯化。

    以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

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